Hücre İzleme Kullanılarak Oral Aparat Rejenerasyonu Sırasında ve Sonrasında Stentor Motilite Paternlerinin Analizi

Summary

Parlak alan mikroskobu ve hücre takibi kullanılarak yüz mikron ila milimetre büyüklüğünde hücrelerden oluşan bir popülasyonun hareketliliğinin ve davranışının karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, Stentor coeruleus'un kayıp bir oral aparatı yenilerken davranışsal olarak farklı dört aşamadan geçtiğini ortaya koymaktadır.

Abstract

Stentor coeruleus , tek hücreli rejenerasyon çalışmaları için iyi bilinen bir model organizmadır. Bireysel hücrelerin transkriptomik analizi, çoğu oral aparat (OA) ile ilişkili olmayan yüzlerce geni ortaya çıkardı - rejenerasyon süreci boyunca fazlar halinde farklı şekilde düzenlenmiştir. Hücresel kaynakların bu sistemik yeniden düzenlenmesi ve yeni bir OA'nın büyümesine doğru mobilizasyonunun, zaman içinde diferansiyel gen ekspresyonunun fazlarına karşılık gelen hareket ve davranışta gözlemlenebilir değişikliklere yol açacağı varsayılmıştır. Bununla birlikte, S. coeruleus'un morfolojik karmaşıklığı, istatistikleri ve zaman ölçeğini yakalamak için bir tahlilin geliştirilmesini gerektirmiştir. Kısa videolardaki hücreleri izlemek için özel bir komut dosyası kullanıldı ve istatistikler büyük bir popülasyon (N ~ 100) üzerinden derlendi. OA'nın kaybedilmesi üzerine, S. coeruleus başlangıçta yönlendirilmiş hareket yeteneğini kaybeder; daha sonra ~ 4 saatten başlayarak, ~ 8 saate kadar hızda önemli bir düşüş gösterir. Bu tahlil, motiliteli fenotiplerin taranması için yararlı bir araç sağlar ve diğer organizmaların araştırılması için uyarlanabilir.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor), büyük boyutu, çeşitli mikrocerrahi tekniklere dayanma kabiliyeti ve laboratuvar ortamında kültürleme kolaylığı nedeniyle tek hücreli rejenerasyonu incelemek için kullanılan iyi bilinen bir model organizmadır ^1,2,3. Erken rejenerasyon çalışmaları, Stentor'daki en büyük ve morfolojik olarak en belirgin özelliğe odaklanmıştır - OA - tamamen kimyasal şok ^4,5,6 üzerine dökülür. Kayıp bir OA'nın de novo replasmanı, sekiz morfolojik aşamada fonksiyonel bir OA oluşturmadan önce yavaş yavaş hücrenin ön tarafına doğru kayan yeni bir membranllar bandın ortaya çıkmasıyla başlar³. Bu aşamalar, sıcaklıktan bağımsız olarak sırayla gözlemlenmiştir ve neredeyse tüm çalışmalar için evrensel bir referans noktası sağlamaktadır⁵.

Stentor rejenerasyonunun mekanik analizi, rejenerasyonun zamanlamasını ölçmek için kimyasal veya moleküler bir ekranın parçası olarak birden fazla numuneye uygulanabilecek kadar sağlam ve basit araçlar gerektirir. Hücre bazlı bir tahlil yapmak için standart yöntem, bu durumda, rejenerasyon sırasında yeni OA oluşumunu görüntülemektir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme tabanlı analizler, yenileyici yapı belirteçler olarak kullanılabilecek farklı moleküler bileşenler içerdiğinde en etkilidir, böylece bir floresan görüntüsünde kolayca tespit edilebilirler. Stentor OA durumunda, bilinen bileşenler (kirpikler, bazal cisimler) hücre yüzeyinin geri kalanında da bulunur; bu nedenle, AE'nin restorasyonunu tanımak, sadece bir bileşenin varlığını veya yokluğunu arayarak elde edilemez.

Daha ziyade, bir OA'yı tespit etmek için bir çeşit şekil tanıma gerekli olacaktır ve Stentor hücrelerinin sıklıkla hızlı bir kasılma süreci yoluyla şekil değiştirdiği gerçeği göz önüne alındığında, bu potansiyel olarak çok zordur. Bu yazıda, vücudun hareketli aktivitesine ve OA kirpiklerine dayanan rejenerasyon için alternatif bir test sunulmaktadır. OA yenilendikçe, yeni oluşan kirpikler pozisyon ve aktivitede tekrarlanabilir değişikliklere uğrar ve bu da hücrenin yüzme hareketliliğini etkiler. Hareketliliği analiz ederek, yenilenen yapıların işlevini nicelleştirerek rejenerasyonu ölçen "fonksiyonel rejenerasyon" için bir test yapmak mümkündür. Rejenerasyon sırasında Stentor siliyer fonksiyonunun önceki analizi, rejenerasyonun farklı aşamalarında akış modelindeki değişiklikleri gözlemlemek için dış ortama eklenen izleyici boncuklarla birlikte partikül görüntü velosimetrisi kullandı⁷; Bununla birlikte, bu yaklaşım, tek tek hücrelerin ve bunlarla ilişkili akış alanlarının birer birer zahmetli bir şekilde görüntülenmesini gerektirir.

Hücrenin kendisinin hareketini kirpik kaynaklı akış için bir proxy olarak kullanarak, yüksek verimli tarama platformlarıyla uyumlu düşük çözünürlüklü görüntüleme sistemlerini kullanarak daha fazla sayıda hücreyi paralel olarak analiz etmek mümkün olacaktır. Bu tahlil, prensip olarak, yüzlerce mikron ila milimetre boyut ölçeğinde diğer yüzme organizmalarında gelişim ve fonksiyonel rejenerasyonu incelemek için kullanılabilir. Protokolün 1. Bölümü, bir hücre popülasyonunun tüm güne kadar yüksek verimli görüntülenmesini sağlayan çok kuyulu bir örnek slaytının yapımını açıklamaktadır. Diğer hücre türleriyle kullanım için nasıl ayarlanacağına ilişkin ayrıntılar sağlanmıştır. Protokolün 2. Bölümü, dijital tek lensli refleks kamera ile diseksiyon mikroskobunda gerçekleştirilebilen bu test için video verilerinin elde edilmesini kapsamaktadır. Protokolün 3. Bölümü, MATLAB kodunu (Ek Bilgiler) kullanarak hücre izleme ve hücre hızı hesaplaması hakkında bir kılavuz sağlar. Protokolün 4. Bölümü, sonuçların kolay yorumlanması için sayısal sonuçların Şekil 1C-F ve Şekil 2C'de gösterildiği gibi grafiklere nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır.

Protocol

NOT: Yaklaşık yüz S. coeruleus hücresinden oluşan bir popülasyon, daha önce yayınlanmış bir JoVE protokolü^8'e uygun olarak kültürlenmiştir.

1. Numune hazırlama

1. 250 μm kalınlığında silikon ara parça levha (Malzeme Tablosu) parçasını mikroskop slaytından hem yükseklik hem de genişlik açısından biraz daha küçük kesin. 5/16" delik delme kullanarak dairesel kuyucuklar oluşturun. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için komşu kuyular arasında yeterli boşluk bırakmaya dikkat edin.
   NOT: Komşu kuyular arasında 3 mm'lik bir boşluk yeterli bulunmuştur. Uygulamayla, tek bir örnek slayta on kuyucuk yerleştirilebilir.
2. Hücreleri 2 dakika boyunca% 10 sakkaroz veya% 2 üre içinde inkübe ederek OA'nın rejenerasyonunu başlatın (Şekil 1A). Ardından, taze ortam⁸ ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa yaklaşık on Stentor'u nazikçe pipetleyin. Numune hacmini kuyu hacmiyle mümkün olduğunca yakından eşleştirmeye dikkat edin.
   NOT: Burada kullanılan kuyu boyutları için, her bir kuyucuğa 12,5 μL numune pipetlenmiştir.
3. Bir kenardan başlayarak kuyucukların üzerine bir parça kapak camını (bkz. Malzeme Tablosu) yavaşça indirerek kuyuları kapatın. 10 μL pipet ucu gibi dar ve hafif esnek bir nesne kullanarak silikon tabakaya temas ettiği kapak camına bastırarak iyi bir sızdırmazlık sağlayın.

2. Görünür ışık mikroskobu hızlandırılmış

1. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve büyütmeyi mevcut en düşük seviyeye ayarlayın, böylece bir tanesi çerçeveye tamamen sığar.
   NOT: Bu protokol için mikroskopta 1.6x kamera adaptörü ve objektif üzerinde 1x büyütme kullanılmıştır.
2. Hızlandırılmış olarak başlayın. Her zaman noktasında her kuyucuğun saniyede 30 karesinde 10 saniyelik bir video elde edin. Motorlu bir X-Y aşamasına sahip bir mikroskop kurulumu kullanıyorsanız, tüm hızlandırılmış çekimi otomatikleştirin. Aksi takdirde, her bir kuyu boşluğunu kaydetmek üzere örneği el ile çevirmek için her zaman noktasında bir kullanıcının bulunduğundan emin olun.
   NOT: Isınmayı ve buharlaşmayı önlemek için görüntüleme yapmadığınız zamanlarda numuneyi ışıklı bırakmaktan kaçının. Numune hacimleri küçüktür ve buharlaşma hava kabarcıklarına yol açacaktır.
3. Filmleri TIFF, MOV veya AVI olarak kaydedin.
   NOT: Bunlar, tescilli olmayan en yaygın video dosyası türleridir. Belirli mikroskop yazılımına bağlı olarak, videolar varsayılan olarak özel bir dosya türüne kaydedilebilir, ancak daha sonra yukarıda belirtilen dosya türlerinden birine aktarılabilir.
4. Fiziksel ölçek için pikselden milimetreye dönüştürme faktörü kullanın ve bir kalibrasyon gerçekleştirin veya kullanılan kameradan bilinen piksel boyutunu kullanın. Kalibre etmek için, videolarla aynı büyütme ayarlarında kalibrasyon slaytının veya net bir cetvelin net bir görüntüsünü elde edin. Herhangi bir görüntü görüntüleme programını kullanarak, bilinen bir fiziksel mesafenin işaretleri arasındaki piksel sayısını sayın.
   NOT: Örneğin, bir cetvelin görüntüsünde 100 piksel ile ayrılacak 1 mm işareti ve 2 mm işareti gösteriliyorsa, dönüşüm faktörü 100 piksel başına 1 mm'dir. Alternatif olarak, bu faktörü kamera piksel boyutundan türetmek için, kamera piksel boyutunu büyütme ile çarpmanız yeterlidir. Örneğin, kullanılan fotoğraf makinesinde 3,45 μm piksel varsa ve kullanılan büyütme 1,6x ise, dönüşüm 1 piksel başına 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm'dir.

3. Hücre izleme

1. İki komut dosyasını, TrackCells.m ve CleanTraces.m'yi, bilgisayarda hatırlanması kolay bir konuma indirin. Veri videoları zaten bu bilgisayarda değilse, bunları bu bilgisayara aktarın.
   NOT: Veri videolarının ve komut dosyalarının aynı klasörde olması gerekmez.
2. Veri videolarını, her zaman noktası için bir tane olmak üzere klasörler halinde düzenleyin. Veri videolarında otomatik hücre izleme gerçekleştirmek için önce TrackCells.m komut dosyasını kullanın. TrackCells.m dosyasını açın ve komut dosyasını çalıştırın.
3. Bir açılır pencere tarafından istenirse Yola Ekle'yi seçin., bu genellikle yalnızca komut dosyası belirli bir klasörden ilk kez çalıştırıldığında gerçekleşir. İstendiğinde, İzlemeyi Başlatmak için Bir veya Daha Fazla Veri Videosu Seçin, veri videolarına gidin (bölüm 2). Shift tuşunu basılı tutarak tıklatın, Control tuşunu basılı tutarak veya vurgulamak için dosyaların üzerine gelirken farenin sol düğmesini basılı tutarak birden fazla video dosyası seçin.
4. İstem penceresinin altındaki Dosya adı: kutusundaki dosya listesinden memnun kaldığınızda, Aç'a tıklayın. Tüm parametrelerin doğru ayarlandığını onaylamak için önce bir videoda test çalışması yapın (aşağıdaki tartışmaya bakın).
   NOT: Bu komut dosyası artık seçilen her video dosyası için bir klasör oluşturacaktır. Daha sonra videonun her karesini bir .jpg dosyası ve videoda bulunan tüm izleri içeren position_estimates.mat adlı bir dosya olarak bu klasöre yazar. Videoların boyutuna, video sayısına ve bilgisayarın hızına bağlı olarak, bu komut dosyasının çalışması saatler sürebilir.

4. İzleme doğrulaması

1. Devam etmeden önce hata iletisi olup olmadığını denetleyerek bölüm 3'te açıklanan adımların doğru şekilde izlendiğini doğrulayın. Anormal veya yanlış izlemeleri el ile reddetmek için CleanTraces.m komut dosyasını kullanın. CleanTraces.m dosyasını MATLAB düzenleyicisi penceresinde dosyaya çift tıklayarak açın.
2. İstemde TrackCells.m tarafından veri klasörü çıktısını seçin. Video dosyasıyla aynı ada sahip olacak, bölüm 3'te açıklandığı gibi oluşturulan klasörlerden birine gidin. Yalnızca bir klasör seçin.
   NOT: Bu komut dosyası artık izlemeleri bir açılır pencerede tek tek görüntüleyecektir. İzin başladığı video karesine yeşil renkte ve videonun izinin bittiği kareye eflatun olarak yerleştirilirler. Bu nedenle, geçerli bir iz yeşil bir hücreyi ve bir macenta hücresini birbirine bağlamalıdır.
3. İstendiğinde, izlemeyi korumak için 1 ve izlemeyi reddetmek için 0 girin. Sonraki izlemeye geçmek için Enter tuşuna basın.
   NOT: Yeni izlemeler, daha fazla iz kalmayana veya ilk altmış tanesi gösterilene kadar görüntülenmeye devam eder. Bu işlem tamamlandığında, komut dosyası çıktıları kaydetmek için otomatik olarak CLEAN TRACES adlı bir klasör oluşturur ve kalan tüm izlemeleri videonun ilk karesinin üstünde görüntüler (Şekil 1B). Bu görüntü, ileride başvurmak üzere otomatik olarak LabeledTraces.png olarak kaydedilir. Kullanıcının tutmayı seçtiği tüm izler clean_traces.mat dosyasına kaydedilir.
4. Devam etmeden önce tüm videolar için bu adımı tek bir zaman noktasında tamamlayın.
   NOT: Bu makaledeki veriler için, her zaman noktasında her kuyu için bir video, zaman noktası başına toplam on video elde edilmiştir.

5. Veri görselleştirme

NOT: Tüm hücre popülasyonunun farklı zaman noktalarındaki hareketliliğini görsel olarak karşılaştırmak için, bölüm 4'teki tüm izler orijinde başlayacak ve her zaman noktası için bir radyal yer değiştirmeye karşı zaman grafiği oluşturacak şekilde çevrilmiştir (Şekil 1C-F, tüm zaman noktaları için Ek Şekil S1'e bakınız).

1. SpaghettiPlots.m adlı komut dosyasını indirerek başlayın. Komut dosyasını açın ve çalıştırın. Grafiğin kuyu verilerini (clean_traces.mat) içeren zaman klasörünü seçin istemiyle bir pencere dosyası tarayıcı penceresi açıldığında, zaman noktalarından birinin klasörüne gidin. Bu klasörün içinde analiz edilen videoların her biri için bir klasör içermesi gerektiğini unutmayın.
2. Kalibrasyon: Milimetre başına piksel sayısı nedir?" sorusu sorulduğunda, adım 2.4'te bulunan kalibrasyon değerini yazın ve Enter tuşuna basın.
   NOT: Komut dosyası artık şu anda analiz edilen tüm videolardaki izleri tek bir grafikte birleştirecektir (Şekil 1C-F). Grafikteki soluk noktalı daireler, 1, 2, 3 ve 4 mm'lik radyal yer değiştirmeleri gösterir.
3. Varsayılan olarak, 4 mm'ye kadar bir yarıçap eklemek için rr = 4 olarak ayarlanan komut dosyasının 55. satırını değiştirerek grafiğin eksenlerini gerektiği gibi ayarlayın. Grafiği kaydedin.

Representative Results

Bu tahlilin amacı, hareket kalıplarının kademeli değişimini ve büyük (N ~ 100) rejenere Stentor popülasyonundaki hücrelerden hareket hızındaki aşamalı artışı ölçmektir. Sonuçların yorumlanmasına yardımcı olmak için, bu protokolde yer alan özel kod iki tür çizim oluşturur: bir dizi video verisindeki tüm hücre hareketi izlerinin bir bindirmesi (Şekil 1C-F ve Şekil S1) ve rejenerasyonun başlamasından bu yana saate göre yüzme hızının bir grafiği (Şekil 2C). Normal olarak yenilenen bir Stentor popülasyonu, yönsüz yüzmeden yönlendirilmiş yüzmeye istikrarlı bir geçiş göstermelidir (Şekil 1G). Her hücre, ~ 8 saate yayılan OA rejenerasyon süreci sırasında bu geçişi tam olarak geçirirken, bireyler arasındaki varyasyon, eğilimlerin netleşmesi için büyük bir popülasyonun hareketine toplu olarak bakmayı gerektirir.

Şekil 1C-F, aynı Stentor hücresi popülasyonunun OA rejenerasyon sürecine 2, 3, 7 ve 8 saatte kolektif hareketliliğini göstermektedir. Bu grafikler hem hareketli bireylerin sayısında beklenen artışı (görünür izlerin sayısı) hem de popülasyondaki en hareketli hücrelerin aralığındaki dört kat artışı (radyal yer değiştirme) göstermektedir. Eksenlerin, Şekil 1C-F'nin farklı panelleri arasında farklı olduğunu, hareketi sergilemek için en uygun olarak 1 mm (Saat 2), 2 mm (Saat 3 ve 7) ve 4 mm (Saat 8) seçildiğini belirtmek önemlidir. 2 saatte (en erken zaman noktası) hiçbir hücre 10 s video sırasında 1 mm'den fazla hareket etmezken, 9 saatte birçok hücre aynı süre boyunca 5 mm'den fazla hareket etti. Ek Şekil S1, başarılı bir deneyde beklenen hareketlilik artışının daha net bir görünümünü vermek için tüm grafiklerde kullanılan aynı eksenlerle tam zaman atlamalı olarak bu grafikleri sağlar.

Bu örnek arsa serisinin yorumlanmasında bir uyarı var. En hızlı yüzen hücreler, özellikle (şans eseri) kenara yakın başlamışlarsa, videodaki kuyu boyunca yüzebildiler; böylece tamamen düz bir çizgide yüzmeleri kısıtlanır ve bu şekilde görselleştirildiği gibi hareket aralıkları daha küçük görünecektir. Bu, hücreler tarafından kat edilen mesafeyi ölçmeye yönelik herhangi bir girişimi zorlaştırırken, hareket aralığının en az 8 saat boyunca arttığı niteliksel eğilimi değiştirmez. Bu, bilinen morfolojik rejenerasyon zaman çizelgesi ile tutarlıdır (Şekil 2A)³.

Popülasyon istatistiklerini derlemek için, izlenen hücreler üç ayrı kategoriye ayrıldı: görünür holdfast olmadan hareketli olmayan, görünür holdfast ile hareketli olmayan ve hareketli. Bu davranış kategorileri daha önce Tartar tarafından tanımlanmıştı, ancak zaman içindeki yaygınlıkları için hiçbir zaman ölçülmemişti³. Şekil 2B, bu kategorilerdeki göreli hücre sayılarını, yenilenmeye kadar geçen saatlerin bir fonksiyonu olarak özetleyen yığılmış bir histogramı göstermektedir. Tüm zaman noktalarında, hücre popülasyonunun yarısından fazlası gözlemlenebilir derecede hareketli değildi. Ek olarak, daha sonraki zamanlarda, hücrelerin önemli bir kısmı, görünür tutunaklı kolonilerde bulundu, bu da çevreyi araştırdıklarını ve tercihen kendi türlerinden başkalarının yanına bağlandıklarını güçlü bir şekilde düşündürdü. Bunun bir örneği Şekil 2C'nin son girişinde görülebilir.

Bu tahlil, hareketlilik iyileşmesinin her aşamasında yüzme hızlarının istatistiksel olarak karşılaştırılmasına izin verir. Şekil 2C'de sunulan veriler için ortalama ve standart sapma aşağıda özetlenmiştir (Tablo 1). Bu istatistiksel miktarlar hücre izleme ile çıkarıldıktan sonra, farklı fazlardaki hücre popülasyonu tarafından sergilenen hareket, eşleşmemiş t-testi kullanılarak titizlikle karşılaştırılabilir. Somut bir örnek olarak, gösterilen veriler için, Faz 1 ve Faz 2'deki yüzme hızlarını karşılaştıran t-istatistiği şu şekilde hesaplanır:

burada x 1 ve x 2, sırasıyla Faz ₁ ve ₂ sırasındaki ortalama hızı gösterir; s 1 ve s 2, sırasıyla Faz ₁ ve ₂ sırasında hızın standart sapmalarını gösterir; n 1 ve n 2 ve sırasıyla Faz ₁ ve ₂ sırasında çıkarılan izlerin sayısını gösterir. Elde edilen t-istatistiği t₁₂ daha sonra hipotez testi için bir p-değerine çevrilebilir. Şekil 2C'de gösterilen veriler için, Faz 1'den Faz 2'ye (p <% 0.1) ve Faz 2'den Faz 3'e (p <% 0.1) geçişler istatistiksel olarak anlamlı iken, Faz 3'ten Faz 4'e geçiş (p >% 20) değildir. Ham videolarda görüldüğü gibi, hücrelerin Faz 4 sırasında küçük kolonilere yerleşme eğiliminin (Şekil 2B, giriş), yalnızca yüzme hızlarının ölçülmesiyle iyi yakalanmayan davranışsal farklılıkların bir örneği olduğunu belirtmek önemlidir. Bu, Faz 4 (0.26 mm / s) sırasında ölçülen büyük standart sapmayı açıklar ve bu da Faz 3 ile karşılaştırıldığında daha düşük bir t-istatistiğine katkıda bulunur.

Şekil 1: Hücre takibi, yönlendirilmiş yüzmenin kademeli olarak iyileştiğini ortaya koymaktadır. (A) Sakkaroz şoku, Stentor coeruleus'u membranllar bandı dökmeye teşvik eder. (B) Kuyudaki hava kabarcıklarını gösteren çizgili dairelerle 10 saniyelik bir videodaki hücrelerin yenilenmesinin örnek izleme sonucu. (C-F) Tüm yörüngelerin 2 saat, 3 saat, 7 saat ve 8 saatte bindirilmesi. Zamanlar, verilerin derlenmesi sırasında en yakın saate yuvarlandı. Noktalı daireler, bir milimetrelik radyal yer değiştirmeleri gösterir. (G) Hücre hareketliliği, kısa dairesel yörüngelerle karakterize edilen yönsüz yüzmeden, uzun sinüzoidal yörüngelerle karakterize edilen yönlendirilmiş yüzmeye doğru gelişir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hareketli alt popülasyon, OA rejenerasyonu yoluyla davranışın dört farklı aşamasını göstermektedir . (A) Stentor rejenerasyonunun morfolojisi. (B) Her seferinde (mavi) hareketli olmayan, görünür bir bekletme olmaksızın normalleştirilmiş hücre sayımları; (turuncu) hareketli değil, görünür tutma ile; (yeşil) hareketli. Bu rakam için farklı saat alt kümelerine yayılan birden çok veri kümesi birleştirildi, bu nedenle saat başına toplam hücre sayısı 57 ile 376 arasında değişiyordu. Gösterge, her kategorinin altındaki temsili hücreleri, eflatun ve yeşil renkte, yanlış renkle görselleştirildiği gibi gösterir. (C) Yüzme hızının boks grafiği; kutuları her seferinde Q1'den Q3 çeyrek değerlerine kadar uzanır ve medyan değer yeşil renkle gösterilir. Saçılma kaplamaları, her hareketli hücrenin ortalama hızıdır. Inset, dört aşamanın her birinde temsili popülasyon davranışını gösterir. Kısaltmalar: OA = oral aparat; Q1 = ilk çeyrek; Q3 = üçüncü çeyrek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir fenotip tarama aracı olarak motilite analizi çok sayıda hücre gerektirir . (A, B) 12 saatte iki kuyudan elde edilen sonuçların izlenmesi. (C, D) Aynı iki kuyudan elde edilen sonuçların 18 saatte izlenmesi. Stentor hücreleri, kümelere bağlanmayı tercih eder, bazı kuyular diğerlerinden saatler önce kolonilere yerleşir. Çizgili alanlar kuyudaki hava kabarcıklarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

	Ortalama (mm/s)	Standart Sapma (mm/s)
1. Aşama	0.14	0.24
2. Aşama	0.06	0.13
3. Aşama	0.16	0.16
4. Aşama	0.15	0.26

Tablo 1: Hareketlilik iyileşmesinin her aşamasında yüzme hızlarının karşılaştırılması.

Ek Şekil S1: Rejenerasyon ve ötesi yoluyla popülasyon yüzme kalıpları. (A-M) Stentor coeruleus hücrelerinin hareketi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 ve 18 saat, oral aparat rejenerasyonunun başlamasından sonra. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Videolar 1-3: Komut dosyası hata ayıklaması için S. coeruleus'un örnek mikroskopi videoları. Protokolün 5. Bölümü, komut dosyalarının doğru çalıştığına dair hızlı bir onay için bu üç veri videosu kümesinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu videolar veri videoları için kontrast ve çözünürlük gereksinimlerine somut bir örnek sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosyalar: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Birçok parçacık ve hücre izleme algoritması şu anda mevcuttur, bazıları tamamen ücretsizdir. Maliyet ve kullanım kolaylığı genellikle ödün vermeyi gerektiren ödünleşimlerdir. Ek olarak, mevcut hücre izleme programlarının çoğu, yüzerken dönen ve ani yön değişikliklerine uğrayabilen Stentor'un hızlı yüzme hareketi yerine, doku kültürü hücrelerinin yavaş sürünen hareketini izlemek için tasarlanmıştır. Bu seçeneklerin çoğunu test ettikten sonra, burada sunulan protokolün, yalnızca düşük maliyetli ekipman ve tek bir bilimsel yazılım paketi (Malzeme Tablosu) kullanarak veri toplamadan veri görselleştirmeye kadar giden tek elden bir çözüm olması amaçlanmıştır. Bu, öğrencilerin kendi sorularını sormaları ve kısa bir süre içinde nicel sonuçlara ulaşmaları için engeli azalttığından, öğretim odaklı kurumlardaki araştırma laboratuvarları veya gerekli ekipmanların çoğunun zaten mevcut olduğu biyofizik öğretim laboratuvarları için özellikle ilgi çekicidir.

Bu makalede sunulan yöntem, yüz mikron ila milimetre boyut ölçeğindeki bir organizma popülasyonunun hareketliliğini nicel olarak karakterize etmek için uyarlanabilir. Daha küçük veya daha büyük organizmalara uygulama, video verilerinin nasıl elde edilmesi gerektiği konusunda değişiklikler gerektirecektir. Burada yenilenen bir S. coeruleus popülasyonuna uygulandığı gibi, bu protokol, hücre popülasyonu boyunca hareketliliğin işlevsel olarak iyileşmesi için bir zaman çizelgesi verdi ve bu da transkripsiyonel zaman çizelgesi hakkında şu anda bilinenleri tamamlıyor. Örneğin, RNA dizilemesinden, siliyer motilite proteinlerini kodlayan genlerin sentezinin, kirpiklerin kendilerinin oluşumundan çok sonra, rejenerasyon sürecine birkaç saat kadar gerçekleşmediği bilinmektedir ^9,10. Yukarıda gösterilen 0-3 saatten (Faz 1) saat 4'e (Faz 2) hareketlilikteki istatistiksel olarak anlamlı düşüş, siliyer montajda yer alan genlerin ekspresyonuna kıyasla siliyer motilite faktörlerinin ekspresyonundaki bu gecikme ile tutarlıdır. Bugüne kadar Stentor rejenerasyonunun hiçbir transkriptomik çalışması dokuz saatin ötesinde yapılmamıştır, bu nedenle genomik aktivite hakkında çok az şey bilinmektedir. Saat 8-10 (Faz 3) ve saat 11+ (Faz 4) arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farkın olmaması, hücrelerin bu zamana kadar tamamen yenilendiğini ve hücre hareketliliği ile ilgili az sayıda genin 9. saatin ötesinde farklı şekilde düzenlenmesi gerektiğini göstermektedir.

Bu yöntemin iki ana sınırlaması, kümelenmiş ve / veya dokunan hücreleri izleyememesi ve hareketin yüzme hızlarından veya yörüngelerinden daha karmaşık yönlerini ölçememesidir. Tüm parçacık/hücre izleme algoritmaları, başka bir hücre tarafından geçici olarak görsel olarak engellenen hücreleri takip etmekte zorlanır ve birden fazla hücre yakın mesafede birden fazla kare harcadığında; burada yer alan komut dosyası bir istisna değildir. Neyse ki, birincisinin sıklığı, bir sonraki paragrafta tartışıldığı gibi, bir tanesinin içine yerleştirilen hücre sayısını sınırlayarak etkili bir şekilde azaltılabilir. Özellikle burada incelenen S. coeruleus popülasyonu için, kolonilere yerleşmeyi tercih etmeleri (Şekil 3), bu hücrelerin bazılarının senaryo tarafından tanımlanmamasına neden olmuştur. Bununla birlikte, tüm bu hücreler çok az hareket gösterdiğinden veya hiç hareket göstermediğinden, hareketli hücre popülasyonu hakkındaki istatistikler etkilenmez. Ek olarak, birden fazla hücrenin izlemeden kaçındığı videoların tanımlanması kolaydır ve manuel olarak daha fazla analizden hariç tutulur. Hareketin karmaşık yönlerinin nicelleştirilmesi ile ilgili olarak, Ek Şekil S1'de görülen yönsüzden yönlendirilmiş yüzmeye geçiş, yönün, ortalama ivmenin ve potansiyel olarak diğer ölçülebilirliklerin zaman korelasyonunda nicel değişiklikler olduğunu göstermektedir. Bu protokolde analiz edilen tek miktar olan hız ve aralık, hareketin yalnızca küçük bir yönünü temsil eder.

Son olarak, protokolün birkaç bölümü pratik kullanımda özel bir öneme veya sonuca sahiptir. Çok kuyulu numune slaytlarının protokol bölümü 1'de açıklandığı gibi ince silikon levhalarla montajı pratik gerektirir. Numuneyi kapak camı ile kapatırken sızıntıları veya hava kabarcıklarını en az bir kuyuya sokmak kolaydır. Kuyular, işlemi kolaylaştıracak (ve hataları daha az maliyetli) hale getirecek daha küçük kapak camının kullanılmasına izin vermek için birden fazla numune slaytına bölünebilir. Burada sunulan tahlil, bir hücre popülasyonunun hareketlilik modellerini tek bir zaman noktasında karakterize etmek için kullanılabilse de, burada tek bir popülasyonun hareketlilik modellerini uzun bir zaman atlamalı (10 saatin üzerinde) karşılaştırmak için bir araç olarak gösterilmiştir. Herhangi bir uzun süreli çekimde olduğu gibi, ıslak bir numunenin buharlaşması kaçınılmazdır. Evaporasyon, görüntüleme odasındaki silikon ara parçanın hem cam kızağa hem de kapak kaymasına güvenli bir şekilde kapatılmasıyla en aza indirilebilir. Bunun yapılmaması, kuyuların birbirine sızmasına veya kuyuların içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olacaktır. Silikon ara parçaların kullanımına aşina olmayan araştırmacılar için, pastörize kaynak suyu veya diğer temiz ortamlar, kullanımdan önce sızıntıyı test etmek için her bir kuyucuğa pipetlenmelidir. Örnek kuyucukların boyutları, yaklaşık 1 mm büyüklüğündeki S. coeruleus için iyi çalışacak şekilde seçilmiştir. Bu, silikon ara parça kalınlığını (incelenen S. coeruleus hücrelerini iki boyutlu bir düzlemle sınırlamak için seçilmiş), 5/16 "çap ve kuyu başına 10 hücreyi içerir. Bu protokol diğer hücre tipleri için uyarlanırken bu sayılar ayarlanmalıdır.

TrackCells.m komut dosyasındaki çeşitli parametreler, otomatik hücre tanımlama ve izleme doğrulamasını optimize etmek için ayarlanabilir. MinCellArea ve MaxCellArea parametreleri (komut dosyasının 15. ve 16. satırları), kullanıcının bir hücre için kabul edilebilir boyut aralığını kare piksel cinsinden ayarlamasına olanak tanır. Hangi değerlerin en iyi olduğu, hücre boyutu, kamera piksel boyutu, büyütme ve hava kabarcıkları gibi hücreler olarak yanlış tanımlanabilecek nesnelerin olup olmadığı dahil olmak üzere deneyin birçok ayrıntısına bağlıdır. Varsayılan 300 ve 1500 değerleri, protokolde sağlanan tam ekipman ve ayarlar için en uygunuydu. MinCellArea ve MaxCellArea optimize edildikten sonra, görüntü kontrastını değiştirmek için Threshold parametresini (Satır 17) ayarlayın. Yanlış ayarlandığında, hücre anahatları kötü tanımlanacak veya tamamen gözden kaçırılacak, böylece doğru izleme engellenecektir. Doğru izleme için hiçbir Eşik değeri iyi çalışmıyorsa daha yüksek kontrastlı veya daha fazla odaklanmış bir video deneyin. Senaryonun 218. satırı, bad_trks = bul(strk_trks > 20); tahmin edilen hareketten (Kalman filtresi aracılığıyla) çok fazla sapan izlerin atılmasından sorumludur. Olduğu gibi, komut dosyası 20'de ayarlanmış çok fazla kişi için bu eşiğe sahiptir. İzleri daha agresif bir şekilde atmak için bu tamsayı değerini 1'e kadar düşürün. Daha az agresif bir şekilde atmak için değeri artırın. TrackCells.m'nin çoğu, okuyucunun daha fazla ayrıntı için başvurabileceği http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html'de serbestçe erişilebilen çok nesneli izleme öğreticisinden benimsenmiştir. Ek Videolar 1-3, komut dosyalarının test çalışması için örnek veri videolarıdır.

S. coeruleus'un kayıp bir AE'yi tamamen yeniden üretme yeteneği ilk olarak bir asırdan fazla bir süre önce gözlemlenmiştir, ancak hareketlilik ve davranışsal durumların iyileşmesi ile ilgili birçok açık soru devam etmektedir. Burada sunulan protokol, parlak alan görüntüleme, otomatik hücre tanımlama ve izleme ve yazarların yenileyici bir Stentor popülasyonunun hareketliliğini nicel olarak karakterize etmek için kullandıkları veri görselleştirme kombinasyonunun gizemini çözmeyi amaçlamaktadır. Bu iş akışı, genel olarak hareketliliğin araştırılması için geniş çapta uygulanabilir ve dahil edilen komut dosyaları ve protokol, benzer boyut ve hızdaki diğer biyolojik sistemlerle, örneğin Paramecium ve Blepharisma gibi diğer siliatlarla çalışmak üzere kolayca benimsenebilir. Ayrıca, görüntüleme odasını değiştirmek (örneğin, farklı görüntüleme büyütme ile birlikte kuru kuyucuklar veya farklı boyuttaki kuyucuklar kullanmak) bu iş akışının uygulanabilirliğini büyük ölçüde genişletir. Stentor için mevcut alet kiti cerrahi diseksiyon, ozmotik şok, RNAi, DNA / RNA analizi ve küçük molekül inhibitörlerini içerir⁶. Burada sunulan motiliteyi ölçmek için yüksek verimli yöntem, tamamlayıcı bir karakterizasyon derecesi ekler ve gelecekteki çalışmalarda motilitenin fenotiplerini araştırmak için kullanılacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m