Summary
Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.
Abstract
Un protocole d’extraction de l’ADN récemment publié à l’aide de billes magnétiques et d’un instrument automatisé d’extraction de l’ADN suggère qu’il est possible d’extraire de l’ADN de haute qualité et en quantité d’un moustique individuel bien préservé suffisant pour le séquençage du génome entier en aval. Cependant, le recours à un instrument automatisé coûteux d’extraction de l’ADN peut être prohibitif pour de nombreux laboratoires. Ici, l’étude fournit un protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique, qui convient à un débit faible à moyen. Le protocole décrit ici a été testé avec succès à l’aide d’échantillons individuels de moustiques Aedes aegypti. La réduction des coûts associés à l’extraction de l’ADN de haute qualité augmentera l’application du séquençage à haut débit aux laboratoires et aux études aux ressources limitées.
Introduction
Le développement récent d’un protocole d’extraction d’ADN amélioré1 a permis de nombreuses études en aval à fort impact impliquant le séquençage du génome entier2,3,4,5,6. Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques fournit un rendement fiable en ADN à partir d’échantillons individuels de moustiques, ce qui réduit le coût et le temps associés à l’acquisition d’un nombre suffisant d’échantillons provenant de collections sur le terrain.
Les progrès récents de la génomique des populations et des paysages sont directement corrélés à la diminution des coûts du séquençage du génome entier. Bien que l’ancien protocole d’extraction de l’ADN1 augmente l’efficacité associée au séquençage à haut débit, les petits laboratoires ou études sans fonds peuvent choisir de ne pas utiliser ces nouveaux outils puissants de génomique du paysage et des populations en raison des coûts de mise en œuvre du protocole (p. ex. les coûts des instruments spécialisés).
Ici, un protocole d’extraction d’ADN modifié est présenté qui utilise une étape d’extraction de perles magnétique similaire à celle de Neiman et al.1 pour obtenir de l’ADN de haute pureté, mais ne repose pas sur des instruments coûteux pour la lyse tissulaire et l’extraction de l’ADN. Ce protocole convient aux expériences nécessitant >10 ng d’ADN de haute qualité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Entreposage général des échantillons et préparations avant l’extraction de l’ADN
- Hydrater l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR de 100 μL pendant 1 h (ou pendant la nuit) à 4 °C si l’échantillon a été conservé dans de l’alcool de >70 % pour adoucir le tissu.
2. Perturbation de l’échantillon
- Réglez un incubateur ou un bloc chauffant secouant à 56 °C.
- Faire de la protéinase K (PK) tampon/mélange d’enzymes. 2 μL de protéinase K (100 mg/mL) et 98 μL de tampon protéinase K (total 100 μL) sont nécessaires pour chaque extraction individuelle du moustique. Pour préparer un mélange maître pour plusieurs spécimens, augmenter la quantité totale (combinée pour tous les spécimens individuels) d’environ 15% pour assurer la disponibilité d’un volume adéquat.
- Si les échantillons ont été hydratés avant l’extraction, jetez l’eau de chaque tube d’échantillonnage.
- Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant du tissu de moustique, ajouter 100 μL de tampon PK/mélange d’enzymes.
- Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon à tube microcentrifuge.
- Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 9 600 x g à température ambiante.
- Incuber l’échantillon pendant 2-3 h à 56 °C.
- Pendant l’incubation, préparer les autres réactifs à l’aide de l’étape d’extraction de l’ADN (étape 3).
3. Extraction de l’ADN
- Faire un mélange maître de perles magnétiques. Pour chaque échantillon, mélanger 100 μL de tampon de lyse, 100 μL d’isopropanol et 15 μL de billes magnétiques (total de 215 μL). Pour préparer un mélange maître pour les réactions multiples, augmenter la quantité totale (combinée pour tous les échantillons individuels) d’environ 20% pour assurer la disponibilité d’un volume adéquat.
- Après le temps d’incubation (étape 2.7), transférer chaque lysat dans un tube microcentrifuge propre ou un puits de microplaque à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 100 μL de lysat et 215 μL du mélange maître de perles magnétiques à chaque échantillon.
- Utilisez une pipette pour bien le mélanger pendant 10-20 s, puis laissez-le reposer pendant 10 min à température ambiante. Secouez doucement le tube de temps en temps pour maximiser la liaison des perles magnétiques et de l’ADN.
- Placez le tube/la plaque sur le séparateur de perles magnétiques et attendez que la solution soit claire.
- Jetez le liquide du tube ou de la plaque à l’aide d’une pipette. Lorsque vous retirez le surnageant, essayez de ne pas toucher ou déranger les perles magnétiques qui maintiennent l’ADN.
- Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 325 μL de tampon de lavage 1 à chaque puits.
- Bien mélanger par pipetage et incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 3.5-3.6.
- Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 1 à chaque puits.
- Bien mélanger par pipetage et incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 3.5-3.6.
- Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de billes magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 2 à chaque échantillon.
- Bien mélanger et incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 3.5-3.6.
- Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 250 μL de tampon de lavage 2 à chaque puits.
- Bien mélanger et incuber pendant 1 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 3.5-3.6.
- Éloignez le tube ou la plaque du séparateur de billes magnétiques et ajoutez 100 μL de tampon d’élution à chaque puits.
- Bien mélanger et incuber pendant 2 min à température ambiante.
- Déplacez le tube/la plaque sur le séparateur de billes magnétiques et attendez que la solution soit claire.
- Pipettez le surnageant dans un nouveau tube ou microplaque propre de 0,5 microcentrifuge.
- Conserver les échantillons d’ADN à 4 °C (jusqu’à 1 semaine) ou -80 °C. Si une microplaque est utilisée, couvrez-la de parafilm.
- Déterminer les rendements en ADN à l’aide de toute méthode appropriée.
REMARQUE: Dans cette étude, la lecture et l’absorbance du fluoromètre à ADN à 260/280 nm ont été utilisées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le rendement moyen en ADN par tissu de tête/thorax de moustique était de 4,121 ng/μL (N = 92, écart-type de 3,513) mesuré à l’aide d’un fluoromètre lorsqu’il était élué à l’aide de 100 μL de tampon d’élution. Ceci est suffisant pour les besoins d’entrée d’ADN génomique de 10 à 30 ng nécessaires à la construction de la bibliothèque de génomesentiers 1,7. La quantité d’ADN peut varier entre 0,3 et 29,7 ng/μL selon la taille corporelle du moustique et les conditions de conservation. Une partie de la grande variabilité est due à la caractéristique des billes magnétiques utilisées dans l’étude. Différentes marques de billes magnétiques peuvent produire des concentrations plus cohérentes, comme indiqué dans le rapport précédent1. Il convient également de noter que différentes espèces de moustiques diffèrent par leur taille et que le rendement en ADN dépend de ces plages de taille individuelles et d’espèces. Si la concentration d’ADN est inférieure aux plages typiques, on peut ajuster la période d’incubation dans la réaction protéinase K (étape 2.7), mais cette extension ne doit pas dépasser 16 h. De plus, le changement des marques de tampon de protéinase K et/ou de lyse peut avoir un impact significatif sur le rendement en ADN1.
La lecture typique du fluoromètre à microvolume de l’ADN final dans un tampon d’élution avec de l’EDTA de 0,5 mM est illustrée à la figure 1. Le rapport d’absorbance moyen pour 260/280 nm était 2,3 (écart type = 0,071). Les données étaient cohérentes à partir des échantillons utilisés dans les études précédentes pour le séquençage du génome entier3,4.
Le coût typique des réactifs et des consommables pour l’extraction est d’environ 9,50 $ / échantillon. Ces estimations de coûts comprennent les réactifs énumérés dans la table des matièreset d’autres consommables tels que les pointes de pipette, les tubes et les gants nécessaires à l’extraction. Le coût du réactif et du consommable est équivalent à toute méthode d’extraction typique à base de billes magnétiques(tableau 1). Le coût peut varier quelque peu en fonction des remises d’achat en vrac disponibles pour un produit donné. Le principal avantage de ce protocole vient du fait qu’il n’est pas besoin de l’instrument automatisé d’extraction de l’ADN.
Figure 1: Sortie du fluoromètre. Sortie typique du fluoromètre d’ADN de l’ADN de moustique élué dans le tampon d’élution avec 0,5 mM d’EDTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1 : Analyse des coûts pour différentes méthodes d’extraction. Le tableau indique les coûts et le nombre d’échantillons traités en une journée ouvrable pour différentes méthodes d’extraction. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole décrit ici peut être adapté à d’autres espèces d’insectes. La version originale du protocole introduit dans Nieman et al.1 a été testée sur plusieurs espèces, y compris Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, et Keiferia lycopersicella2,8,9,10. On s’attend à ce que ce protocole fonctionne pour ces arthropodes ainsi que pour d’autres.
Idéalement, les échantillons devraient être conservés dans de l’éthanol à 70 à 80 % à 4 °C avant l’extraction de l’ADN. Typiquement, 80% d’éthanol est utilisé pour stocker des échantillons de moustiques en Afrique. Des conditions de température élevées pourraient accélérer l’évaporation de l’éthanol et rendre la teneur en éthanol inférieure à ce qui est prévu (70 %). Les échantillons stockés dans de l’éthanol à 100 %, de l’alcool dénaturé, de l’isopropanol à 75 % à 90 % ou de l’alcool à friction ont également donné lieu à un séquençage réussi du génome entier à l’aide du protocole Nieman et al.1, et on s’attend à ce que ce protocole fonctionne aussi bien. Le protocole d’extraction de l’ADN décrit ici a également été testé sur des échantillons stockés secs dans de la silice et congelés à -20 °C. Cependant, il y avait un risque plus élevé (15% -30%) de panne une fois stocké pendant >6-12 mois, suggérant que ces conditions étaient moins qu’idéales.
Comme l’extraction de l’ADN sans perturbation physique de l’échantillon a un risque plus élevé d’échec (33%)1,ce protocole intègre une technique de perturbation physique manuelle (étape 2.5). La perturbation des échantillons peut également être obtenue à l’aide de billes d’acier sur un instrument de lyse tissulaire1.
Les réactifs et le coût des consommables pour l’extraction de l’ADN à l’aide de ce protocole sont comparables à ceux des autres méthodes d’extraction disponibles(tableau 1). Cependant, le protocole décrit ici ne nécessite pas d’instrument automatisé d’extraction de l’ADN. En raison du travail manuel impliqué dans le traitement de l’extraction de l’ADN, une personne peut généralement traiter 12-16 échantillons et terminer avec la quantification de l’ADN en une journée. C’est beaucoup moins que ce que la configuration automatisée d’extraction de l’ADN peut traiter par jour. Ainsi, lors du choix d’un protocole, la capacité de traitement des échantillons doit être prise en compte. Cependant, le seuil de coût inférieur offert par ce protocole devrait permettre à de nombreux laboratoires et études aux ressources limitées de tirer parti de la technologie de séquençage à haut débit.
Dans nieman et al.1 et ce protocole, le tampon d’élution peut être remplacé par le tampon TE typique, 10 mM Tris-Cl, ou l’eau selon l’analyse en aval. Un tampon d’élution contenant de l’EDTA peut avoir un impact sur l’efficacité enzymatique. Les protocoles typiques de préparation de la bibliothèque d’ADN gDNA à base de cisaillement enzymatique comprennent des solutions de conditionnement ou des exhausteurs ajoutés pour compenser l’inhibition enzymatique par l’EDTA. Il faut également considérer que l’EDTA peut modifier l’absorbance à 230 nm de longueur d’onde11. Par exemple, des concentrations plus élevées d’EDTA créeraient une valeur d’absorbance plus élevée entre 220 et 240 nm de longueur d’onde que celle illustrée à la figure 1 (données non présentées).
Ce protocole peut être facilement adapté aux laboratoires avec un minimum d’outils de biologie moléculaire. Le protocole décrit ici tente de réduire les seuils de coût associés à l’extraction du génome et ainsi augmenter l’application du séquençage à haut débit aux laboratoires et aux études aux ressources limitées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien financier du Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases financé par les Centers for Disease Control and Prevention des États-Unis (Accord de coopération 1U01CK000516), de la subvention des CDC NU50CK000420-04-04, de l’Usda National Institute of Food and Agriculture (projet Hatch 1025565), de la bourse UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory à Tse-Yu Chen, de la subvention NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) et du Florida Department of Health (Contrat CODQJ). Les constatations et les conclusions du présent article sont celles de l’auteur ou des auteurs et ne représentent pas nécessairement le point de vue du U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
