Burada, mikromakine mikroakışkan bir platform kullanarak üç boyutlu basitleştirilmiş ve farklılaşmamış bir cilt modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Paralel akış yaklaşımı, hepsi şırınna pompaları tarafından kontrol edilen, üstteki epitel hücrelerinin tohumlaması için bir dermal bölmenin yerinde birikmesini sağlar.
Bu çalışma, karmaşık çok katmanlı dokular üretme potansiyeline sahip yeni, uygun maliyetli ve güvenilir bir mikroakışkan platform sunar. Bir kavram kanıtı olarak, dermal (stromal) ve epidermal (epitel) bölme içeren basitleştirilmiş ve farklılaşmamış bir insan derisi modellenmiştir. Bunu başarmak için, pahalı ve özel ekipmanların kullanımı veya küçük hidrofobik moleküllerin ve proteinlerin emilimi gibi biyomedikal uygulamalar için polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı mikroakışkan cihazlarda bulunan bazı dezavantajların üstesinden gelen, iki lüse bölünmüş çok yönlü ve sağlam, vinil tabanlı bir cihaz geliştirilmiştir. Ayrıca, paralel akışa dayalı, hem dermal hem de epidermal bölmelerin yerinde birikmesini sağlayan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Cilt yapısı, insan birincil fibroblastlarını içeren bir fibrin matrisi ve daha sonra dinamik kültür koşullarında sürdürülen, üzerine tohumlanmış ölümsüzleştirilmiş keratinositlerden oluşan bir monolayerden oluşur. Bu yeni mikroakışkan platform, insan cilt hastalıklarını modelleme ve diğer karmaşık dokuları üretme yöntemini tahmin etme imkanını açar.
Son zamanlarda, kozmetik ve farmasötik ürünlerin toksisitesinin analizi için in vitro insan derisi modellerinin geliştirilmesi ve üretimine yönelik ilerlemeler yapılmıştır1. İlaç ve cilt bakım endüstrilerindeki araştırmacılar, ürünlerini test etmek için en yaygın olan fareler olan hayvanları kullanıyorlar2,3,4,5. Bununla birlikte, ürünleri hayvanlar üzerinde test etmek, insanlarda sıklıkla ilaç yetmezliğine veya olumsuz etkilere ve dolayısıyla ekonomik kayıplara yol açan insanlardaki yanıtın her zaman tahmin edici değildir5,6. İngiltere, 1998 yılında kozmetik testler için hayvanların kullanılmasını yasaklayan ilk ülke oldu. Daha sonra, 2013 yılında AB, hayvanlarda kozmetiklerin testini ve tahsisini yasakladı (1223/2009 sayılı AB Kozmetik Yönetmeliği)7.
Bu yasak, ABD’deki ‘İnsani Kozmetik Yasası’ gibi diğer ülkeler tarafından da değerlendiriliyor8. Etik kaygılara ek olarak, hayvan ve insan derisi arasındaki anatomik farklılıklar, hayvan testini zaman alıcı, pahalı ve genellikle etkisiz hale getirir. Ayrıca, küresel in vitro toksikoloji test pazarı büyüklüğünün 2025 yılına kadar 26,98 milyar ABD dolarına ulaşması beklenmektedir9. Bu nedenlerden dolayı, biyomühendis insan derisi modelleri gibi kozmetik ve ilaçların güvenliği ve toksik etkileri için hayvan kullanmadan test edilmesini sağlayan in vitro çalışmalar için yeni yöntemler ve alternatifler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Ticari olarak mevcut iki farklı tür vardır, in vitro, insan cilt modelleri. İlk tip, farklı malzemelere tohumlanan birden fazla farklılaşan keratinosit katmanı içeren katmanlı epidermal eşdeğerlerden oluşur. Bazıları Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) tarafından onaylanmış ve EpiDerm veya SkinEthic10 , 11,12gibi cilt korozyonu ve tahriş testi için (Avrupa Alternatif Yöntemleri Doğrulama Merkezi (EKVAM) tarafından onaylanmıştır. İkinci tip, T-Skin ve EpiDerm-FT gibi fibroblastlar içeren üç boyutlu (3D) bir iskelede tohumlanmış farklılaşan insan keratinositleri tabakasına sahip tam cilt eşdeğerleridir. Bununla birlikte, bu modeller statik koşullar altında kültürlenir, bu da onları insan fizyolojik koşullarını doğru bir şekilde temsil edemez hale getirir.
Son ilgi dinamik perfüzyon 13 ,14 , 15 , 16 , 17,18,19 ile hücre kültürü kesici uç(CCI)formatlarında in vitro 3Dcilt modelleri üretmeye odaklanmıştır. Ancak bu sistemler alandaki klasik tanımlarına göre mikroakışkan cilt-on-chips olarak stricto sensu olarak kabul edilemez. Ingber’in çip üzerindeki organlar için tanımı, organın mikroakışkan kanalların içine yerleştirilmesi gerektiğini belirtir, bu da sadece birkaç cihazın20,21‘ i yerine getirmesi gereken bir durumdur. Cilt-on-chips şimdiye kadar tek hücreli katmanlar ve / veya dermal hücre katmanları gözenekli bir membran ile ayrılmış olarak çoğunlukla basit epitel modellenmiştir22,23. Mikroakışkan sistemlerde deri modellemede bazı gelişmeler olmasına rağmen16,24, şu anda Ingber’in tanımına uyan, çok katmanlı bir cilt in situ üretebilen ve hem epitel hem de stromal bileşenleri içeren bir çip üzerinde organ sistemini gösteren bir literatür yoktur.
Bu çalışmada çip üzerinde cilt uygulamaları için yeni, uygun maliyetli, sağlam, vinil bazlı mikroakışkan bir platform sunulmaktadır. Bu platform, imalat sürecinde daha basitlik sağlayan mikro işlemenin yanı sıra cihazın düzeninde daha fazla esneklik ve çok yönlülük sağlayarak PDMS25’inbazı sınırlamalarını aşarak üretildi. Şırındi pompaları ile kontrol edilen paralel bir akış yoluyla basitleştirilmiş bir cilt yapısı sunmanın bir yolu da tasarlanmıştır. Paralel akış, çok farklı viskozitelere sahip iki sıvının (bu durumda bir tampon ve fibrin pre-jel) bir kanal aracılığıyla birbirine karışmadan perfüzyona maruz kalmasını sağlar. Bir kavram kanıtı olarak, dermisi taklit eden bir fibrin matrisine gömülü fibroblastlar içeren bir dermo-epidermal yapı, farklılaşmamış epidermisi taklit etmek için bir keratinosit monolayerinin yüklendiği cihaza tanıtıldı. Dermal bölme yüksekliği, akış hızları değiştirilerek modüle edilebilir. Bu çalışmanın ana yeniliği, daha önce açıklanan22 , 26,27,28,29modellerine kıyasla, mikrokışmacalar yoluyla bir mikro şarampol içinde 3D bir yapının geliştirilmesidir. Bu makale basitleştirilmiş farklılaşmamış bir cilt sunsa da, uzun vadeli amaç, ilaç ve kozmetik test amaçları için canlılığını ve işlevselliğini göstermek için tamamen farklılaşmış bir cilt yapısı oluşturmak ve karakterize etmektir.
Bu yöntemi geliştirme motivasyon, cilt hastalıklarını modelleme ve yeni ve yenilikçi tedavilerin etkilerini yüksek verimli bir platformda inceleme arzusuydu. Bugüne kadar, bu laboratuvar bu dermo-epidermal eşdeğerleri manuel olarak veya 3D biyobaskı teknolojisi-fibroblastlı fibrin jeli yardımıyla bir hücre kültürü ekleme plakasına dökerek ve üzerine keratinositleri tohumlayarak üretmektedir. Keratinositler birleştiğinde, 3D kültürü, keratinosit farklılaşmasına neden olan, tabakalı bir epide…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán ve Juan Francisco Rodríguez’e çok yararlı öneriler, tartışmalar ve/veya ön veriler için içtenlikle teşekkür ederiz. Sergio Férnandez, Pedro Herreros ve Lara Stolzenburg’un bu projeye katkılarına da teşekkür ederiz. GFP etiketli hBC’ler ve hKC’ler için Dr. Marta García’ya özel teşekkürler. Son olarak, Guillermo Vizcaíno ve Angélica Corral’ın mükemmel teknik yardımını biliyoruz. Bu çalışma “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca “Programa de excelencia”, Project EPUC3M03, CAM tarafından da desteklendi. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
Culture plates | Fisher | ||
DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
Glass slide | Thermo Scientific | ||
GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
Live/dead kit | Invitrogen | ||
PBS | Sigma Aldrich | ||
Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
Syringes | Terumo | 5 mL | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |