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Biology

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62354

Summary

Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Abstract

Un protocolo de extracción de ADN recientemente publicado utilizando perlas magnéticas y un instrumento automatizado de extracción de ADN sugirió que es posible extraer ADN de alta calidad y cantidad de un mosquito individual bien conservado suficiente para la secuenciación del genoma completo aguas abajo. Sin embargo, la dependencia de un costoso instrumento automatizado de extracción de ADN puede ser prohibitiva para muchos laboratorios. Aquí, el estudio proporciona un protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico, que es adecuado para un rendimiento bajo a medio. El protocolo descrito aquí se probó con éxito utilizando muestras individuales de mosquitos Aedes aegypti. Los costos reducidos asociados con la extracción de ADN de alta calidad aumentarán la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.

Introduction

El desarrollo reciente de un protocolo mejorado de extracción de ADN1 ha permitido muchos estudios posteriores de alto impacto que involucran la secuenciación delgenoma completo2,3,4,5,6. Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas proporciona un rendimiento de ADN confiable de muestras individuales de mosquitos, lo que a su vez reduce el costo y el tiempo asociados con la adquisición de un número suficiente de muestras de colecciones de campo.

Los avances recientes en la genómica de la población y el paisaje están directamente correlacionados con la disminución de los costos de la secuenciación del genoma completo. Aunque el protocolo de extracción de ADN1 anterior aumenta las eficiencias asociadas con la secuenciación de alto rendimiento, los laboratorios / estudios más pequeños sin los fondos pueden optar por no usar estas nuevas y poderosas herramientas de genómica de poblaciones y paisajes debido a los costos de implementación del protocolo (por ejemplo, los costos de los instrumentos especializados).

Aquí, se presenta un protocolo de extracción de ADN modificado que utiliza un paso de extracción de perlas magnéticas similar al de Neiman et al.1 para obtener ADN de alta pureza, pero no depende de instrumentos de alto costo para la lisis tisular y la extracción de ADN. Este protocolo es adecuado para experimentos que requieren >10 ng de ADN de alta calidad.

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Protocol

1. Almacenamiento general de muestras y preparados antes de la extracción de ADN

  1. Hidratar la muestra en 100 μL de agua de grado PCR durante 1 h (o durante la noche) a 4 °C si la muestra se ha almacenado en alcohol >70% para ablandar el tejido.

2. Interrupción de la muestra

  1. Establezca una incubadora o un bloque de calor de agitación a 56 °C.
  2. Haga la mezcla del almacenador intermediario/de la enzima de la proteinasa K (PK). Se requieren 2 μL de proteinasa K (100 mg/mL) y 98 μL de tampón de proteinasa K (total 100 μL) para cada extracción individual de mosquitos. Para preparar una mezcla maestra para múltiples especímenes, aumente la cantidad total (combinada para todos los especímenes individuales) en ~ 15% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.
  3. Si las muestras se hidrataron antes de la extracción, deseche el agua de cada tubo de muestra.
  4. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga tejido de mosquito, agregue 100 μL de tampón PK/mezcla de enzimas.
  5. Homogeneizar el tejido usando el tubo de microcentrífuga pestle.
  6. Centrifugar las muestras durante 1 min a 9.600 x g a temperatura ambiente.
  7. Incubar la muestra durante 2-3 h a 56 °C.
  8. Durante la incubación, prepare los otros reactivos utilizando la etapa de extracción de ADN (paso 3).

3. Extracción de ADN

  1. Hacer una mezcla maestra de cuentas magnéticas. Para cada muestra, mezcle 100 μL de tampón de lisis, 100 μL de isopropanol y 15 μL de perlas magnéticas (total 215 μL). Para preparar una mezcla maestra para múltiples reacciones, aumente la cantidad total (combinada para todas las muestras individuales) en ~ 20% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.
  2. Después del tiempo de incubación (paso 2.7), transferir cada lisato a un tubo de microcentrífuga limpio o a un pozo de microplacas utilizando pipeta.
  3. Agregue 100 μL de lisato y 215 μL de la mezcla maestra de perlas magnéticas a cada muestra.
  4. Use una pipeta para mezclarla bien durante 10-20 s y luego déjela reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agite suavemente el tubo de vez en cuando para maximizar la unión de las perlas magnéticas y el ADN.
  5. Coloque el tubo/placa en el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.
  6. Deseche el líquido del tubo/placa usando pipeta. Al retirar el sobrenadante, trate de no tocar ni perturbar las perlas magnéticas que sostienen el ADN.
  7. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 325 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.
  8. Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
  9. Repita los pasos 3.5-3.6.
  10. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.
  11. Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
  12. Repita los pasos 3.5-3.6.
  13. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada muestra.
  14. Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
  15. Repita los pasos 3.5-3.6.
  16. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada pozo.
  17. Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
  18. Repita los pasos 3.5-3.6.
  19. Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 100 μL de tampón de elución a cada pozo.
  20. Mezclar bien e incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
  21. Mueva el tubo/placa sobre el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.
  22. Pipetee el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga limpia de 0,5 o un pozo de microplaca.
  23. Almacene las muestras de ADN a 4 °C (hasta 1 semana) o -80 °C.  Si se está utilizando una microplaca, cúbrala con parafilm.
  24. Determine los rendimientos de ADN utilizando cualquier método apropiado.
    NOTA: En este estudio, la lectura y la absorbancia del fluorómetro de la DNA en 260/280 nanómetro fueron utilizadas.

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Representative Results

El rendimiento promedio de ADN por cabeza de mosquito individual/tejido de tórax fue de 4.121 ng/μL (N = 92, desviación estándar 3.513) medido usando un fluorómetro cuando se elutía usando 100 μL de tampón de elución. Esto es suficiente para los requisitos de entrada de ADN genómico de 10-30 ng necesarios para la construcción de la biblioteca del genoma completo1,7. La cantidad de ADN puede variar entre 0.3-29.7 ng/μL dependiendo del tamaño corporal del mosquito y las condiciones de preservación. Parte de la alta variabilidad se debe a la característica de las perlas magnéticas utilizadas en el estudio. Las diferentes marcas de perlas magnéticas pueden producir concentraciones más consistentes, como se indicó en el informe anterior1. También debe tenerse en cuenta que las diferentes especies de mosquitos difieren en tamaño y que el rendimiento de ADN depende de esos rangos de tamaño individuales y de especies. Si la concentración de ADN está por debajo de los rangos típicos, se puede ajustar el período de incubación en la reacción de la proteinasa K (paso 2.7), pero esta extensión no debe ser mayor que 16 h. Por otra parte, cambiar las marcas de proteínaasa K y/o tampón de lisis puede tener un impacto significativo en el rendimiento de ADN1.

La lectura típica del fluorómetro de microvolumen del ADN final en tampón de elución con EDTA de 0,5 mM se muestra en la Figura 1. La relación de absorbancia promedio para 260/280 nm fue de 2,3 (desviación estándar = 0,071). Los datos fueron consistentes a partir de las muestras utilizadas en los estudios previos para la secuenciación del genoma completo3,4.

El costo típico de reactivos y consumibles para la extracción es de alrededor de $ 9.50 / muestra. Estas estimaciones de costos incluyen reactivos enumerados en la Tabla de materialesy otros consumibles como puntas de pipeta, tubos y guantes necesarios para la extracción. El costo del reactivo y del consumible es equivalente a cualquier método típico de extracción basado en perlas magnéticas (Tabla 1). El costo puede variar un poco dependiendo de los descuentos de compra a granel disponibles para cualquier producto dado. El mayor costo beneficio de este protocolo proviene de no requerir el instrumento automatizado de extracción de ADN.

Figure 1
Figura 1:Salida del fluorómetro. Salida típica del fluorómetro de la DNA de la DNA eluted en almacenador intermediario de la elución con 0.5 milímetros EDTA. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Tabla 1: Análisis de costes para diferentes métodos de extracción. La tabla enumera los costos y el número de muestras procesadas en un día hábil para diferentes métodos de extracción. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

El protocolo descrito aquí se puede adaptar para otras especies de insectos. La versión original del protocolo introducido en Nieman et al.1 ha sido probada en múltiples especies, incluyendo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, y Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Se espera que este protocolo funcione para estos y otros artrópodos.

Idealmente, las muestras deben almacenarse en etanol al 70%-80% a 4 °C antes de la extracción de ADN. Por lo general, el etanol al 80% se utiliza para almacenar muestras de mosquitos en África. Las condiciones de alta temperatura podrían acelerar la evaporación del etanol y hacer que el contenido de etanol sea más bajo de lo que se pretende (70%). Las muestras almacenadas en etanol al 100%, alcohol desnaturalizado, isopropanol al 75%-90% o alcohol de frotamiento también han dado lugar a una secuenciación exitosa del genoma completo utilizando el protocolo Nieman et al.1, y se espera que este protocolo funcione igual de bien. El protocolo de extracción de ADN descrito aquí también se ha probado en muestras almacenadas secas en sílice y congeladas a -20 °C. Sin embargo, hubo una mayor probabilidad (15%-30%) de fracaso cuando se almacenó durante >6-12 meses, lo que sugiere que estas fueron menos que las condiciones de almacenamiento ideales.

Como la extracción de ADN sin interrupción de la muestra física tiene una mayor probabilidad de fallo (33%)1,este protocolo incorpora una técnica manual de interrupción física (paso 2.5). La interrupción de la muestra también se puede lograr utilizando perlas de acero en un instrumento de lisis tisular1.

El costo de los reactivos y consumibles para la extracción de ADN utilizando este protocolo es comparable con otros métodos de extracción disponibles (Tabla 1). Sin embargo, el protocolo descrito aquí no requiere un instrumento automatizado de extracción de ADN. Debido al trabajo manual involucrado en el procesamiento de la extracción de ADN, una persona normalmente puede procesar 12-16 muestras y terminar con la cuantificación de ADN en un día. Esto es significativamente menor que lo que la configuración de extracción automatizada de ADN puede procesar por día. Por lo tanto, al elegir un protocolo, se debe tener en cuenta la capacidad de procesamiento de la muestra. Sin embargo, el umbral de costo más bajo que ofrece este protocolo debería permitir que muchos laboratorios y estudios de recursos limitados aprovechen la tecnología de secuenciación de alto rendimiento.

Tanto en el Nieman et al.1 como en este protocolo, el tampón de elución se puede reemplazar con el tampón te típico, 10 mM Tris-Cl, o agua dependiendo del análisis aguas abajo. Un tampón de elución que contiene algo de EDTA puede afectar la eficiencia de la enzima. Los protocolos típicos de preparación de la biblioteca de gDNA basados en cizallamiento enzimáticos incluyen soluciones de acondicionamiento o potenciadores agregados para compensar la inhibición enzimática por EDTA. También debe considerarse que EDTA puede cambiar la absorbancia a 230 nm de longitud de onda11. Por ejemplo, concentraciones más altas de EDTA crearían un valor de absorbancia más alto entre 220-240 nm de longitud de onda que el que se muestra en la Figura 1 (datos no mostrados).

Este protocolo se puede adaptar fácilmente a laboratorios con herramientas mínimas de biología molecular. El protocolo descrito aquí intenta reducir los umbrales de costo asociados con la extracción del genoma y, por lo tanto, aumentar la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos el apoyo financiero del Centro Regional de Excelencia para Enfermedades Transmitidas por Vectores del Suroeste del Pacífico financiado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (Acuerdo de Cooperación 1U01CK000516), la subvención nu50CK000420-04-04 del CDC, el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA (proyecto Hatch 1025565), la beca del Laboratorio de Entomología Médica de Florida de la UF/IFAS para Tse-Yu Chen, la subvención NSF CAMTech IUCRC Fase II (AWD05009_MOD0030) y el Departamento de Salud de Florida (Contrato CODQJ). Los hallazgos y conclusiones de este artículo son los de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AE Buffer Qiagen 19077 Elution buffer
AL Buffer Qiagen 19075 Lysis buffer
AW1 Buffer Qiagen 19081 Washing buffer 1
AW2 Buffer Qiagen 19072 Washing buffer 2
MagAttract Suspension G Qiagen 1026901 magnetic bead
Magnetic bead separator Epigentek Q10002-1
Nanodrop ThermoFisher ND-2000 microvolume spectrophotometer
PK Buffer ThermoFisher 4489111 Proteinase K buffer
Proteinase K ThermoFisher A25561
Qubit Invitrogen Q33238 fluorometer

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References

  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

Tags

Biología Número 170 Extracción de ADN mosquito insecto
Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación
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Cite this Article

Chen, T. Y., Vorsino, A. E.,More

Chen, T. Y., Vorsino, A. E., Kosinski, K. J., Romero-Weaver, A. L., Buckner, E. A., Chiu, J. C., Lee, Y. A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (170), e62354, doi:10.3791/62354 (2021).

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