Summary
Здесь описан протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков для получения высококачественной экстракции ДНК от комаров. Эти извлечения подходят для последующего подхода к секвенированию следующего поколения.
Abstract
Недавно опубликованный протокол экстракции ДНК с использованием магнитных шариков и автоматизированного инструмента экстракции ДНК предположил, что можно извлечь высококачественную и количественную ДНК из хорошо сохранившегося отдельного комара, достаточного для последующего секвенирования всего генома. Тем не менее, зависимость от дорогостоящего автоматизированного инструмента для извлечения ДНК может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Здесь исследование предоставляет бюджетный протокол экстракции ДНК на магнитной основе, который подходит для низкой и средней пропускной способности. Протокол, описанный здесь, был успешно протестирован с использованием отдельных образцов комаров Aedes aegypti. Снижение затрат, связанных с высококачественной экстракцией ДНК, увеличит применение высокопроизводительного секвенирования в лабораториях и исследованиях с ограниченными ресурсами.
Introduction
Недавняя разработка улучшенного протокола экстракции ДНК1 позволила пролить много высокоэффективных последующих исследований, включающих секвенирование всего генома2,3,4,5,6. Этот протокол экстракции ДНК на основе магнитных шариков обеспечивает надежный выход ДНК из отдельных образцов комаров, что, в свою очередь, снижает стоимость и время, связанные с приобретением достаточного количества образцов из полевых коллекций.
Последние достижения в популяции и ландшафтной геномике напрямую связаны со снижением затрат на секвенирование всего генома. Хотя предыдущий протокол экстракции ДНК1 повышает эффективность, связанную с высокопроизводительный секвенированием, небольшие лаборатории / исследования без средств могут отказаться от использования этих новых мощных инструментов ландшафтной и популяционной геномики из-за затрат на внедрение протокола (например, затраты на специализированные инструменты).
Здесь представлен модифицированный протокол экстракции ДНК, который использует аналогичную магнитную ступень экстракции шариков, как Neiman et al.1, для получения ДНК высокой чистоты, но не полагается на дорогостоящие инструменты для лизиса тканей и экстракции ДНК. Этот протокол подходит для экспериментов, требующих >10 нг высококачественной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общее хранение образцов и подготовка перед извлечением ДНК
- Гидратировать образец в воде ПЦР-класса 100 мкл в течение 1 ч (или на ночь) при 4 °C, если образец хранился в >70% спирте для размягчения ткани.
2. Нарушение выборки
- Установите инкубатор или встряхивательный тепловой блок при 56 °C.
- Производят смесь буфера и фермента протеиназы K (PK). Для каждой отдельной экстракции комара требуется 2 мкл протеиназы К (100 мг/мл) и 98 мкл буфера протеиназы К (всего 100 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких образцов, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 15%, чтобы обеспечить наличие достаточного объема.
- Если образцы были гидратированы перед извлечением, выбросьте воду из каждой пробы.
- В микроцентрифужную трубку 1,5 мл, содержащую ткань комара, добавьте 100 мкл смеси буфера и фермента ПК.
- Гомогенизируйте ткань с помощью микроцентрифуги трубчатого пестикла.
- Центрифугировать образцы в течение 1 мин при 9 600 х г при комнатной температуре.
- Инкубировать образец в течение 2-3 ч при 56 °C.
- Во время инкубации подготовьте другие реагенты, используя этап экстракции ДНК (этап 3).
3. Извлечение ДНК
- Сделайте магнитный бисероплетение. Для каждого образца смешайте 100 мкл лизисного буфера, 100 мкл изопропанола и 15 мкл магнитных шариков (всего 215 мкл). Чтобы приготовить мастер-микс для нескольких реакций, увеличьте общее количество (объединенное для всех отдельных образцов) на ~ 20%, чтобы обеспечить наличие адекватного объема.
- По истечении времени инкубации (этап 2.7) перенесите каждый лизат в чистую микроцентрифужную трубку или микропластинку с помощью пипетки.
- Добавьте 100 мкл лиазата и 215 мкл магнитной бисероплетительной смеси в каждый образец.
- Используйте пипетку, чтобы хорошо перемешать ее в течение 10-20 с, а затем дайте ей постоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно время от времени встряхивайте трубку, чтобы максимизировать связывание магнитных шариков и ДНК.
- Поместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
- Выбросьте жидкость из трубки/пластины с помощью пипетки. При удалении супернатанта старайтесь не трогать и не беспокоить магнитные шарики, удерживающие ДНК.
- Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 325 мкл промывного буфера 1 в каждую скважину.
- Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаги 3.5–3.6.
- Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 1 к каждой скважине.
- Тщательно перемешать путем пипетки и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаги 3.5–3.6.
- Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывочного буфера 2 к каждому образцу.
- Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаги 3.5–3.6.
- Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 250 мкл промывного буфера 2 к каждой скважине.
- Тщательно перемешать и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаги 3.5–3.6.
- Отодвинуть трубку/пластину от магнитного сепаратора шариков и добавить 100 мкл буфера элюдения в каждую скважину.
- Тщательно перемешать и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Переместите трубку/пластину на магнитный сепаратор шариков и подождите, пока раствор не очистится.
- Пипетка супернатанта в новую чистую 0,5 микроцентрифужную трубку или микропластинку.
- Храните образцы ДНК при 4 °C (до 1 недели) или -80 °C. Если используется микропластиня, накройте ее парапленкой.
- Определите выход ДНК с помощью любого подходящего метода.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались показания и поглощение флуорометра ДНК при 260/280 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Средний выход ДНК на отдельную голову комара / ткань грудной клетки составил 4,121 нг / мкл (N = 92, стандартное отклонение 3,513), измеренный с использованием флуорометра при элюировании с использованием 100 мкл буфера элюации. Этого достаточно для входных требований геномной ДНК в 10-30 нг, необходимых для построения библиотеки всего генома1,7. Количество ДНК может варьироваться в диапазоне 0,3-29,7 нг/мкл в зависимости от размера тела комара и условий сохранения. Некоторая высокая изменчивость обусловлена характеристикой магнитных шариков, используемых в исследовании. Различные марки магнитных шариков могут производить более последовательные концентрации, как указано в предыдущем докладе1. Следует также отметить, что различные виды комаров различаются по размеру и что выход ДНК зависит от этих индивидуальных и видовых размерных диапазонов. Если концентрация ДНК ниже типичных диапазонов, можно скорректировать инкубационный период в реакции протеиназы К (этап 2.7), но это расширение должно быть не дольше 16 ч. Кроме того, переключение брендов протеиназы K и/или буфера лизиса может оказать значительное влияние на выход ДНК1.
Типичные показания микрообойного флуорометра конечной ДНК в буфере элюирования с ЭДТА 0,5 мМ показаны на рисунке 1. Средний коэффициент поглощения для 260/280 нм составил 2,3 (стандартное отклонение = 0,071). Данные были согласованы с образцами, используемыми в предыдущих исследованиях для секвенирования всего генома3,4.
Типичная стоимость реагента и расходных материалов для экстракции составляет около 9,50 долларов США за образец. Эти оценки стоимости включают реагенты, перечисленные в Таблице материалов,и другие расходные материалы, такие как наконечники пипеток, трубки и перчатки, необходимые для экстракции. Стоимость реагента и расходных материалов эквивалентна любому типичному методу экстракции на магнитной основе(таблица 1). Стоимость может несколько варьироваться в зависимости от скидок на оптовую покупку, доступных для любого данного продукта. Основная экономическая выгода этого протокола связана с тем, что он не требует автоматизированного инструмента извлечения ДНК.
Рисунок 1:Выход флуорометра. Типичный выход ДНК флуорометра ДНК комара элюируется в буфере элюации с ЭДТА 0,5 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Анализ затрат для различных методов добычи. В таблице перечислены затраты и количество образцов, обработанных за один рабочий день для разных методов экстракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для других видов насекомых. Первоначальная версия протокола, представленная в Nieman et al.1, была протестирована на нескольких видах, включая Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta и Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Ожидается, что этот протокол будет работать как для этих, так и для других членистоногих.
В идеале образцы должны храниться в 70-80% этаноле при 4 °C до экстракции ДНК. Как правило, 80% этанола используется для хранения образцов комаров в Африке. Высокие температурные условия могут ускорить испарение этанола и сделать содержание этанола ниже, чем предполагалось (70%). Образцы, хранящиеся в 100% этаноле, денатурированном спирте, 75%-90% изопропаноле или спирте для растирания, также привели к успешному секвенированию всего генома с использованием протокола Nieman et al.1, и ожидается, что этот протокол будет работать одинаково хорошо. Описанный здесь протокол экстракции ДНК также был опробован на образцах, хранящихся в сухом виде в кремнеземе и замороженных при -20 °C. Тем не менее, была более высокая (15%-30%) вероятность отказа при хранении в течение >6-12 месяцев, что говорит о том, что это были не идеальные условия хранения.
Поскольку извлечение ДНК без разрушения физического образца имеет более высокую вероятность отказа (33%)1,этот протокол включает в себя метод ручного физического разрушения (шаг 2.5). Разрушение образца также может быть достигнуто с использованием стальных шариков на инструменте лизисаткани 1.
Стоимость реагентов и расходных материалов для экстракции ДНК с использованием этого протокола сопоставима с другими доступными методами экстракции(таблица 1). Однако протокол, описанный здесь, не требует автоматизированного инструмента извлечения ДНК. Из-за ручного труда, участвующего в обработке извлечения ДНК, один человек обычно может обработать 12-16 образцов и закончить с количественной оценкой ДНК в день. Это значительно меньше, чем то, что автоматизированная установка экстракции ДНК может обрабатывать в день. Таким образом, при выборе протокола следует учитывать мощность обработки проб. Однако более низкий порог стоимости, который предлагает этот протокол, должен позволить многим лабораториям и исследованиям с ограниченными ресурсами использовать технологию секвенирования с высокой пропускной способностью.
Как в Nieman et al.1, так и в этом протоколе буфер элюирования может быть заменен типичным буфером TE, 10 мМ Tris-Cl, или водой в зависимости от последующего анализа. Буфер элюирования, содержащий некоторое эдта, может влиять на эффективность ферментов. Типичные протоколы подготовки библиотеки гДНК на основе ферментативной сдвиги включают кондиционирующие растворы или энхансеры, добавленные для компенсации ингибирования ферментов ЭДТА. Следует также учитывать, что ЭДТА может изменять поглощение на длине волны 230 нм11. Например, более высокие концентрации ЭДТА создадут более высокое значение поглощения между длиной волны 220-240 нм, чем показано на рисунке 1 (данные не показаны).
Этот протокол может быть легко адаптирован к лабораториям с минимальными инструментами молекулярной биологии. Описанный здесь протокол пытается снизить пороговые значения затрат, связанные с извлечением генома, и тем самым увеличить применение высокопроизводительного секвенирования в лабораториях и исследованиях с ограниченными ресурсами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем финансовую поддержку со стороны Тихоокеанского юго-западного регионального центра передового опыта по трансмиссивным заболеваниям, финансируемого Центрами США по контролю и профилактике заболеваний (Соглашение о сотрудничестве 1U01CK000516), грантОМ CDC NU50CK00420-04-04, Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (проект Хэтча 1025565), стипендией UF / IFAS Флоридской медицинской энтомологической лаборатории Це-Ю Чен, грантом NSF CAMTech IUCRC Фаза II (AWD05009_MOD0030) и Департаментом здравоохранения Флориды (контракт CODQJ). Выводы и заключения в этой статье являются выводами автора (авторов) и не обязательно отражают точку зрения Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
