Summary
מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.
Abstract
פרוטוקול מיצוי DNA שפורסם לאחרונה באמצעות חרוזים מגנטיים ומכשיר מיצוי DNA אוטומטי הציע כי ניתן לחלץ DNA באיכות גבוהה וכמות מיתוש בודד שמור היטב מספיק עבור ריצוף גנום שלם במורד הזרם. עם זאת, הסתמכות על מכשיר מיצוי DNA אוטומטי יקר יכולה להיות אסורה עבור מעבדות רבות. כאן, המחקר מספק פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי ידידותי לתקציב, אשר מתאים לתפוקה נמוכה עד בינונית. הפרוטוקול המתואר כאן נבדק בהצלחה באמצעות דגימות יתושים Aedes aegypti בודדים. העלויות המופחתות הקשורות להפקת דנ"א באיכות גבוהה יגדילו את היישום של רצף תפוקה גבוהה למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים.
Introduction
פיתוח לאחרונה של פרוטוקול מיצוי DNA משופר1 אפשר מחקרים רבים בעלי השפעה גבוהה במורד הזרם מעורבים רצף גנום שלם2,3,4,5,6. פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי זה מספק תפוקת DNA אמינה מדגימות יתושים בודדות, אשר בתורו מפחית את העלות ואת הזמן הקשורים לרכישת מספר מספיק של דגימות מאוספי שדה.
ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של אוכלוסיה ונוף מתואמת ישירות עם הפחתת עלויות של ריצוף גנום שלם. למרות פרוטוקול חילוץ ה- DNA הקודם1 מגביר את היעילות הקשורה לרצף תפוקה גבוהה, מעבדות / מחקרים קטנים יותר ללא הכספים עשויים לבטל את השימוש בכלי הנוף החדשים והחזקים האלה וגנומיקה באוכלוסייה בשל עלויות יישום הפרוטוקול (למשל, עלויות של מכשירים מיוחדים).
כאן, פרוטוקול מיצוי DNA שונה מוצג המשתמש בצעד מיצוי חרוז מגנטי דומה כמו נימן ואח'1 כדי להשיג DNA טוהר גבוה אבל לא מסתמך על מכשירים בעלות גבוהה עבור תמיסת רקמות ומיצוי DNA. פרוטוקול זה מתאים לניסויים הדורשים >10 ננוגרם של DNA באיכות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אחסון דגימות כללי ותכשירים לפני הפקת DNA
- לחות את המדגם במים 100 μL PCR בכיתה עבור 1 שעות (או לילה) ב 4 °C (7 °F) אם המדגם כבר מאוחסן >70% אלכוהול כדי לרכך את הרקמה.
2. הפרעה לדוגמה
- הגדר אינקובטור או בלוק חום רועד ב 56 °C (56 °F).
- הפוך פרוטאינאז K (PK) חוצץ / תערובת אנזימים. 2 μL של פרוטאינאז K (100 מ"ג/מ"ל) ו-98 μL של חיץ Proteinase K (סה"כ 100 μL) נדרשים עבור כל מיצוי יתושים. כדי להכין תערובת אב עבור דגימות מרובות, להגדיל את הכמות הכוללת (בשילוב עבור כל הדגימות הבודדות) על ידי ~ 15% כדי להבטיח את הזמינות של נפח נאות.
- אם הדגימות היו hydrated לפני החילוץ, להשליך מים מכל צינור מדגם.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל רקמת יתוש, הוסף 100 μL של חיץ PK / תערובת אנזימים.
- הומוגניזציה הרקמה באמצעות עלה צינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה הדגימות במשך 1 דקות ב 9,600 x g בטמפרטורת החדר.
- לדגור על המדגם עבור 2-3 שעות ב 56 °C (56 °F).
- במהלך הדגירה, להכין את ריאגנטים אחרים באמצעות שלב מיצוי ה- DNA (שלב 3).
3. מיצוי דנ"א
- הפוך תערובת מאסטר חרוז מגנטי. עבור כל מדגם, לערבב 100 μL של מאגר תמה, 100 μL של Isopropanol, ו 15 μL של חרוזים מגנטיים (סה"כ 215 μL). כדי להכין תערובת אב לתגובות מרובות, הגדל את הכמות הכוללת (בשילוב עבור כל הדגימות הבודדות) בכ- 20% כדי להבטיח זמינות של נפח הולם.
- לאחר זמן הדגירה (שלב 2.7), מעבירים כל ליסייט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי או לבאר מיקרו-לוח באמצעות פיפטה.
- הוסף 100 μL ליסאט ו 215 μL של תערובת מאסטר חרוז מגנטי לכל מדגם.
- השתמש פיפטה לערבב אותו היטב במשך 10-20 s ולאחר מכן לתת לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לנער בעדינות את הצינור מדי פעם כדי למקסם את הכריכה של חרוזים מגנטיים ו- DNA.
- מניחים את הצינור / הצלחת על מפריד החרוזים המגנטי ולהמתין עד הפתרון ברור.
- יש להשליך את הנוזל מהצינור/צלחת באמצעות פיפטה. בעת הסרת supernatant, נסה לא לגעת או להפריע החרוזים המגנטיים מחזיק את ה- DNA.
- הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוזים מגנטי ולהוסיף 325 μL של חוצץ כביסה 1 לכל באר.
- מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 3.5-3.6.
- הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 1 לכל באר.
- מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 3.5-3.6.
- הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 2 לכל מדגם.
- מערבבים היטב ודגרה במשך דקה בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 3.5-3.6.
- הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 2 לכל באר.
- מערבבים היטב ודגרה במשך דקה בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 3.5-3.6.
- הזז את הצינור / צלחת מן מפריד החרוזים המגנטי ולהוסיף 100 μL של חוצץ elution לכל באר.
- מערבבים היטב ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את הצינור/הצלחת על מפריד החרוזים המגנטי וממתינים עד שהפתרון יתבהר.
- Pipette supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי חדש 0.5 או microplate היטב.
- יש לאחסן דגימות דנ"א ב-4 °C (עד שבוע אחד) או -80 °C (50 °F). אם נעשה שימוש במיקרו-לוח, כסו אותו בפרפילם.
- קבע את תפוקת הדנ"א בכל שיטה מתאימה.
הערה: במחקר זה, קריאה וספיגה של פלואורומטר DNA ב 260/280 ננומטר נוצלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תפוקת הדנ"א הממוצעת לכל רקמת ראש/בית החזה של יתוש הייתה 4.121 ננוגרם/μL (N = 92, סטיית תקן 3.513) שנמדדה באמצעות פלואורומטר כאשר נעשה בה שימוש ב-100 מיקרו-אל של חיץ אילוטיון. זה מספיק עבור דרישות קלט DNA גנומי 10-30 ננומי הדרושות לבניית ספריית גנום שלמה1,7. כמות ה- DNA יכולה להשתנות בין 0.3-29.7 ng/μL בהתאם לגודל גוף היתוש ותנאי השימור. חלק מההנוויות הגבוהות נובעות מהמאפיין של חרוזים מגנטיים המשמשים במחקר. מותגים שונים של חרוזים מגנטיים עשויים לייצר ריכוזים עקביים יותר, כפי שצוין בדו"ח הקודם1. כמו כן יש לציין כי מינים שונים של יתושים שונים בגודלם וכי תפוקת ה- DNA תלויה בטווחי גודל בודדים ומינים אלה. אם ריכוז הדנ"א נמצא מתחת לטווחים הטיפוסיים, ניתן להתאים את תקופת הדגירה בתגובת ה-K של פרוטאינאז (שלב 2.7), אך הרחבה זו צריכה להיות לא יותר מ-16 שעות. יתר על כן, החלפת המותגים חיץ פרוטאינאז K ו/ או תמיס יכולה להיות השפעה משמעותית על תפוקת ה- DNA1.
קריאת פלואורומטר מיקרו-וולטום טיפוסית של הדנ"א הסופי במאגר אילוטיון עם 0.5 מ"מ EDTA מוצגת באיור 1. יחס הספיגה הממוצע של 260/280 ננומטר היה 2.3 (סטיית תקן = 0.071). הנתונים היו עקביים מן הדגימות המשמשות במחקרים הקודמים עבור ריצוף גנום שלם3,4.
עלות ריאגנט טיפוסית ומתכלה עבור החילוץ היא סביב $9.50/מדגם. הערכות עלות אלה כוללות ריאגנטים המפורטים בטבלת החומרים, וחומרים מתכלים אחרים כגון טיפים פיפטה, צינורות, וכפפות הדרושים לחילוץ. העלות המחודשת והמתכלה שוות ערך לכל שיטת מיצוי טיפוסית המבוססת על חרוז מגנטי(טבלה 1). העלות עשויה להשתנות במקצת בהתאם הנחות רכישה בתפזורת זמין עבור כל מוצר נתון. היתרון העיקרי של העלות של פרוטוקול זה נובע מאי-צורך במכשיר מיצוי DNA אוטומטי.
איור 1: פלט פלואורומטר. תפוקת פלואורומטר DNA טיפוסית של DNA יתוש eluted במאגר elution עם 0.5 mM EDTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: ניתוח עלויות עבור שיטות מיצוי שונות. הטבלה מפרטת את העלויות ואת מספר הדגימות המעובדות ביום עבודה אחד עבור שיטות מיצוי שונות. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם למינים אחרים של חרקים. הגרסה המקורית של הפרוטוקול שהוצגה בניימן ואח'1 נבדקה על מינים מרובים, כולל Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, ו Keiferia lycopersicella2,8,9,10. צפוי כי פרוטוקול זה יעבוד עבור אלה, כמו גם פרוקי רגליים אחרים.
באופן אידיאלי, דגימות צריך להיות מאוחסן 70%-80% אתנול ב 4 °C לפני מיצוי DNA. בדרך כלל, 80% אתנול משמש לאחסון דגימות יתושים באפריקה. תנאי טמפרטורה גבוהים יכולים להאיץ את האידוי של אתנול ולהפוך את תוכן האתנול נמוך יותר ממה שתוכנן (70%). דגימות המאוחסנות 100% אתנול, אלכוהול denatured, 75%-90% איזופרופנול או אלכוהול שפשוף גם הביאו ריצוף גנום שלם מוצלח באמצעות פרוטוקול ניימן ואח'1, וצפוי כי פרוטוקול זה יבצע באותה מידה. פרוטוקול מיצוי DNA המתואר כאן נוסה גם על דגימות מאוחסנות יבש בסיליקה קפוא ב -20 °C (50 °F). עם זאת, היה סיכוי גבוה יותר (15%-30%) לכישלון כאשר מאוחסן במשך >6-12 חודשים, דבר המצביע על כך אלה היו פחות תנאי אחסון אידיאליים.
כמו מיצוי DNA ללא הפרעה מדגם פיזי יש סיכוי גבוה יותר לכישלון (33%)1, פרוטוקול זה משלב טכניקת הפרעה פיזית ידנית (שלב 2.5). הפרעה מדגם ניתן להשיג גם באמצעות חרוזי פלדה על מכשיר תמה רקמה1.
ריאגנטים ועלות מתכלה עבור מיצוי DNA באמצעות פרוטוקול זה דומה עם שיטות חילוץ אחרות זמין(טבלה 1). עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן אינו דורש מכשיר מיצוי DNA אוטומטי. בשל עבודת כפיים המעורבת בעיבוד מיצוי DNA, אדם אחד יכול בדרך כלל לעבד 12-16 דגימות ולסיים עם כימות DNA ביום. זה פחות באופן משמעותי ממה שהגדרת מיצוי DNA אוטומטית יכולה לעבד ביום. לכן, בעת בחירת פרוטוקול, יש לקחת בחשבון את יכולת העיבוד לדוגמה. עם זאת, סף העלות הנמוכה יותר שפרוטוקול זה מציע אמור לאפשר למעבדות ומחקרים רבים המוגבלים במשאבים למנף בטכנולוגיית ריצוף תפוקה גבוהה.
הן ב- Nieman et al.1 והן בפרוטוקול זה, ניתן להחליף את מאגר ה- elution במאגר TE טיפוסי, ב- 10 מ"מ Tris-Cl או במים בהתאם לניתוח במורד הזרם. מאגר חמקמק המכיל EDTA מסוים עשוי להשפיע על יעילות האנזים. פרוטוקולי הכנה אופייניים לספריית gDNA מבוססי גיזמטיות כוללים פתרונות מיזוג או משפרים שנוספו כדי לפצות על עיכוב אנזימים על ידי EDTA. כמו כן יש לקחת בחשבון כי EDTA עשוי לשנות את הספיגה 230 ננומטר אורך גל11. לדוגמה, ריכוזים גבוהים יותר של EDTA ייצרו ערך ספיגה גבוה יותר בין אורך גל של 220-240 ננומטר מזה המוצג באיור 1 (הנתונים אינם מוצגים).
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות למעבדות עם כלים ביולוגיים מולקולריים מינימליים. הפרוטוקול המתואר כאן מנסה להפחית את סף העלות הקשורים להפקת גנום ובכך להגדיל את היישום של רצף תפוקה גבוהה למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים בתמיכה במימון מרכז המצוינות האזורי דרום מערב האוקיינוס השקט למחלות המועברות בווקטורים הממומן על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב (הסכם שיתוף פעולה 1U01CK000516), מענק ה- CDC NU50CK0000420-04-04, המכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות של USDA (פרויקט הצוהר 1025565), מלגת המעבדה לאנטומולוגיה רפואית UF / IFAS פלורידה לטס-יו צ'ן, NSF CAMTech IUCRC שלב II מענק (AWD05009_MOD0030) ופלורידה מחלקת הבריאות (חוזה CODQJ). הממצאים והמסקנות במאמר זה הם אלה של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיו של שירות הדגים וחיות הבר של ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
