Summary
这里描述的是一个DNA提取协议，使用磁珠从蚊子中产生高质量的DNA提取。这些提取适合下游的下一代测序方法。
Abstract
最近公布的一项使用磁珠和自动DNA提取仪器的DNA提取协议表明，有可能从保存完好的单个蚊子身上提取出高质量和数量的DNA，足以进行下游全基因组测序。然而，对于许多实验室来说，依赖昂贵的自动DNA提取仪器可能令人望而却步。在这里，该研究提供了一个经济实惠的磁珠为基础的DNA提取协议，这是适合中低吞吐量。这里描述的协议是使用个别伊 蚊 样本成功测试的。与高质量DNA提取相关的成本降低将增加高吞吐量测序在资源有限的实验室和研究中的应用。
Introduction
最近开发的改进的DNA提取协议1允许许多高影响下游研究涉及全基因组测序2，3，4，5，6。这种基于磁珠的DNA提取协议提供了来自单个蚊子样本的可靠DNA产量，这反过来又降低了从现场采集中获取足够数量的样本的成本和时间。
人口和景观基因组学的最新进展与全基因组测序成本的降低直接相关。虽然以前的DNA提取协议1 提高了与高通量测序相关的效率，但没有资金的小型实验室/研究可能会选择不使用这些新的强大景观和人口基因组学工具，因为实施协议的成本（例如，专用仪器的成本）。
在这里，提出了一个修改的DNA提取协议，使用与Neiman等人类似的磁珠提取步骤来获得 高纯度DNA，但不依赖于高成本的仪器进行组织裂解和DNA提取。该协议适用于需要>10ng高质量DNA的实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA提取前的一般样品储存和制剂
- 如果样品储存在 > 70% 酒精中以软化组织，则将样品在 100 μL PCR 级水中水合 1 小时（或过夜），达到 4 °C。
2. 样品中断
- 将孵化器或摇动热块设置在 56 °C 下。
- 制作蛋白酶K（PK）缓冲/酶混合物。每只蚊子提取需要 2 微升蛋白酶 K （100 毫克/兆升） 和 98 μL 蛋白酶 K 缓冲器 （总计 100 微升） 。要为多个标本准备主组合，将总数量（所有单个标本组合）增加 ±15%，以确保有足够的体积。
- 如果样品在提取前被水合，请丢弃每个样品管中的水。
- 在含有蚊子组织的 1.5 mL 微中心管中，加入 100 μL 的 PK 缓冲器/酶混合物。
- 使用微中心管虫使组织均匀化。
- 在室温下将样品离心1分钟，温度为9，600 x g。
- 在 56 °C 下将样品孵育为 2-3 小时。
- 在孵化过程中，使用DNA提取步骤（第 3 步）准备其他试剂。
3. 脱氧核糖核酸提取
- 使磁珠大师混合。对于每个样品，混合 100 μL 裂解缓冲器、100 μL 的 Isopropanol 和 15 μL 的磁珠（总计 215 μL）。要为多种反应准备主组合，将总量（所有单个标本组合）增加 ±20%，以确保有足够的体积。
- 孵化时间（步骤 2.7）后，使用移液器将每个解酯转移到干净的微中心管或微板井中。
- 在每个样品中加入 100 μL 解酯和 215 μL 的磁珠主混合物。
- 使用移液器将其混合在10-20秒，然后让它在室温下站立10分钟。偶尔轻轻摇动管子，以最大限度地结合磁珠和DNA。
- 将管/板放在磁珠分离器上，等待解决方案清晰。
- 使用移液器将液体从管/板中丢弃。取出超高分子时，尽量不要触摸或打扰持有DNA的磁珠。
- 将管/板从磁珠分离器移开，并在每口井中加入 325 μL 的洗涤缓冲 1。
- 在室温下通过管道和孵化彻底混合1分钟。
- 重复步骤 3.5-3.6。
- 将管/板从磁珠分离器移开，并在每口井中加入 250 μL 的洗涤缓冲 1。
- 在室温下通过管道和孵化彻底混合1分钟。
- 重复步骤 3.5-3.6。
- 将管/板从磁珠分离器移开，并在每个样品中加入 250 μL 的洗涤缓冲 2。
- 在室温下彻底混合并孵育1分钟。
- 重复步骤 3.5-3.6。
- 将管/板从磁珠分离器移开，并在每口井中加入 250 μL 的洗涤缓冲器 2。
- 在室温下彻底混合并孵育1分钟。
- 重复步骤 3.5-3.6。
- 将管/板从磁珠分离器移开，并在每口井中加入 100 μL 的弹性缓冲器。
- 在室温下彻底混合并孵育2分钟。
- 将管子/板移到磁珠分离器上，等待解决方案清晰。
- 将超强的派佩特放入新的清洁 0.5 微中心管或微板井中。
- 将 DNA 样本存储在 4 °C（最多 1 周）或 -80 °C。 如果正在使用微板，则用准胶片覆盖它。
- 使用任何适当的方法确定DNA的产量。
注：在这项研究中，利用了DNA荧光仪读数和吸收量在260/280纳米。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用 100 μL 的脱毛缓冲器使用荧光仪测量每个蚊子头/胸组织的平均 DNA 产量为 4.121 ng/μL （N = 92，标准偏差 3.513）。这足以满足全基因组库建设所需的10-30ng基因组DNA输入要求。DNA 的数量可能因蚊子体型和保存条件而异，在 0.3-29.7 ng/μL 之间。一些高变异性是由于研究中使用的磁珠的特性。不同品牌的磁珠可能会产生更一致的浓度，如上一份报告1所示。还应当指出，不同的蚊子物种大小不同，DNA的产量取决于这些个体和物种的大小范围。如果DNA浓度低于典型范围，可以调整蛋白酶K反应（第2.7步）的潜伏期，但这种延长不应超过16小时。此外，切换蛋白酶K和/或裂解缓冲品牌可以对DNA产生显著影响1。
图1显示，在0.5mM EDTA的椭芽缓冲器中，对最终DNA的典型微卷荧光仪读数。260/280 nm 的平均吸收比为 2.3（标准偏差 = 0.071）。数据与先前研究全基因组测序3、4所用样本的数据一致。
典型的试剂和提取消耗成本约为9.50美元/样品。这些成本估算包括 材料表中列出的试剂，以及其他耗材，如抽取所需的移液器尖、管子和手套。试剂和消耗成本等同于任何典型的磁珠提取方法（表1）。成本可能因任何特定产品的批量购买折扣而有所不同。本协议的主要成本效益来自不需要自动DNA提取仪器。
图1：荧氟仪输出。 典型的DNA荧光仪输出蚊子DNA在椭道缓冲与0.5m EDTA。 请单击此处查看此图的较大版本。
表1：不同提取方法的成本分析。 该表列出了在一个工作日内处理不同提取方法的成本和样本数量。 请点击这里下载此表。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的协议可以适应其他昆虫物种。尼曼等人介绍的协议的原始版本已经在多个物种上进行了测试，包括伊蚊、伊蚊、伊·布希、埃·塔尼奥尔欣丘斯、阿诺菲莱斯·阿拉比安西斯、安·科卢齐、安·库斯塔尼、 安达利， 安· 预计此协议将适用于这些以及其他节肢动物。
理想情况下，在提取DNA之前，样品应储存在 4 °C 的 70%-80% 乙醇中。通常，80%的乙醇用于在非洲储存蚊子样本。高温条件会加速乙醇的蒸发，使乙醇含量低于预期（70%）。储存在100%乙醇、变性酒精、75%-90%同位素或摩擦酒精中的样品也使用Nieman等人的协议成功 进行了全基因组测序，预计该协议将同样出色。这里描述的DNA提取协议也已在储存在硅干和冷冻在-20°C的样品上进行了试验。 但是，存储 6-12 个月 >时发生故障的几率较高（15%-30%），这表明这些情况不太理想。
由于没有物理样本中断的DNA提取有更高的失败几率（33%）1，此协议包含手动物理中断技术（步骤 2.5）。也可以使用组织裂解仪器1上的钢珠实现样品中断。
使用本协议提取DNA的试剂和消耗成本可与其他提取方法（表1）相媲美。但是，此处描述的协议不需要自动 DNA 提取仪器。由于处理DNA提取的体力劳动，一个人通常可以处理12-16个样本，并在一天内完成DNA定量。这大大低于自动DNA提取设置每天可以处理的。因此，在选择协议时，应考虑样品处理能力。但是，该协议提供的较低成本阈值应使许多资源有限的实验室和研究能够利用高通量测序技术。
在尼曼等人1 和此协议中，根据下游分析，可以用典型的 TE 缓冲器 10 mM Tris-Cl 或水替换。含有某些 EDTA 的放射缓冲可能会影响酶效率。典型的基于酶剪切的 gDNA 库制备协议包括调理解决方案或增强剂，以补偿 EDTA 的酶抑制。还应考虑EDTA可能会改变吸收在230纳米波长11。例如，EDTA 浓度越高，吸收值在 220-240 nm 波长之间，就会比 图 1 中显示的更高（未显示数据）。
这种协议可以很容易地适应实验室与最小的分子生物学工具。这里描述的协议试图降低与基因组提取相关的成本阈值，从而增加高吞吐量测序在资源有限的实验室和研究中的应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢由美国疾病控制和预防中心资助的太平洋西南地区病媒-伯恩疾病卓越中心（合作协议 1U01CK000516）、CDC 赠款 NU50CK000420-04-04、 美国农业部国家粮食和农业研究所（哈奇项目1025565）、UF/IFAS佛罗里达医学昆虫学实验室研究金给陈泽宇、NSF CAMTech IUCRC第二期赠款（AWD05009_MOD0030）和佛罗里达州卫生部（合同CODQJ）。本文的结论和结论是作者的，不一定代表美国鱼类和野生动物管理局的观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
