Summary
פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.
Abstract
מינים Mycobacteria יכול להיות שונה זה מזה בקצב הצמיחה, נוכחות של פיגמנטציה, מורפולוגיה המושבה המוצגת על מדיה מוצקה, כמו גם מאפיינים פנוטיפיים אחרים. עם זאת, לכולם יש במשותף את האופי הרלוונטי ביותר של mycobacteria: דופן התא הייחודי והידרופובי מאוד שלה. מינים של מיקובקטריה מכילים קומפלקס מקושר-קוולנטי הכולל ערבינוגלקטן, פפטידוגליקן ושרשראות ארוכות של חומצות מיקוליות עם סוגים שונים בין מיני מיקובקטריה. בנוסף, mycobacteria יכול גם לייצר שומנים הממוקמים, שאינם קוולנטיים מקושרים, על משטחי התא שלהם, כגון פטיוצול dimycocerosates (PDIM), גליקולפידים פנוליים (PGL), גליקופפטידוליפידים (GPL), אציטרהאלוז (AT), או פוספטידיל-אינוזיטול mannosides (PIM), בין היתר. חלקם נחשבים גורמי ארס במיקובקטריה פתוגנית, או שומנים אנטיגניים קריטיים באינטראקציה בין מארח-מיקובקטריה. מסיבות אלה, יש עניין משמעותי בחקר השומנים mycobacterial בשל היישום שלהם במספר תחומים, מהבנת תפקידם בפתוגניות של זיהומים mycobacteria, למשמעות אפשרית כמו סוכנים אימונומודולטוריים לטיפול במחלות זיהומיות ופתולוגיות אחרות כגון סרטן. כאן, גישה פשוטה כדי לחלץ ולנתח את התוכן השומנים הכולל ואת הרכב חומצה mycolic של תאי mycobacteria גדל במדיום מוצק באמצעות תערובות של ממיסים אורגניים מוצג. לאחר תמציות השומנים מתקבלים, כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) מבוצעת כדי לפקח על תרכובות שחולצו. הניסוי לדוגמה מבוצע עם ארבעה מיקוביבקטריה שונים: Mycolicibacterium brumae ו- Mycolicibacterium fortuitum, Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) הגדלים במהירות: מיקובקטריום מורסה הגדל במהירות על ידי מיקוליצ'יבקטריום, המוכיח כי שיטות המוצגות בפרוטוקול הנוכחי יכולות לשמש למגוון רחב של מיקובקטריה.
Introduction
Mycobacterium הוא סוג הכולל מינים פתוגניים ולא פתוגניים, המאופיינת בקיר תא הידרופובי וחצוף מאוד שנוצר על ידי השומנים המוזרים שלהם. באופן ספציפי, דופן התא mycobacterial מכיל חומצות מיקוליות, אשר α-אלקיל וחומצות שומן הידרוקסיות β, שבהן הענף α קבוע בכל החומצות המיקוליות (למעט האורך) ושרשרת β, הנקראת שרשרת מרומיקולאט, היא שרשרת אליפטית ארוכה שעשויה להכיל קבוצות כימיות פונקציונליות שונות המתוארות יחד עם הספרות (α, α'-, מתוקסי-, κ-, אפוקסי-, קרבוקסי-, ו ω-1-מתוקסי- mycolates), ולכן לייצר שבעה סוגים של חומצות מיקוליות (I-VII)1. יתר על כן, שומנים אחרים עם חשיבות מוטלת בספק נמצאים גם בקיר התא של מינים mycobacteria. מינים פתוגניים כגון Mycobacterium tuberculosis, הסוכן הסיבתי של שחפת2 לייצר גורמי וירוליאנס ספציפיים מבוססי שומנים כגון פטיוצול דימיקוצריסטים (PDIMs), גליקוליפידים פנוליים (PGL), די,, תלת-, ופנטה-אציטרהאלוז (DAT, TAT ו- PAT), או סולגוליפידים, בין היתר3. נוכחותם על פני השטח המיקובקטריאליים נקשרה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארחת ולכן, האבולוציה וההתמדה של המיקובקטריום בתוך הפונדקאי4. לדוגמה, נוכחות של triacylglycerols (TAG) קושרה פנוטיפ היפר-ויראלי של שושלת שושלת 2-בייג'ינג של M. tuberculosis, אולי בשל יכולתו להנחית את התגובה החיסונית המארחת5,6. שומנים רלוונטיים אחרים הם lipooligosaccharides (LOSs) נוכח מיקובקטריה שחפת ולאtuberculous. במקרה של Mycobacterium marinumנוכחותו של LOSs בקיר התא שלה קשורה תנועתיות הזזה ואת היכולת ליצור biofilms ומפריעה לזיהוי על ידי קולטני זיהוי דפוס מקרופאגים, המשפיעים על ספיגה וחיסול של החיידקים על ידי פאגוציטים מארחים7,8. בנוסף, היעדר או נוכחות של שומנים מסוימים מאפשרת לחברים מאותו המין להיות מסווגים למורפוטיפים שונים עם פרופילים אלימים או מוחלשים בעת אינטראקציה עם תאים מארחים. לדוגמה, היעדר גליקופפטידוליפידים (GPL) במורפוטיפ המחוספס של Mycobacterium abscessus נקשר ליכולת לגרום להחמצה תוך-פאגוזומלית, וכתוצאה מכך אפופטוזיס של תאים9שלא כמו מורפוטיפ חלק בעל GPLs על פני השטח שלהם., יתר על כן, התוכן השומנים של דופן התא mycobacterial קשורה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארח. זה רלוונטי בהקשר של שימוש במיקובקטריה כלשהי כדי לעורר פרופיל חיסוני מגן מפני פתולוגיות שונות10,11,12,13. זה הוכח, למשל, כי Mycolicibacterium vaccaeמיקובקטריום ספרופיטי, הנמצא כעת בניסויים קליניים בשלב III כחיסון אימונותרפי לשחפת, מציג שני מורפוטיפים קולוניאליים., בעוד פנוטיפ חלק, המכיל פוליאסטר על פני השטח שלה, מפעיל תגובת Th2, פנוטיפ מחוספס נטול פוליאסטר יכול לגרום פרופיל Th1 כאשר הוא אינטראקציה עם תאים חיסוניים מארחים14. הרפרטואר של שומנים הנמצאים בתא mycobacterial לא רק תלוי מינים mycobacteria, אלא גם על התנאים של תרביות mycobacterial: זמן הדגירה15,16 או הרכב המדיום התרבותי17,18. למעשה, שינויים בהרכב המדיום התרבותי משפיעים על הפעילות האנטי-אטומית והאימונוסטימולטורית של M. bovis BCG ו Mycolicibacterium brumae in vitro17. יתר על כן, הפרופיל החיסוני המגן מופעל על ידי M. bovis BCG נגד M. tuberculosis האתגר במודלים של עכברים תלוי גם בתקשורת התרבותית שבה M. bovis BCG גדל17. אלה יכולים להיות קשורים להרכב השומנים של mycobacteria בכל מצב תרבית. מכל הסיבות הללו, המחקר של תוכן השומנים של mycobacteria רלוונטי. הליך חזותי כדי לחלץ ולנתח את הרכב השומנים של דופן התא mycobacterial מוצג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת השומנים הלא-קוולנטיים הכוללים ממיקובקטריה (איור 1)
- יש לגרד 0.2 גרם של מיקובקטריה ממדיה מוצקה ולהוסיף לצינור זכוכית עם כובעי בורג פוליטרפלואורואתלין (PTFE). הוסף פתרון המורכב מ-5 מ"ל של כלורופורם ו-10 מ"ל של מתנול (כלורופורם:מתנול, א' 2).
הערה: כאשר נעשה שימוש בממסים אורגניים, יש להשתמש רק בנמען זכוכית. אין להכניס מיכלי פלסטיק. יתר על כן, כובעי בורג אניה PTFE עבור בקבוקים נדרשים.
זהירות: כלורופורם הוא חומר רעיל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: מתנול הוא חומר רעיל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - השאירו את הצינור בערבוב מתמיד בן לילה כדי לחלץ שומנים שאינם קשורים לקוולנט מפני השטח של התא mycobacterial.
הערה: אם פלטפורמת ניעור מסלולית אינה זמינה, ערבוב מתמיד יכול להיות מוחלף על ידי ערבוב ידני תקופתי בתדירות האפשרית. - מכסים משפך זכוכית בנייר מסנן, מסננים את הממסים האורגניים ואוספים אותם בצינור זכוכית.
- השתמש בשטף גז חנקן כדי לאדות את השלב הנוזלי בצינור. מלא את הצינור בגז חנקן, לכסות ולאחסן אותו ב 4 °C (50 °F).
הערה: חבר פיפטת פסטר זכוכית לזרם של גז חנקן כדי לאדות במיוחד את הצינור הרצוי. בנוסף, לשמור על הצינור בתוך תנור בלוק יבש עבור צינורות ב 37 °C (50 °F). כאשר הממס מתאדה, למלא את הצינור עם גז חנקן לפני סגירתו. - הוסף 15 מ"ל של פתרון של כלורופורם:מתנול (2:1) לפסולת התאית. השאירו את הצינור בערבוב מתמיד בן לילה כדי לחלץ שומנים שאינם קשורים לקוולנט מפני השטח של התא mycobacterial.
הערה: אם פלטפורמת ניעור מסלולית אינה זמינה, ערבוב מתמיד יכול להיות מוחלף על ידי ערבוב ידני תקופתי בתדירות האפשרית. - תן לתערובת לנוח במשך שעה. עם פיפטת פסטר, לשחזר את הממסים האורגניים. לכסות משפך זכוכית עם נייר מסנן ולסנן את הממסים האורגניים ולאסוף אותם באותו צינור זכוכית ששימש בעבר בשלב 1.3. השתמש בשטף גז חנקן כדי לאדות את השלב הנוזלי בצינור. מלא את הצינור בגז חנקן, סגור אותו ולאחסן אותו שוב ב 4 °C (50 °F).
2. מיצוי חומצה מיקולית על ידי מתנוליזה חומצה (איור 2A)
- הוסף 2-5 מ"ל של פתרון esterifying לתוך צינור זכוכית הרמטית עם מכסה בורג אניה PTFE. הוסף 0.2 גרם של ביומסה mycobacteria לתוך צינור הזכוכית.
הערה: פתרון Esterifying נוצר על ידי ערבוב 30 מ"ל של מתנול, 15 מ"ל של טולואן, ו 1 מ"ל של חומצה גופרתית. תאי Mycobacteria ניתן לקחת מתרביות מוצקות או, אפילו מתאים עדינים לאחר ביצוע מיצוי של שומנים שאינם קוולנטיים הכוללים מ mycobacteria (תאים שנותרו לאחר סינון בשלב 1.6).
זהירות: טולואן הוא חומר דליק ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: חומצה גופרתית היא חומר מאכל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - מערבבים את התוכן על ידי מערבולת. תן לתערובת לעמוד בתוך אמבטיה יבשה ב 80 מעלות צלזיוס לילה.
- אפשר לצינור להתקרר עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של n-hexane לצינור. מערבבים את התוכן על ידי מערבולת במשך 30 s ולאפשר את הצינור להתיישב עד שני שלבים ברורים מופיעים.
זהירות: n-hexane הוא חומר דליק פוטנציאלי, מגרה, מזיק לסביבה, ומסוכן מאוד. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - שחזר את השלב העליון המתאים לשלב n-hexane. תעביר את זה לצינור חדש.
- חזור על שלב 2.3. לשחזר את השלב העליון שוב ולהעביר אותו לאותו צינור המשמש בשלב 2.4.
- לאדות את התוכן של הצינור באמצעות שטף גז חנקן. מלא את הצינור בגז חנקן, סגור אותו, ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F).
3. מיצוי חומצה מיקולית על ידי סאפוניפיקציה ומתילציה (איור 2B)
- יש לגרד 0.2 גרם של מיקובקטריה ממדיה מוצקה ולהוסיף לצינור זכוכית עם כובע בורג PTFE.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסה מתנול-בנזן (80:20) המכיל 5% אשלגן הידרוקסיד. מערבבים את התוכן על ידי מערבולת. מחממים את התערובת במשך 3 שעות ב 100 °C (70 °F).
זהירות: בנזן הוא חומר דליק, מסרטן ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - אפשר לצינור להתקרר לטמפרטורת החדר. הוסף 20% חומצה גופרתית כדי חומצה הדגימות כדי להשיג pH = 1.
- הוסף 3 מ"ל של אתר דיאתיל. מערבבים בעדינות את התוכן על ידי מערבולת.
- תן לשני השלבים להיווצר על ידי יישוב. לשחזר את שלב אתר diethyl ולעבור לצינור חדש. חזור על שלב הכביסה בסך הכל שלוש פעמים.
- לשטוף את תמצית אתר diethyl עם 2 מ"ל של מים מזוקקים ולהעביר את החלק העליון המתאים אתר diethyl לצינור חדש. חזור על שלב הכביסה בסך הכל שלוש פעמים.
- יש להוסיף 2 גרם נתרן גופרתי נטול מים מעל תמצית אתר הדיאטיל כדי לייבש אותו.
- לסנן את ההשעיה. לאדות את התוכן באמצעות שטף גז חנקן.
- כדי לבצע את שלב המתילציה, להמיס 3 גרם של N-nitroso-N-מתיל אוריאה בתמיסה מזוקקת מראש שנוצר על ידי 45 מ"ל של אתר דיאתיל ו 9 מ"ל של 40% KOH במים מזוקקים.
זהירות: N-nitroso-N-מתילאורה הוא חומר רעיל, מגרה, מסרטן ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - מעבירים את הסופרנאט (דיאזומטאן) לבקבוקון חדש מקורר בקרח המכיל כדורי אשלגן הידרוקסיד (כ-30 גרם).
הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי בסופר-נט, ניתן לאחסן אותו ב- -20 °C (70 °F) למשך שעה אחת לכל היותר.
אזהרה: כדורי אשלגן הידרוקסיד הם חומר מגרה ומאכל. חומר זה חייב לשמש מכסה המנוע זרימה למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: דיאזומטאן רעיל מאוד ועלול להיות נפיץ. יש להשתמש בו במכסה המנוע עם זכוכית בטיחות לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - הוסף 2 מ"ל של פתרון האתר המכיל דיאזומטאן, המתקבל בשלב 3.10, לתוך תמצית אתר דיאתיל מיובש המכיל חומצות מיקוליות, המתקבל בשלב 3.8. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאדות את ההשעיה ב 40 °C (50 °F). מלא את הצינור בגז חנקן, סגור אותו, ולאחסן את השומנים מתיל ב 4 °C (50 °F).
הערה: לאדות את הדיאזומטאן מפתרון האתר מתחת למכסה המנוע של זרימת למינאר, עד שהאתר מאבד את הצבע הצהוב.
4. ניתוח כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC)
- להרוות את תא TLC הזכוכית. כדי לעשות זאת, לכסות את אחד מהקירות של תא TLC עם פיסת נייר מסנן ולאפשר לו להיות במגע עם השלב הנייד המורכב על ידי תערובת של ממסים. מניחים את הנפח הנותר של הממס על החלק התחתון של תא TLC.
הערה: החלק התחתון של תא TLC חייב להיות מכוסה על ידי לפחות 1 ס"מ של השלב הנייד. בניסויים הנוכחיים, שלבים ניידים שונים שימשו לפיתוח TLCs. הם כללו 85 מ"ל של n-hexane בתוספת 15 מ"ל של אתר דיאתיל; 100 מ"ל של דיכלורומתאן; 90 מ"ל של כלורופורם, 10 מ"ל של מתנול, ו 1 מ"ל של מים; 30 מ"ל של כלורופורם, בתוספת 8 מ"ל של מתנול, ו 1 מ"ל של מים; 60 מ"ל של כלורופורם, בתוספת 35 מ"ל של מתנול, ו 8 מ"ל של מים; 95 מ"ל כלורופורם בתוספת 5 מ"ל של מתנול; ו-90 מ"ל של אתר נפט (60-80 °C (60°F) בתוספת 10 מ"ל של אתר דיאתיל.
הערה: ב- TLC הדו מימדי, השתמש n-hexane:אצטון (95:5) בכיוון הראשון שלוש פעמים, ולהשתמש בהתפתחות אחת עם טולואן:אצטון (97:3) בכיוון השני כדי לנתח הרכב חומצה מיקולית. כדי לנתח סוגי, השתמש בכלורופורם:מתנול:מים (60:30:6) בכיוון הראשון פעם אחת, והשתמש בכלורופורם:חומצה אצטית:מתנול:מים (40:25:3:6) בכיוון השני. כדי לנתח PDIM ו- AG, השתמש באתר נפט (60-80 °C):אתיל אצטט (98:2) בכיוון הראשון שלוש פעמים, והשתמש בפיתוח יחיד עם אתר נפט (60-80 °C): אצטון (98:2) בכיוון השני.
זהירות: אתר דיאתיל הוא חומר שעלול להיות רעיל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: דיכלורומטן הוא חומר רעיל ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: אתר נפט הוא חומר דליק, מזיק לסביבה ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: חומצה אצטית היא חומר דליק ומאכל פוטנציאלי. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: אתיל אצטט הוא חומר דליק ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: אצטון הוא חומר דליק ומסוכן. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל). - סגור את תא TLC כדי להרוות אותו לפחות 20 דקות. בינתיים, להמיס את השומנים הנוכחים בצינור זכוכית ב 0.2-1 מ"ל של כלורופורם.
הערה: ניתן לשנות את הנפח המשמש להמסת השומנים בהתאם לריכוז הרצוי או הצפוי של המדגם. - יש למרוח 10 מיקרו-אל של כל מתלה באמצעות צינור זכוכית נימי ישירות על צלחת ה-TLC ולתת לדגימה להתייבש למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: יש להחיל דגימות בחלק התחתון של הצלחת ולהשאיר 1 ס"מ בכל צד. יש להפריד דגימות זו מזו למשך 0.5 ס"מ לפחות. ברגע המדגם מוחל על הצלחת, צינורות ניתן לאדות שוב עם גז חנקן מאוחסן ב 4 °C (70 °F) לשימוש נוסף. - הכנס את הלוח לתא TLC הרווי המכיל את השלב הנייד. אפשר לשלב הנייד לעבור דרך ה- TLC.
הערה: כל תנועה החלה על תא TLC משפיע על ממס פועל על הצלחת ומשפיע על ניידות השומנים. במקרה של ביצוע TLC דו מימדי, שני תאי TLC נדרשים להכיל את שתי מערכות ההתחמקות. - הסר את הצלחת מתא TLC כאשר הממס מגיע למרחק של 1 ס"מ מהקצה העליון של הצלחת. השאירו את הצלחת תחת שטף למינאר עד שהסיליקה מיובשת לחלוטין.
הערה: במקרה של ניתוח הרכב החומצה המיקולית, באמצעות n-hexane ו- diethyl-ether (85:15), חזור על שלבים 4.4 ו- 4.5 פי שניים יותר, עד להפעלת השלב הנייד שלוש פעמים מעל צלחת TLC. - לחשוף את הצלחת עם הכתם הנדרש; מחממים את הצלחת במידת הצורך.
הערה: בניסוי הנוכחי, 15-20 מ"ל של הפתרונות הבאים שימשו לרסס את לוחות TLC: 10% מוליבטופוספורית חומצה לחות באתנול עד הצלחת הוא צהוב בהיר, ואחריו חימום הצלחת ב 120 °C (50 °F); 5% באתנול של 20% α-נפתול בחומצה גופרתית ואחריו חימום הצלחת ב 120 °C (50 °F); מוליבדן כחול ריאגנט (1.3% תחמוצת מוליבדן ב 4.2 M חומצה גופרתית) עד רצועות פוספט הופיעו או 1% אנתרון בחומצה גופרתית.
זהירות: חומצה מוליבטופוספורית הידרציה היא חומר דליק וקורוזיבי. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: אתנול הוא חומר דליק ומסוכן פוטנציאלי. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: 1-נפתול הוא חומר דליק, מאכל ומסוכן ביותר. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
זהירות: מוליבדן תרסיס כחול ריאגנט הוא חומר מאכל, רעיל, ומסוכן מאוד. יש להשתמש בו במכסה המנוע לזרם למינאר לובש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, משקפי מגן, כפפות ניטריל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במטרה להראות מגוון רחב של שומנים הנמצאים במינים שונים של מיקובקטריה, M. bovis BCG נבחר מכיוון שהוא מיקובקטריה מחוספסת וצמיחה איטית. בהליך נוספו בהליך גם המונופוטיפ החלק של מורסה. ארבעת המינים הללו מאפשרים לנו לדמיין ספקטרום רחב של שומנים שמקורם במיקובקטריה כגון אצילטרולוזים (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM ו- TMM. יתר על כן, לכל ארבעת המינים יש דפוסי חומצה מיקולית שונים.
לאחר ביצוע פרוטוקולי מיצוי חומצה מיקולית, תמציות שומנים נותחו באמצעות ניתוח 1D-TLC באמצעות שתי מערכות שונות, תקפות באותה מידה, elution (איור 3A,B). השלב הנייד הראשון(איור 3A)חובר על ידי n-hexane ו diethyl-אתר (85:15), ואת הצלחת היה לרוץ שלוש פעמים. השלב הנייד השני כלל 100% של דיכלורומתאן והצלחת נבחנה פעם אחת(איור 3B). בשתי מערכות ההתחמקות, חומצות מיקוליות ממוקמות בערך באמצע צלחת TLC ממקור היישום לדוגמה. כפי שמראה איור 3, M. brumae מחזיק רק סוג I חומצות mycolic, חומצה מיקולית נוכח בכל מיני mycobacteria. מ. בוביס ל-BCG יש פרופילי חומצות מיקוליות מסוג I ו-I, סוג M. fortuitum I ו- V, ו- M. abscessus, פרופילי חומצות מיקוליות מסוג I ו- II. ביצוע שני סוגים של הליכי מתילציה מאפשר לנו לאשר את נוכחותה של חומצה מיקולית מסוג V מאז סוג V חומצה מיקולית הוא חשופה במהלך הליך מתנוליזה חומצה. כפי שמראה איור 3, רק לאחר הליך הספוניקציה נצפתה הנקודה המתאימה לחומצה מיקולית מסוג V. לאחר מתנוליזה, TLC הראה את התרכובות הנגזרות ממחשוף מסוג V שהעביר ליד נקודת היישום19. עבור חוקרי neophyte, 2D-TLC יכול לאפשר שיטה משלימה לזהות כל סוג חומצה מיקולית(איור 3C,D). תמציות חומצה מיקולית חייב להיות לרוץ הראשון במערכת elution שנוצר על ידי אתר נפט (60-80 °C (60 °C)- ואצטון (95:5) שלוש פעמים. לאחר מכן, יש להפעיל את הצלחת בכיוון השני עם שלב נייד שנוצר על ידי טולואן ואצטון (97:3). 2D-TLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS) שימש לזיהוי ולאפיון כימי של הקבוצות התפקודיות של חומצות מיקוליות, נעשה בו שימוש נרחב כדי לאפיין חומצות מיקוליות20,21,22. לכן, דפוס החומצה המיקולית הוא אחד המאפיינים הביוכימיים של ערך בהערכה מיקובקטרית שיטתית בשילוב עם ניתוחים אחרים בשל דפוסי חומצה מיקולית משותפים בין מינים שונים.
לאחר ביצוע ההליך הנ"ל לחילוץ השומנים המקושרים שאינם קוואלנטיים, נבחרו מערכות אלוטציה שונות בתפקוד הקוטביות והגודל של פרופיל השומנים שנמצא בתאי מיקובקטריה. השילוב האידיאלי של ממיסים במערכות elution צריך לאפשר לדמיין את השומנים הרצויים באזור האמצעי של צלחת TLC כדי להקל על הטיהור הנוסף שלהם, אם תרצה. באיור 4, לוחותTLC מסודרים ממערכת ההבעה המאפשרת לעקוב אחר השומנים הקוטביים ביותר(איור 4A)למערכת ההבעה המאפשרת להמחיש את השומנים הקוטביים ביותר (איור 4E).
אציל גליצלולים (AG) ו- PDIMs הם שניים מהשומנים הקוטביים ביותר הנמצאים בדופן התא המיקובקטריאלי והם דמיינו בקלות באמצעות ניתוחי 1D-TLC באמצעות שלב נייד שנוצר על ידי אתר נפט:אתר דיאתיל (90:10). איור 4A מראה כי AGs היו נוכחים M. bovis BCG, M. fortuitum ו M. brumae אבל לא במורפוטיפ החלק של מ' מורסה. למרות 1D-TLC הציע את נוכחותם של PDIM M. bovis BCG ו M. fortuitum,זה אומת רק M. bovis BCG כאשר ניתוח 2D-TLC בוצע(איור 4B). בסך הכל, תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של אימות נוכחות של תרכובת mycobacterial על ידי לפחות שתי מערכות אלוטציה שונות. עוד שומנים מעניינים לנתח בהרכב mycobacteria הוא PGL. במיקובקטריה שנבחרה, PGL נוכח רק ב- M. bovis BCG, והוא מורגש כאשר TLC מלוטש עם מערכת ההעפרה המורכבת מכלורופורם ומתנול (95:5) (איור 4C). בעקבות הרעיון של הדמיית מרכיבים קוטביים יותר, מערכת ההעפלה המורכבת מתערובת של 90:10:1 (כלורופורם:מתנול:מים) שימשה לניטור נוכחותם של GPLs (איור 4D), אשר נמצאים רק מורפוטיפ חלק M. מורסה. באותו TLC: PGL, trehalose dimycolate (TDM), אציל trehaloses (AT), ו trehalose מונומיקולט (TMM), ניתן לראות גם. PGL, GPLs, TDM, AT נצפו גם בחלק העליון של הצלחת כאשר מערכת elution כללה 30:8:1 (כלורופורם:מתנול:מים)(איור 4E). TMM ממוקם באמצע הצלחת. TDM ו- TMM באו לידי ביטוי בבירור בכל mycobacteria נחקר. למרות פוספטידיל-אינוזיטול מנוsides (PIMs) נצפים בתחתית הצלחת, מערכת ההתחמקות הטובה ביותר לנתח PIMs היא 60:35:8 (כלורופורם:מתנול:מים) כפי שמוצג באיור 5A,B. בעוד שכל השומנים המכילים סוכר מתגלים באנתרון(איור 5A),ה-PIMs מכילים קבוצות פוספטים שנחשפו במיוחד עם ריאגנט כחול מוליבדן(איור 5B). בדומה לחומצות מיקוליות, AG ו- PDIMs, ניתן גם לדמיין בקלות PIMs באמצעות ניתוחי 2D-TLC(איור 5C). יתר על כן, במקרה של ניתוח mycobacteria כי הם מסוגלים לסנתז LOSS, PIMs ו LOSs יהיה מובחן באמצעות אותה מערכת elution 2D, כמפורט רן ואח'8.
איור 1: ערכת ההליך של חילוץ תוכן השומנים של mycobacteria גדל על מדיה מוצקה. צעדים עיקריים כדי לפענח שומנים נוכחים על תאי mycobacteria. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ערכת ההליך לחילוץ תכולת חומצה מיקולית של מיקובקטריה הגדלה על מדיה מוצקה. צעדים עיקריים לפענוח חומצות מיקוליות הנמצאות על תאי מיקובקטריה באמצעות מתנוליזה חומצית(A)או (B) סאפוניפיקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של מיקובקטריה. ניתוח כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) של חומצות מיקוליות שפותחו ב- (A) 85 מ"ל של n-hexane, בתוספת 15 מ"ל של אתר דיאתיל (שלוש ריצות), ו - (B) 100 מ"ל של דיכלורומתאן. (C)ניתוח TLC דו מימדי של חומצות מיקוליות שחולצו על ידי מתנוליזה חומצה שפותחה ב 95:5 (n-hexane:acetone) (שלוש ריצות) בכיוון הראשון ו 97:3 (טולואן:אצטון) בכיוון השני. (D)ניתוח TLC דו מימדי של חומצות מיקוליות מבויצור M. שחולצו על ידי סאפוניפיקציה שפותחה ב 95:5 (n-הקסאן:אצטון) (שלוש ריצות) בכיוון הראשון ו 97:3 (טולואן:אצטון) בכיוון השני. TLCs התגלו עם 10% חומצה מוליבטופוספורית הידרציה באתנול ואחריו חימום הצלחת ב 120 °C. M. bovis BCG קונוט (קו 1 ו 1'); מ. מזל (קו 2 ו-2'); מ. מורפוזוס מורפוטיפ חלק (קו 3 ו-3') ומ. ברומה (קו 4 ו-4'). 1-4 חומצות מיקוליות המתקבלות על ידי מתנוליזה חומצה ו 1'-4' חומצות מיקוליות המתקבלות על ידי סאפוניפיקציה. אני, α-מיקולאטס; II, α'-mycolates; IV, קטומיקולטים; וי, אפוקסימיקולטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של מיקובקטריה של שומנים בדם. (A) ניתוח TLC של אציליצרילס (AG) ופטיוצריול דימיקוצריוסטים (PDIMs) שפותחו ב- 90:10 (אתר נפט (60-80 °C):d אתיל אתר). (B)ניתוח TLC דו מימדי של PDIMs ו- AG שפותח ב 98:2 (אתר נפט (60-80 °C): אתיל אצטט) (שלוש ריצות) בכיוון הראשון ו 98:2 (אתר נפט (60-80 °C):אצטון) בכיוון השני. (C)ניתוח TLC של גליקוליפידים פנוליים (PGL) שפותח ב 95:5 (כלורופורם:מתנול). (D)ניתוחי TLC שפותחו ב 90:10:1 (כלורופורם:מתנול:מים) של PGL, גליקופפטידוליפידים (GPL), טרהלוז דימיקולט (TDM), אציל טרהלוז (AT) וטרלוס מונומיקולט (TMM). (E)ניתוח TLC של PGL, GPL, AT, TMM, ו פוספטידיל-אינוזיטול mannosides (PIMs) שפותח ב 30:8:1 (כלורופורם:מתנול:מים). A-B-C נחשפו עם 10% חומצה מוליבטופוספורית הידרציה באתנול ואחריו חימום הצלחת ב 120 °C. D.-E התגלו עם 5% באתנול של 20% α-naphthol בחומצה גופרתית מחומם ב 120 °C (70 °F). קו 1: מ. בוביס BCG קונוט; קו 2: מ. פורטיטום; קו 3: מ. מורפוזוס מורפוטיפ חלק; קו 4: מ. ברומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של PIMs ממיקובקטריה. (A-B) ניתוח TLC של PIMs שפותח ב- 60:35:8 (כלורופורם:מתנול:מים). (C)ניתוח TLC דו מימדי של PIMs שפותח ב 60:30:6 (כלורופורם:מתנול:מים) בכיוון הראשון ו 40:25:3:6 (כלורופורם:חומצה אצטית:מתנול:מים) בכיוון השני. A-C נחשפו עם 1% אנתרון בחומצה גופרתית ואחריו חימום הצלחת ב 120 °C. B נחשף עם מוליבדן כחול ריאגנט עד להקות פוספט הופיעו. קו 1: מ. בוביס BCG קונוט; קו 2: מ. פורטיטום; קו 3: מ. מורפוזוס מורפוטיפ חלק; קו 4: מ. ברומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול פשוט נחשב כשיטה תקן הזהב להפקת תרכובות שומנים שאינן מקושרות ללא קולן מקיר התא mycobacterial מוצג. הדמיה נוספת על ידי TLCs אחד דו מימדי מן השומנים שחולצו של ארבעה mycobacteria שונים מוצג.
שתי תערובות משולבות רצופות של כלורופורם ומתנול כדי לשחזר את התוכן השומנים של תאים mycobacterial הוא התערובת ממס הנפוץ ביותר23,24,25,26,27,28,29. תערובת זו מאפשרת התאוששות של מגוון רחב של שומנים קוטביים וקוטביים מהתאים. עם זאת, כמה שיטות אחרות תוארו בספרות כדי לחלץ שומנים mycobacterial הכולל או ספציפי, אשר נבדקו לאחרונה על ידי חאמיד ואח'29. לדוגמה, שיטת פולץ ' היא אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר שפותחו כדי לשחזר את השומנים mycobacterial הכולל מרקמות30 וגם הותאם לתרבויות mycobacterial טהור. זה מורכב השעיית תאים mycobacterial בכלורופורם:מתנול (1:2), ואחריו צנטריפוגה ותוספת של כלורופורם כדי לקבל יחס של 1:1. לבסוף, KCl משמש להסרת רכיבים שאינם ליפידים מהתמצית31. במקביל, פרוטוקולים אחרים פותחו כדי לחלץ שומנים ספציפיים. Slayden etal. השתמש בתערובת של כלורופורם:מתנול בתוספת אצטון במיוחד לשחזר גליקולפידים כגון TDM או TMM32. בסך הכל, שיטות שפורסמו מבוססות על חשיפת תאים mycobacterial לריכוזים שונים של ממסים, בעיקר כלורופורם ומתנול. כמו כן, מלחים מסוימים מתווספים מדי פעם כדי להשליך רכיבי תא אחרים הקיימים על המדגם.
בנוסף שומנים מקושרים ללא ערך, מיצוי חומצה מיקולית על ידי שני הליכים שונים מוצג גם. בעוד מתנוליזה חומצית מאפשרת מיצוי קל של חומצות מיקוליות עם ריאגנטים פחות מסוכנים, הליך הספוניפיקציה משמר את המבנה של כל סוגי החומצה המיקולית, כולל חומצה מיקולית מסוג V, אשר מקופלת במהלך הליכי המתנוליזה. לאחר שומנים מופקים, 1D- או 2D-TLC הם שיטות סטנדרטיות כדי לפקח עליהם, ואת ההסתה בשימוש משתנה בהתאם למאפיינים הפיזיקוכימיים של השומנים. הקוטביות והגודל של כל מולקולה יקבעו את הבחירה של מערכת ההעפרה הדרושה, ויאפשרו קביעת השומנים המהווים חלק מהמיקובקטריום. ניתן לבחור TLC חד-ממדי כאשר גורמי השמירה (Rf) בין שומנים mycobacterial שונים, בעוד 2D-TLC מאפשר הדמיה כאשר שומנים שונים חולקים משקל מולקולרי ומאפייני קוטביות. כדי להקל על הזיהוי, שומנים מטוהרים צריך להיות מופעל במקביל המדגם שחולץ להשוות Rf דומה. זיהוי של שומנים ניתן להשיג כאשר הוא פועל עם אותו Rf כמו זה של השליטה המטוהרת הידועה לפחות בשתי מערכות TLC (שני שלבים ניידים שונים). שומנים מטוהרים ניתן להשיג מספקים מסחריים או ממעבדות מחקר mycobacterial. לבסוף, האופי הביוכימי של המולקולה מציין באיזה כתם ניתן להשתמש כדי לחשוף לוחות TLC. ישנן שיטות הכתמה אוניברסליות, כגון חומצה phosphomolybdic המאפשר הדמיה של כל רכיב אורגני להיות דמיוני כפי שהוא נקשר קשרים פחמן. בעוד שאחרים כגון א-נפתול או אנת'רון מספקים צבעים ספציפיים לשאריות סוכר, כחול מוליבדן נקשר במיוחד לשאריות פוספט.
השיקול החשוב ביותר לנתח את תכולת השומנים של mycobacteria הוא למנוע שימוש בחומר פלסטי לאורך כל ההליכים שכן מגע של ממיסים אורגניים עם פלסטיק יכול לזהם את הדגימות וניתן לראות בצלחות TLC. זה רלוונטי גם לשקול כי הרכב בינוני תרבות המשמש לטיפוח mycobacteria, כמו גם טמפרטורה או ימים של דגירה, יכול לשנות את דפוס השומנים של כל mycobacterium, כפי שתואר בעבר16. Mycobacteria גדל על מדיוך נוזלי ומוצק ניתן להשתמש כדי לחלץ את שומנים מקושרים שאינם קוולנטיים או חומצות מיקוליות. בעת קבלת תאים מתרבית נוזלית, הם צריכים להיות מסוננים ומיובשים כראוי כדי למנוע נוכחות של מדיה נוזלית במדגם. יתר על כן, בעת שימוש mycobacteria ממדיה נוזלית, חיידקים חייבים להיות גדלים כראוי ובאותו מידה בין ניסויים על מנת להשיג תוצאות לשחזור לאורך זמן. יתר על כן, תאים mycobacterial ניתן לגדל גם עלpellicles 17,33,34,35,36, שממנו ניתן לשחזר את השומנים החיצוניים ביותר באמצעות ממיסים אורגניים ומנוטרים על ידי TLC, כפי שהראנו במאמר הנוכחי.
המגבלה העיקרית של הליכי מיקובקטרים מיקולואידי מיצוי שומנים נשאר ניצול של ממיסים רעילים בתנאים בטוחים. הליך TLC רגיש פחות מטיכניקות אחרות, כגון כרומטוגרפיה של גז או כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. יתר על כן, TLC אינו מאפשר כימות של דגימות, ויש ליישם טכניקות נוספות כדי לזהות את המבנה של תרכובות שחולצו. לדוגמה, תהודה מגנטית גרעינית צריכה להתבצע כדי להבחין איזומרים שומנים. ראוי לציין כי לתיאור המבנה של שומנים mycobacterial בפעם הראשונה, ספקטרומטריית מסה או ספקטרוסקופיה אינפרא אדום נדרשים. לכן, ניתוח כמותי ואיכותי של מחלקות השומנים דורש בדרך כלל שילובים של שיטות מיצוי, נגזרת, כרומטוגרפיות וזיהוי שונות, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או או אולטרה-ביצועים, ספקטרומטריית מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית37,38,39,40. מחקרים אחרונים הראו כי שימוש בטכניקת זיהוי יינון כרומטוגרפיה-להבה שכבה דקה חד-פעמית מאפשר כימות וסינון ראשוני של חומצות מיקוליות באקטינובקטריה41. עם זאת, TLC היא טכניקה שימושית מאוד, אורך זמן, זול כדי לסנן ולהעריך את הרכב השומנים של mycobacteria. בסך הכל, ההליכים המוצגים כאן הם רב-תכליתיים ביותר ומספקים כלים בסיסיים לניתוח התכונה הרלוונטית ביותר של תאי מיקובקטריה: דופן התא המורכב שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי (RTI2018-098777-B-I00), קרנות FEDER, ואת הגנרליטאט של קטלוניה (2017SGR-229). סנדרה גולאר-גארידו היא זוכת חוזה לדוקטורט (FI) מהגנרליטאט דה קטלוניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
