Summary
Beskrevet her er en DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler for å produsere DNA-ekstraksjoner av høy kvalitet fra mygg. Disse ekstraksjonene er egnet for en nedstrøms neste generasjons sekvenseringstilnærming.
Abstract
En nylig publisert DNA-ekstraksjonsprotokoll ved hjelp av magnetiske perler og et automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument antydet at det er mulig å trekke ut DNA av høy kvalitet og kvantitets-DNA fra en godt bevart individuell mygg som er tilstrekkelig for nedstrøms hele genomsekvensering. Imidlertid kan avhengighet av et dyrt automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument være forbudt for mange laboratorier. Her gir studien en budsjettvennlig magnetisk-perle-basert DNA-ekstraksjonsprotokoll, som er egnet for lav til middels gjennomstrømning. Protokollen beskrevet her ble vellykket testet ved hjelp av individuelle Aedes aegypti myggprøver. De reduserte kostnadene forbundet med DNA-ekstraksjon av høy kvalitet vil øke anvendelsen av høy gjennomstrømningssekvensering til ressursbegrensede laboratorier og studier.
Introduction
Nylig utvikling av en forbedret DNA-ekstraksjonsprotokoll1 har tillatt mange nedstrømsstudier med høy effekt som involverer hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsprotokollen gir pålitelig DNA-utbytte fra individuelle myggprøver, noe som igjen reduserer kostnadene og tiden forbundet med å skaffe seg et tilstrekkelig antall prøver fra feltsamlinger.
Nylige fremskritt innen befolknings- og landskapsgenomikk er direkte korrelert med avtagende kostnader ved hele genomsekvensering. Selv om den forrige DNA-utvinningsprotokollen1 øker effektiviteten forbundet med sekvensering med høy gjennomstrømning, kan mindre laboratorier/studier uten midlene velge bort å bruke disse nye kraftige landskaps- og populasjonsgenomikkverktøyene på grunn av kostnadene ved å implementere protokollen (f.eks. kostnader ved spesialiserte instrumenter).
Her presenteres en modifisert DNA-ekstraksjonsprotokoll som bruker et lignende magnetisk perleutvinningstrinn som Neiman et al.1 for å oppnå DNA med høy renhet, men er ikke avhengig av dyre instrumenter for vevslys og DNA-ekstraksjon. Denne protokollen er egnet for eksperimenter som krever >10 ng av dna av høy kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generell prøvelagring og preparater før DNA-ekstraksjon
- Hydrater prøven i 100 μL PCR-klasse vann i 1 t (eller over natten) ved 4 °C hvis prøven er lagret i >70 % alkohol for å myke opp vevet.
2. Prøveavbrudd
- Sett en inkubator eller risting varmeblokk ved 56 °C.
- Lag proteinase K (PK) buffer/enzymblanding. 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) og 98 μL Proteinase K Buffer (totalt 100 μL) kreves for hver enkelt myggutvinning. For å forberede en masterblanding for flere prøver, øk den totale mengden (kombinert for alle individuelle prøver) med ~ 15% for å sikre tilgjengeligheten av tilstrekkelig volum.
- Hvis prøvene ble hydrert før utvinning, kast vann fra hvert prøverør.
- I et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder myggvev, tilsett 100 μL PK buffer/enzymblanding.
- Homogeniser vevet ved hjelp av mikrocentrifuge tube pestle.
- Sentrifuger prøvene i 1 min ved 9600 x g ved romtemperatur.
- Inkuber prøven i 2-3 timer ved 56 °C.
- Under inkubasjon forbereder du de andre reagensene ved hjelp av DNA-ekstraksjonstrinnet (trinn 3).
3. DNA-ekstraksjon
- Lag en magnetisk perle master mix. For hver prøve blander du 100 μL lysisbuffer, 100 μL Isopropanol og 15 μL magnetiske perler (totalt 215 μL). For å forberede en masterblanding for flere reaksjoner, øk den totale mengden (kombinert for alle individuelle prøver) med ~ 20% for å sikre tilgjengeligheten av tilstrekkelig volum.
- Etter inkubasjonstiden (trinn 2.7), overfør hvert lysat til et rent mikrosenterrør eller en mikroplatebrønn ved hjelp av pipette.
- Tilsett 100 μL lysat og 215 μL av den magnetiske perlemasterblandingen til hver prøve.
- Bruk en pipette til å blande den godt i 10-20 s og la den stå i 10 minutter ved romtemperatur. Rist forsiktig røret av og til for å maksimere bindingen av magnetiske perler og DNA.
- Plasser røret/platen på den magnetiske perleseparatoren og vent til oppløsningen er klar.
- Kast væsken fra røret/platen med pipette. Når du fjerner supernatanten, prøv å ikke berøre eller forstyrre de magnetiske perlene som holder DNA-et.
- Flytt røret/platen bort fra magnetisk perleseparator og tilsett 325 μL vaskebuffer 1 til hver brønn.
- Bland grundig ved pipettering og inkuber i 1 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.5-3.6.
- Flytt røret/platen bort fra magnetisk perleseparator og tilsett 250 μL vaskebuffer 1 til hver brønn.
- Bland grundig ved pipettering og inkuber i 1 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.5-3.6.
- Flytt røret/platen bort fra magnetisk perleseparator og tilsett 250 μL vaskebuffer 2 til hver prøve.
- Bland grundig og inkuber i 1 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.5-3.6.
- Flytt røret/platen bort fra magnetisk perleseparator og tilsett 250 μL vaskebuffer 2 til hver brønn.
- Bland grundig og inkuber i 1 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.5-3.6.
- Flytt røret/platen bort fra den magnetiske perleseparatoren og tilsett 100 μL elutionbuffer til hver brønn.
- Bland grundig og inkuber i 2 min ved romtemperatur.
- Flytt røret/platen over på den magnetiske perleseparatoren og vent til oppløsningen er klar.
- Pipette supernatanten inn i et nytt rent 0,5 mikrocentrifugerør eller mikroplatebrønn.
- Oppbevar DNA-prøver ved 4 °C (opptil 1 uke) eller -80 °C. Hvis en mikroplate brukes, dekk den med parafilm.
- Bestem DNA-avkastningen ved hjelp av en passende metode.
MERK: I denne studien ble DNA-fluorometeravlesning og absorbans ved 260/280 nm benyttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennomsnittlig DNA-utbytte per enkelt mygghode/thoraxvev var 4,121 ng/μL (N = 92, standardavvik 3,513) målt ved bruk av fluorometer ved bruk av 100 μL elutionbuffer. Dette er tilstrekkelig for de 10-30 ng genomiske DNA-inngangskravene som er nødvendige for hele genombibliotekets konstruksjon1,7. Mengden DNA kan variere mellom 0,3-29,7 ng/μL avhengig av myggkroppens størrelse og bevaringsforhold. Noe av den høye variasjonen skyldes karakteristikken til magnetiske perler som brukes i studien. Ulike merker av magnetiske perler kan produsere mer konsistente konsentrasjoner, som angitt i forrige rapport1. Det skal også bemerkes at forskjellige myggarter varierer i størrelse og at DNA-utbyttet er avhengig av de individuelle og artsstørrelsesområdene. Hvis DNA-konsentrasjonen er under de typiske områdene, kan man justere inkubasjonsperioden i proteinase K-reaksjonen (trinn 2.7), men denne utvidelsen bør ikke være lenger enn 16 timer. Videre kan bytte av proteinase K og / eller lysisbuffermerker ha betydelig innvirkning på DNA-utbytte1.
Den typiske mikrovolumfluoremetrometeravlesningen av det endelige DNA-et i elutionbufferen med 0,5 mM EDTA er vist i figur 1. Gjennomsnittlig absorbansforhold for 260/280 nm var 2,3 (standardavvik = 0,071). Dataene var konsistente fra prøvene som ble brukt i de tidligere studiene for hele genomsekvensering3,4.
Typisk reagens og forbrukskostnad for utvinning er rundt $ 9.50 / prøve. Disse kostnadsestimatene inkluderer reagenser som er oppført i materialtabellen, og andre forbruksvarer som pipettespisser, rør og hansker som trengs for utvinning. Reagenset og forbrukskostnaden tilsvarer enhver typisk magnetisk-perlebasert ekstraksjonsmetode (tabell 1). Kostnaden kan variere noe avhengig av bulkkjøpsrabatter som er tilgjengelige for et gitt produkt. Den største kostnadsfordelen ved denne protokollen kommer fra å ikke kreve det automatiserte DNA-ekstraksjonsinstrumentet.
Figur 1: Fluorometerutgang. Typisk DNA-fluorometerutgang av mygg-DNA eluted i elutionbuffer med 0,5 mM EDTA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Kostnadsanalyse for ulike utvinningsmetoder. Tabellen viser kostnadene og antall prøver som behandles i én virkedag for ulike utvinningsmetoder. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan tilpasses andre insektarter. Den opprinnelige versjonen av protokollen introdusert i Nieman et al.1 har blitt testet på flere arter, inkludert Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absutaol, og Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Det forventes at denne protokollen vil fungere for disse så vel som andre leddyr.
Ideelt sett bør prøver lagres i 70% -80% etanol ved 4 °C før DNA-ekstraksjon. Vanligvis brukes 80% etanol til lagring av myggprøver i Afrika. Høye temperaturforhold kan akselerere fordampning av etanol og gjøre etanolinnholdet lavere enn det som er ment (70%). Prøver lagret i 100% etanol, denaturert alkohol, 75% -90% isopropanol eller gni alkohol har også resultert i vellykket hele genomsekvensering ved hjelp av Nieman et al.1-protokollen, og det forventes at denne protokollen vil fungere like bra. DNA-ekstraksjonsprotokollen som er beskrevet her, er også forsøkt på prøver som er lagret tørre i silika og frosset ved -20 °C. Imidlertid var det en høyere (15% -30%) sjanse for feil når de ble lagret i >6-12 måneder, noe som tyder på at disse var mindre enn ideelle lagringsforhold.
Siden DNA-ekstraksjon uten fysiske prøveforstyrrelser har større sjanse for feil (33 %)1, inneholder denne protokollen en manuell fysisk forstyrrelsesteknikk (trinn 2.5). Prøveforstyrrelser kan også oppnås ved hjelp av stålperler på et vevslysinstrument1.
Reagensene og forbrukskostnaden for DNA-ekstraksjon ved hjelp av denne protokollen kan sammenlignes med andre tilgjengelige ekstraksjonsmetoder (tabell 1). Protokollen som er beskrevet her, krever imidlertid ikke et automatisert DNA-ekstraksjonsinstrument. På grunn av manuell arbeidskraft involvert i behandling av DNA-ekstraksjon, kan en person vanligvis behandle 12-16 prøver og avslutte med DNA-kvantifisering på en dag. Dette er betydelig mindre enn hva automatisert DNA-ekstraksjonsoppsett kan behandle per dag. Når du velger en protokoll, bør prøvebehandlingskapasiteten derfor tas i betraktning. Den lavere kostnadsterskelen denne protokollen tilbyr, bør imidlertid gjøre det mulig for mange ressursbegrensede laboratorier og studier å utnytte sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning.
I både Nieman et al.1 og denne protokollen kan elutionbuffer erstattes med den typiske TE-bufferen, 10 mM Tris-Cl eller vann avhengig av nedstrømsanalysen. En elutionbuffer som inneholder noe EDTA kan påvirke enzymeffektiviteten. Typiske enzymatiske skjærebaserte gDNA-bibliotekforberedelsesprotokoller inkluderer kondisjoneringsløsninger eller forsterkere lagt til for å kompensere for enzymhemming av EDTA. Det bør også vurderes at EDTA kan endre absorbansen ved 230 nm bølgelengde11. For eksempel vil høyere konsentrasjoner av EDTA skape en høyere absorbansverdi mellom 220-240 nm bølgelengde enn det som er vist i figur 1 (data ikke vist).
Denne protokollen kan enkelt tilpasses laboratorier med minimale molekylærbiologiske verktøy. Protokollen som beskrives her forsøker å redusere kostnadsterskler forbundet med genomutvinning og dermed øke anvendelsen av høy gjennomstrømningssekvensering til ressursbegrensede laboratorier og studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner finansieringsstøtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finansiert av U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC grant NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-prosjektet 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) og Florida Department of Health (Contract CODQJ). Funnene og konklusjonene i denne artikkelen er de av forfatteren(e) og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
