Her presenterer vi en protokoll for kryogen prøvepreparering og overføring av krystaller til vakuumsluttstasjonen på beamline I23 ved Diamond Light Source, for makromolekylære røntgenkrystallografieksperimenter med lang bølgelengde.
Langbølgelengde makromolekylær krystallografi (MX) utnytter de uregelmessige spredningsegenskapene til elementer, som svovel, fosfor, kalium, klor eller kalsium, som ofte er innfødt til stede i makromolekyler. Dette muliggjør direkte strukturløsning av proteiner og nukleinsyrer via eksperimentell fasing uten behov for ytterligere merking. For å eliminere den betydelige luftabsorpsjonen av røntgenstråler i dette bølgelengderegimet, utføres disse forsøkene i et vakuummiljø. Beamline I23 hos Diamond Light Source, Storbritannia, er det første synkrotroninstrumentet i sitt slag, designet og optimalisert for MX-eksperimenter i det lange bølgelengdeområdet mot 5 Å.
For å gjøre dette mulig omslutter et stort vakuumfartøy alle endstationkomponenter i prøvemiljøet. Nødvendigheten av å opprettholde prøver ved kryogeniske temperaturer under lagring og datainnsamling i vakuum krever bruk av termisk ledende prøveholdere. Dette muliggjør effektiv varmefjerning for å sikre prøvekjøling til ca. 50 K. Gjeldende protokoll beskriver prosedyrene som brukes for prøvepreparering og overføring av prøver til vakuum på bjelkelinje I23. For å sikre ensartethet i praksis og metoder som allerede er etablert i det makromolekylære krystallografisamfunnet, kan prøvekjøling til flytende nitrogentemperatur utføres i alle laboratorieinnstillinger utstyrt med standard MX-verktøy.
Kryogen lagring og transport av prøver krever bare standard kommersielt tilgjengelig utstyr. Spesialisert utstyr er nødvendig for overføring av kryogenisk avkjølte krystaller fra flytende nitrogen til vakuumendenstasjonen. Skreddersydde prøvehåndteringsverktøy og et dedikert kryogent overføringssystem (CTS) er utviklet internt. Diffraksjonsdata samlet inn på prøver utarbeidet ved hjelp av denne protokollen viser utmerket sammenslåingsstatistikk, noe som indikerer at kvaliteten på prøvene er uendret under prosedyren. Dette åpner unike muligheter for in-vacuum MX i et bølgelengdeområde utover standard synkrotronbjelker.
Røntgendiffraksjon med lang bølgelengde brukes til å utnytte de uregelmessige spredningsegenskapene til spesifikke lysatomer som er innfødt tilstede i makromolekyler. Dette bidrar til å løse det krystallografiske faseproblemet og å entydig bekrefte identiteten og plasseringen av slike elementer innen makromolekyler. Mens i de tidlige dagene av makromolekylær krystallografi, de novo strukturer ble løst ved flere isomorfe erstatning1, med advent av justerbare røntgen strålelinjer på synkrotroner, eksperimentell fasing basert på multi-bølgelengde og en-bølgelengde (SAD) uregelmessige diffraksjonsteknikker har blitt de dominerende metodene2 . Begge metodene har historisk stolt på det isomorfe eller uregelmessige signalet fra tungmetaller, som må kunstig introduseres i krystallene ved co-krystallisering eller krystall soaking3. Prøve-og-feil-tilnærmingen og det uforutsigbare resultatet kan gjøre disse eksperimentene frustrerende tidkrevende. Inkorporering av seleno-metionin under proteinuttrykk4 er en veldig elegant måte å overvinne disse begrensningene og utnytte uregelmessig diffraksjon ved korte bølgelengder, selv om det kan være svært utfordrende i eukaryote proteinuttrykkssystemer.
Langbølgelengde MX er ekstremt tiltalende for strukturbestemmelse ved innfødte SAD-eksperimenter5,6 på grunn av bekvemmeligheten av å bruke krystaller direkte fra en vellykket krystalliseringsstudie uten videre behandling. I tillegg åpner tilgang til absorpsjonskantene av elementer av høy biologisk betydning, som kalsium, kalium, klor, svovel og fosfor, muligheten til å identifisere posisjonene til disse elementene direkte i makromolekyler7,8,9,10. Ved middels og lav oppløsning kan elementoppgave basert på 2Fo-Fc elektrontetthet og kjemisk miljø være vanskelig, spesielt for elementer med lignende antall elektroner eller svakt bundne ioner med delvis belegg. Disse tvetydighetene kan løses ved å samle inn data under og over absorpsjonskanten av elementet av interesse og tolkning av den resulterende modellfasede uregelmessige forskjellen Fourier kart11,12. Plassering av svovelatomer i disse kartene kan også hjelpe modellbygging til lavoppløselige elektrontetthetskart13. Absorpsjonskantene til disse lyselementene observeres ved bølgelengder mellom λ = 3 og 6 Å (se figur 1, topp). Dette bølgelengdeområdet har vært langt utover mulighetene til enhver synkrotron MX-strålelinje, og effektiv drift i dette området krever å overvinne flere tekniske utfordringer, som beskrevet nedenfor.
Beamline I23 hos Diamond Light Source, Storbritannia, er et unikt instrument, spesielt designet for å lette MX-eksperimenter med lang bølgelengde, justerbar i et bølgelengdeområde mellom λ = 1,13 og 5,9 Å (energiområde mellom E = 2,1 og 11 keV). Ved å operere i et høyvakuummiljø14 elimineres luftabsorpsjon og spredning, og dermed forbedre effektiviteten til diffraksjonseksperimenter og signal-til-støy-forholdet. En stor vakuum-endestasjon omslutter alle komponentene i prøvemiljøet, inkludert den halvsylindriske Pilatus 12M-detektoren, et multiakse-goniometer, online visnings- og sammenlikningssystemer, samt skreddersydd utstyr for prøveoverføring og lagring (figur 2). Hvert utstyr er optimalisert for å sikre at langbølgelengdedataene av beste kvalitet kan samles inn. Den buede Pilatus 12M-detektoren kan samle seg til diffraksjonsvinkler på 2θ = ±100°, noe som resulterer i tilstrekkelig høyoppløselige diffraksjonsdata selv ved lengste bølgelengder (figur 1, bunn). De 120 detektormodulene er spesielt valgt for lavenergikompatibilitet, og kalibreringer for en ekstra ultrahøy forsterkningsmodus er gitt.
Den lavest mulige detektorterskelen er 1,8 keV, noe som fører til økte hjørne- og kanteffekter for energier lavere enn 3,6 keV og kompromittert datakvalitet ved de lengste bølgelengdene, spesielt for krystaller med lav mosaikk, kan observeres. Denne effekten i kombinasjon med reduksjonen i detektorens kvanteeffektivitet15 må tas i betraktning ved planlegging av et eksperiment. Goniometeret med flere akser gjør det mulig å reorientere krystaller for å muliggjøre datainnsamlingsstrategier som maksimerer kvaliteten og styrken til det uregelmessige signalet, samt fullstendigheten av de uregelmessige dataene som samles inn. Prøveabsorpsjon er en begrensende faktor for forsøkene, spesielt ved lengste bølgelengder. Absorpsjonskorreksjoner, som implementert i ofte brukte MX-prosesseringsprogramvarepakker16,17, fungerer godt for å bølgelengder rundt 3 Å. Lengre bølgelengder vil kreve analytiske absorpsjonskorreksjoner basert på tomografiske rekonstruksjoner18 eller laserablasjon for å fjerne ikke-diffracting materiale og kutte krystallene i veldefinerte former19. Sistnevnte vil også bidra til å redusere størrelsen på større krystaller ettersom røntgendiffraksjonseksperimenter ved lengre bølgelengder er mer effektive for mindre krystaller14. Utfordringen med å holde prøver ved kryogeniske temperaturer under datainnsamling adresseres ved ledende kjøling, da bruk av kaldt gassstrømsenheter med åpen strømning ikke er kompatibelt med et vakuummiljø. Derfor er termisk ledende materialer, som kobber, nødvendig for å koble prøven til en pulsrørkryoooler. SPINE-standardpinnene i rustfritt stål som brukes i hele MX, samt andre kommersielt tilgjengelige prøvefester, er ikke egnet for MX med lang bølgelengde i vakuum på grunn av dårlig termisk ledningsevne.
Prøveholderne (SH-ene) for in-vacuum MX må være en viktig del av varmefjerningsbanen (figur 3A). Som sådan består de av en termisk ledende kobberkropp og pinne og inkluderer to viktige funksjoner: en sterk magnetbase for å sikre en tilstrekkelig termisk kobling til det kalde goniometerhodet, og en prøvemontering, laget av polyimid, for å minimere røntgenabsorpsjon og spredning20. Det ble gjort en innsats for å sikre at brukeropplevelsen av krystallhøsting og blitskjøling er nesten identisk med den som er forbundet med standard MX-praksis. Siden de dedikerte I23 SH-ene ikke er direkte kompatible med andre synkrotronstrålelinjer, brukes en adapter i rustfritt stål til kompatibilitet med de krystallhøstingsmagnetiske stavene og eksisterende goniometergrensesnitt på andre MX-bjelkelinjer (figur 3B). Adapteren er også viktig for å benytte automatiseringsanleggene på andre Diamond MX-bjelkelinjer, som er basert på ALS-type robotgriperhoder21 og baseoppsett i unipuck-stil22, hvis prøvevariasjon krever rask forhåndsscreening for valg av de beste diffracting-krystallene. Prøveforberedelses- og lasteprotokollen kan deles inn i to trinn:
Trinn 1: Høsting av krystaller og flash-frysing utført av brukere i egne laboratorier
Etter vurdering av prosjektets egnethet for I23-datainnsamling sendes prøveholdere med løkker som samsvarer med krystallstørrelsene (forhåndsmontert med adaptere) til brukerlaboratorier for krystallhøsting. For å unngå skade, bør SHs og adaptere ikke skilles og skal brukes som en enhet med det formål å fiske krystaller med passende størrelse løkker ved hjelp av standard krystallhøsting magnetiske staver. Som vanlig i MX, utføres denne oppgaven manuelt under mikroskopet, og krystaller blir umiddelbart flashkjølt i en skumdewar med flytende nitrogen23. På grunn av manglende samsvar mellom magnetiske krefter er SH-ene for øyeblikket ikke kompatible med unipucks. Lagring og frakt realiseres ved hjelp av kamipucks (se materialtabellen), som er tilgjengelig for brukere på forespørsel, sammen med kompatible tørrskipsinnsatser (figur 3C). Disse puckene deler den samme grunnplaten med de mye brukte unipucks og tillater rask forhåndsscreening av prøver på andre Diamond MX-bjelker. Å låne ut dette utstyret til brukere er for tiden den beste ordningen, til de skreddersydde prøveholderne er kommersielt tilgjengelige. Transport til bjelkelinjen krever standard tørre avsendere som brukes i MX-samfunnet.
Trinn 2: Overføring av kryokjølte prøver til vakuumendenstasjonen
Når prøvene kommer på strålelinjen, er de forberedt på overføring til vakuumsluttstasjonen. Dette innebærer fjerning av SHs fra kamipucks og separasjon fra adaptere. Innføring av biologiske prøver for vakuum utføres rutinemessig innen kryo-elektronmikroskopi. Noen av de veletablerte konseptene ble tilpasset I23-prøveoverføringen. Kort sagt overføres SH-er under flytende nitrogen til overføringsblokker (figur 3D). Disse blokkene har utmerket termisk ledningsevne og en betydelig termisk masse, og forhindrer krystallene i å nå glassovergangstemperaturen når de er i vakuum. Opptil fire blokker, med en kapasitet på fire prøver hver, lastes under flytende nitrogen i en blokkpuck (figur 3H), som brukes enten til å overføre prøver til Cryogenic Transfer System (CTS) eller for lagring i flytende nitrogendewars mellom eksperimenter.
Cryogenic Transfer System utviklet ved Diamond Light Source består av to undersamlinger, prøvestasjonen og shuttle (figur 4A). Prøvestasjonen består av et flytende nitrogenbad for midlertidig lagring av proteinkrystaller og har spesifikke funksjoner for å sikre sikkerhet og gi en brukervennlig opplevelse (figur 5). CTS styres av en programmerbar logikkkontroller via et brukervennlig berøringsskjermgrensesnitt. Prøvestasjonen har lysemitterende dioder innebygd for bedre visualisering og et sett med varmeovner kontrollert i tett sløyfe for å automatisere tørking av flytende nitrogenbad når prøvene er overført. Den har også en rekke sensorer for å sikre sikkerhet og effektiv funksjon av systemet. Prøvestasjonen har skreddersydd maskinvare for å gi et pålitelig elektrisk grensesnitt for å samhandle med romfergen for operasjoner, for eksempel pumping ned til grovt vakuum for prøveoverføring, samt overvåking av flytende nitrogennivåer og temperaturen inne i romfergen.
Shuttle (figur 6) er en bærbar enhet som brukes til å plukke opp en overføringsblokk fra samplestasjonen flytende nitrogenbad og overføre den inne i et kryogent og vakuummiljø til endestasjonen. Det inkluderer en flytende nitrogen dewar for å holde prøvene kalde under overføring, overvåking av flytende nivå i dewar, og en rekke sensorer for drift og brukersikkerhet. Overføringsarmen er utstyrt med en magnetisk stasjon og inkluderer maskinerte spor for å veilede brukere i sikker lasting og lossing av overføringsblokker inn i endestasjonen. Overføring fra skyttelbussen til vakuumbeholderen utføres via en luftsluse. Luftslusen er et grensesnitt for skyttelbussen på endestasjonen som brukes til å evakuere mellomrommet mellom skyttelbussen og endestasjonen, før du åpner skyttel- og sluttstasjonsvakuumventilene. Pumpe- og ventilasjonssekvensene er helautomatiske og kan betjenes via en stor berøringsskjerm med et brukervennlig grensesnitt (figur 4C). Den nåværende protokollen brukes til å overføre en thaumatinkrystall til vakuumsluttstasjonen for datainnsamling.
Den nåværende protokollen er utviklet for å overholde prøveforberedelseskravene for MX-eksperimenter med lang bølgelengde på strålelinje I23. Den har vært i bruk på bjelkelinjen det siste året og har bidratt til vellykket gjennomføring av flere prosjekter. Som angitt av resultatene som presenteres her, muliggjør protokollen en sikker og pålitelig overføring av prøver til vakuumsluttstasjonen samtidig som deres diffraksjonskvalitet bevares. Det er et viktig aspekt for strålelinjeoperasjonen og vil bli ledsaget av personlig brukeropplæring av beamline-ansatte. Noen av trinnene er verdt å bli fremhevet som kritiske for vellykket og sikker fullføring av prosedyren: overføring av prøver fra kamipuckbaser til prøveblokker krever nøyaktighet og oppmerksomhet for å unngå skadelige prøver (se trinn 2.1.4); overvåking av flytende nitrogennivå i alle stadier er viktig for å forhindre at prøver blir utsatt for luft eller er i nær kontakt med deler som ikke er ordentlig avkjølt (2.1.3 og 2.2.2); vente til Lukkingssekvensen (2.2.14) er helt ferdig, før du fjerner skyttelbussen fra endestasjonen (2.2.15), for å unngå nedbrytning av endestasjonsvakuumet.
Oppfatningen av protokollen ble initiert sammen med en ingeniørinnsats for å utvikle spesialbygget utstyr for overføring av proteinkrystaller til vakuummiljøet. De endelige produktene i dette prosjektet var CTS og de tilhørende prøvehåndteringsverktøyene beskrevet ovenfor. CTS er en betydelig forbedring på forgjengeren, Leica EM VCT10014, og fjerner flere begrensninger, for eksempel mangel på prøveskjerming og vakuummiljø under overføring, isoppbygging inne i det flytende nitrogenbadet og fraværet av et intuitivt brukergrensesnitt og sikkerhetsfunksjoner. Ytterligere funksjoner i CTS som forbedrer brukeropplevelsen er overvåking av temperatur og flytende nitrogennivå inne i skyttel- og prøvestasjonen, et bad med større kapasitet som imøtekommer fire blokker samtidig, i stedet for en, og en selvstyrt mekanisme for skytteloperasjonen. CTS er fullt integrert i strålelinjekontrollsystemet med et brukervennlig berøringsskjermgrensesnitt og forbedret vakuum og mekanisk sikkerhet ved grensesnitt med endestasjonen.
Beamline I23 er det første langbølgelengde MX-synkrotroninstrumentet i sitt slag, og som sådan har det krevd betydelig innsats å introdusere proteinkrystaller til et høyvakuummiljø og lagre dem ved kryogeniske temperaturer. Forbedringer av prøveforberedelsesverktøyene og protokollen, samt innsats for å effektivisere prosesser, pågår. Som en del av brukerstøtten er beamlinepersonalet alltid tilgjengelig for å hjelpe deg med feilsøking. Et eksempel på et slikt scenario vil være problemer som kompromitterer integriteten til vakuumsystemet, noe som fører til vanskeligheter med å feste eller fjerne skyttelbussen til / fra enten CTS- eller sluttstasjonsluftslusen. Ulike nivåer av tester utføres på ukentlig og daglig basis, og brukeropplæring vil dekke ytterligere kontroller for å unngå potensielle feil, som visuell inspeksjon av O-ringene på grensesnittene skyttelbussen kobles til. Mens vakuummiljøet åpner muligheten til å utføre diffraksjonseksperimenter i et bølgelengdeområde som ikke er tilgjengelig ved andre bjelkelinjer, reduserer det ekstra overføringstrinnet den totale prøvegjennomstrømningen.
Den manuelle overføringen med bare fire prøver per overføringsblokk og opptil fem blokker inne i vakuumbeholderen begrenser den totale kapasiteten til 20 prøver. Derfor, for prosjekter med en stor prøve for å prøvevariabilitet, bør prøver forhåndsscreenes på Diamond high-throughput beamlines, og da bør bare de mest lovende prøvene overføres for det påfølgende optimaliserte langbølgelengdeeksperimentet. Mens prøveholderne og overføringsblokkene er uendret fra den første introduksjonen for noen år siden, er håndteringsverktøyene som presenteres her alle nye utviklinger. I23 dedikerte prøveholdere er uforanderlige på grunn av deres rolle i kjølekonseptet for strålelinjen. Som sådan hadde utformingen av prøvehåndteringsverktøyene som mål å skape en kobling mellom denne nye typen holder og standard kommersielt tilgjengelige verktøy som MX-brukersamfunnet hadde vedtatt i lang tid, for eksempel kamipucks, krystallhøstingsstaver og det tørre avsendertransportsystemet. Deres design innebar betydelig konsultasjon med brukersamfunnet og krevde flere gjentakelser å fullføre. Utstyret, verktøyene og protokollen som presenteres her representerer et enkelt og robust system for overføring av brukerprøver for eksperimenter ved beamline I23 hos Diamond Light Source. Dette instrumentet for makromolekylær krystallografi med lang bølgelengde åpner nye muligheter for strukturbiologi.
Vi vil takke Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha og Kevin Wilkinson for deres støtte i utviklingen av Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Dette arbeidet ble finansiert av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Eu-kommisjonen.
12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |