Summary
프로토콜은 광범위한 진균의 세포벽의 총 지질 함량을 추출하기 위해 제시된다. 더욱이, 진동산의 상이한 모형의 추출 및 분석 프로토콜이 도시된다. 이러한 진균 화합물을 모니터링하는 얇은 층 크로마토그래피 프로토콜도 제공됩니다.
Abstract
진균 종은 성장 속도, 색소 침착의 존재, 고체 미디어에 표시되는 식민지 형태뿐만 아니라 다른 표현성 특성에서 서로 다를 수 있습니다. 그러나, 그(것)들은 모두 일반적인 진균의 가장 관련성이 높은 특성이 있습니다: 그것의 독특하고 높게 소수성 세포 벽. 진균 종은 근균 종 간에 다른 모형을 가진 아라비노갈락탄, 펩티도글리칸 및 진골산의 긴 사슬을 포함하는 막-공유 연결된 복합체를 포함합니다. 또한, 진균은 또한 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIM), 페놀글리콜리피드(PGL), 글리코페티피피드(GPL), 아킬레알로스(AT), 또는 인플루타틸디딜(PIMos)과 같은 세포 표면에 위치하고, 비공유적으로 연결된 지질을 생산할 수 있다. 그(것)들의 몇몇은 병원성 진균에 있는 독성 요인, 또는 호스트 진균 상호 작용에 있는 중요한 항원 지질으로 간주됩니다. 이러한 이유로, 여러 분야에서 그들의 응용 으로 인해 진균 지질의 연구에 상당한 관심이 있다, 진균 감염의 병원성에서 그들의 역할을 이해에서, 감염성 질환 및 암 등 다른 병원성 치료에 대 한 면역 조절 에이전트로 가능한 의미에. 여기서, 유기 용매의 혼합물을 사용하여 고체 배지에서 자란 진균 세포의 총 지질 함량 및 진균산 조성물을 추출 및 분석하는 간단한 접근법이 제시된다. 지질 추출물이 얻어지면, 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 추출된 화합물을 모니터링하기 위해 수행됩니다. 예실험은 네 가지 다른 진균으로 수행된다: 환경 빠르게 성장하는 미콜리시박테리움 브루마와 미콜리박테리움 fortuitum, 감쇠된 천천히 성장하는 진균 보비스 균균 칼레트-게린(BCG)과 기회성 병원균이 빠르게 성장하는 진균 농양, 현재 의정서에 나타난 방법이 광범위한 진균균에 사용될 수 있음을 입증한다.
Introduction
Mycobacterium 병원성 및 비병원성 종을 구성하는 속으로, 특유의 지질에 의해 형성된 높은 소수성 및 불투과성 세포벽을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 균균 세포벽에는 α 알킬과 β 하이드록시 지방산인 진동산이 포함되어 있으며, α 분지는 모든 진동산(길이 제외)과 β 사슬에서 상수이며, 메로미콜레이트 체인이라고 불리는 β 체인은 문헌과 함께 설명된 다른 기능성 화학적 집단을 함유할 수 있는 긴 알리파성 체인(me-α α, α θ-, 에폭시, 카박스시 및 ω-1-메톡시-골곱, 따라서 골수산의 7가지 유형(I-VII)을 생성합니다.1. 더욱이, 의심할 여지없는 중요성을 가진 그밖 지질은 또한 진균 종의 세포 벽에 존재합니다. 병원성 종과 같은 Mycobacterium tuberculosis, 결핵의 원인 에이전트2 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIMs), 페놀 글리콜리피드(PGL), 디-, 트라이-및 펜타-아실트레할로스(DAT, TAT 및 PAT) 또는 설폴리피드 와 같은 특정 지질 기반 독성 요인을 생성합니다.3. 진균 표면에 그들의 존재는 호스트 면역 반응을 수정하는 기능과 연관되었습니다, 따라서, 호스트 내부진균의 진화와 지속성4. 예를 들어, 트리아실글리세롤(TAG)의 존재는 계보 2-베이징 하위 혈통의 초연한 표현형과 관련이 있다. M. tuberculosis, 아마도 호스트 면역 반응을 감쇠하는 그것의 능력 때문에5,6. 다른 관련 지질은 결핵 과 비 결핵 진균에 존재하는 lipooligosaccharides (LOSs)입니다. Mycobacterium marinum, 세포벽에 LOS의 존재는 미닫이 운동성 및 생물막형성 능력과 관련이 있으며 대식세포 패턴 인식 수용체에 의한 인식을 방해하여 숙주 식세포에 의한 박테리아의 섭취및 제거에 영향을 미치는 영향7,8. 추가적으로, 몇몇 지질의 부재 또는 존재는 호스트 세포와 상호 작용할 때 악성 또는 감쇠 단면도를 가진 상이한 형태형으로 분류될 수 있습니다. 예를 들어, 글리코펜티오닙스(GPL)의 거친 형태에 Mycobacterium abscessus 인트라고소말 산성화를 유도하는 능력과 관련이 있으며, 결과적으로 세포 세포화증9, 자신의 표면에 GPL을 소유 하는 부드러운 형태와는 달리. 더욱이, 진균세포벽의 지질 함량은 숙주에서 면역 반응을 수정하는 능력과 관련이 있다. 이것은 다른 병리학에 대하여 보호 면역 단면도를 시작하기 위하여 몇몇 진균을 사용하는 맥락에서 관련있습니다10,11,12,13. 예를 들어, Mycolicibacterium vaccae, 결핵에 대한 면역 치료 백신으로 현재 III 임상 시험 단계에 있는 사프로피틱 진균균은 두 개의 식민지 형태형을 표시합니다. 표면에 폴리에스테르를 함유한 부드러운 표현형이 Th2 반응을 유발하는 반면, 폴리에스테르의 거친 표현형 변형은 숙주 면역 세포와 상호 작용할 때 Th1 프로파일을 유도할 수 있습니다.14. 진균 세포에 존재하는 지질의 레퍼토리는 진균 종뿐만 아니라 진균 배양의 조건에 따라 달라집니다 : 잠복기의 시간15,16 배양 배지의 조성17,18. 사실, 배양 배지 조성물의 변화는 항종양 및 면역 자극 활성에 영향을 미칩니다. M. bovis BCG 및 Mycolicibacterium brumae in vitro17. 더욱이, 보호 면역 프로파일에 의해 트리거 M. bovis 에 대한 BCG M. tuberculosis 마우스 모델의 도전은 또한 배양 매체에 달려 있습니다. M. bovis BCG성장17. 이들은 그 때 각 문화 조건에서 진균의 지질 조성과 관련될 수 있었습니다. 이러한 모든 이유로, 진균의 지질 함량에 대한 연구는 관련이 있습니다. 근균 세포벽의 지질 조성물을 추출하고 분석하는 시각적 절차가 제시된다.
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Protocol
1. 진균으로부터 의약과 연계된 총 지질추출(도 1)
- 단단한 매체에서 균균의 0.2 g를 긁고 폴리테트라플루오로로알렌 (PTFE) 라이너 나사 캡유리 튜브에 추가합니다. 클로로폼 5mL및 메탄올 10mL(클로로폼:메탄올, 1:2)로 구성된 용액을 추가합니다.
참고: 유기 용매를 사용하는 경우 유리 수령인만 사용해야 합니다. 플라스틱 용기는 허용되지 않습니다. 또한, 병에 대한 PTFE 라이너 나사 캡이 필요합니다.
주의: 클로로폼은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 메탄올은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - 균 균 세포 표면에서 비 공유 연결 지질을 추출 하룻밤 지속적인 교반에 튜브를 둡니다.
참고: 궤도 흔들림 플랫폼을 사용할 수 없는 경우 일정한 교반을 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 대체할 수 있습니다. - 필터 용지로 유리 깔때기를 덮고 유기 용매를 필터링하고 유리 튜브로 수집합니다.
- 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액체 상을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 뚜껑을 덮고 4 °C에 보관하십시오.
참고: 유리 파스퇴르 파이펫을 질소 가스 스트림에 연결하여 원하는 튜브를 특별히 증발시다. 또한 튜브용 드라이 블록 히터 내부에 튜브를 37°C에서 유지합니다. 용매가 증발하면 튜브를 질소 가스로 채운 후 닫습니다. - 클로로폼용 15mL를 셀룰러 파편에 넣습니다. 균 균 세포 표면에서 비 공유 연결 지질을 추출 하룻밤 지속적인 교반에 튜브를 둡니다.
참고: 궤도 흔들림 플랫폼을 사용할 수 없는 경우 일정한 교반을 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 대체할 수 있습니다. - 혼합물을 1 시간 동안 쉬게하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하면 유기 용매를 회수하십시오. 필터 용지로 유리 깔때기를 덮고 유기 용매를 필터링하고 이전에 1.3 단계에서 사용했던 것과 동일한 유리 튜브로 수집합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액체 상을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 4 °C에서 다시 저장하십시오.
2. 산성 메탄성 석면에 의한 진콜산 추출(그림 2A)
- PTFE 라이너 나사 캡이 있는 밀폐 유리 튜브에 2-5mL의 에스테르피케이클을 추가합니다. 유리 튜브에 균균 바이오매스 0.2 g를 넣습니다.
참고: 에스테로마이징 용액은 메탄올 30mL, 톨루엔 15mL, 황산 1mL를 혼합하여 형성된다. 진균 세포는 고체 배양또는 진균박테리아로부터 총 비공유 연결 지질추출을 수행한 후 탈지 세포로부터 도취될 수 있다(1.6단계에서 여과 후 남은 세포).
주의: 톨루엔은 인화성 및 매우 유해물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 황산은 부식성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - 소용돌이에 의해 내용을 혼합. 혼합물은 하룻밤 동안 80 °C에서 마른 목욕 안에 서보자.
- 튜브가 실온에 도달할 때까지 식힌 다음 튜브에 n-헥산 2mL를 추가합니다. 30s에 대한 소용돌이로 내용을 혼합하고 두 개의 명확한 단계가 나타날 때까지 튜브가 정착 할 수 있습니다.
주의: n-헥산은 잠재적인 인화성, 자극성, 환경 적 손상 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - n-헥산 상에 대응하는 상면을 복구합니다. 새 튜브로 전송합니다.
- 2.3 단계를 반복합니다. 상위를 다시 회수하고 2.4 단계에서 사용되는 동일한 튜브로 옮는다.
- 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 함량을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 4 °C에 보관하십시오.
3. 삽화 및 메틸화에 의한 진콜산 추출(도 2B)
- 단단한 매체에서 균균의 0.2 g를 긁어 PTFE 나사 캡유리 튜브에 추가합니다.
- 수산화 칼륨 5%를 함유한 메탄올 벤젠 용액 2mL(80:20)를 추가합니다. 내용물들을 소용돌이에 섞는다. 혼합물을 100°C에서 3시간 동안 가열합니다.
주의: 벤젠은 인화성, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - 튜브가 실온으로 식힙니다. pH = 1을 달성하기 위해 시료를 산성화하기 위해 20 % 황산을 추가하십시오.
- 디틸 에테르 3mL를 추가합니다. 소용돌이에 의해 내용을 부드럽게 섞습니다.
- 정착하여 두 단계가 형성될 수 있습니다. 다이틸 에테르 단계를 복구하고 새로운 튜브로 전송합니다. 총 세면단계를 3회 반복합니다.
- 디틸 에테르 추출물을 증류수 2mL로 세척하고 디틸 에테르에 해당하는 상부부분을 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 총 세면단계를 3회 반복합니다.
- 다이틸 에테르 추출물 위에 무수성 나트륨 황산나트륨 2 g를 추가하여 건조시다.
- 서스펜션을 필터링합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 함량을 증발시다.
- 메틸화 단계를 수행하기 위해, 디틸 에테르 45mL에 의해 형성된 사전 냉각 용액에 N-니트로소-N-메틸 우레아 3g을 녹이고 증류수에서 KOH 40%의 9mL를 용해한다.
주의: N-니트로소-N-메틸루레아는 독성, 자극제, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - 수산화 칼륨 펠릿 (약 30g)을 포함하는 얼음에서 냉각 된 새로운 플라스크로 상체 (diazomethane)를 전송합니다.
참고: 상체가 즉시 사용되지 않으면 최대 1시간 동안 -20°C로 저장할 수 있습니다.
주의: 수산화 칼륨은 자극성 및 부식성 물질입니다. 이 재료는 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 디아조메탄은 매우 독성이 높고 잠재적으로 폭발성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 안전 유리가있는 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - 3.10단계에서 얻은 다이아조메탄을 함유한 에테르 용액의 2mL을 진동산을 함유한 건조 디틸 에테르 추출물에 넣고 3.8단계에서 수득하였다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
- 서스펜션을 40°C에서 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 메틸화 지질을 4°C에 저장합니다.
참고: 에테르가 노란색을 잃을 때까지 라미나르 흐름 후드 아래의 에테르 용액에서 다이아조메탄을 증발시다.
4. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석
- 유리 TLC 챔버를 포화. 이를 위해, 필터 용지와 TLC 챔버의 벽 중 하나를 커버하고 용매의 혼합물에 의해 구성된 이동 상과 접촉 할 수 있도록. 용매의 나머지 부피를 TLC 챔버의 바닥에 놓습니다.
참고: TLC 챔버의 바닥은 이동상의 최소 1cm까지 커버해야 합니다. 본 실험에서, TCC를 개발하기 위해 상이한 이동상이 사용되었다. 그들은 n-헥산 85 mL 플러스 디틸 에테르의 15 mL로 구성; 디클로로메탄 100mL; 클로로폼 90mL, 메탄올 10mL, 물 1mL; 30mL의 클로로폼, 메탄올 8mL, 물 1mL; 60mL의 클로로폼, 메탄올 35mL, 8mL의 물; 95 mL 클로로폼 플러스 메탄올의 5 mL; 및 90mL의 석유 에테르 (60-80 °C)와 디틸 에테르 10 mL.
참고: 2차원 TLC에서는, n-헥산:아세톤(95:5)을 첫 번째 방향으로 세 번 사용하고, 톨루엔:아세톤(97:3)을 사용하여 두 번째 방향으로 단일 개발을 사용하여 진동산 조성물을 분석한다. PIM을 분석하려면 클로로폼:메탄올:물(60:30:6)을 첫 번째 방향으로 한 번 사용하고, 클로로폼:아세트산:메탄올:물(40:25:3:6)을 두 번째 방향으로 사용한다. PDIM 및 AG를 분석하려면, 석유 에테르(60-80°C):에틸 아세테이트(98:2)를 첫 번째 방향으로 3번 사용하고, 석유 에테르(60-80°C):아세톤(98:2)을 제2 방향으로 사용한다.
주의: 디틸 에테르는 잠재적으로 독성이 있고 유해한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 디클로로메탄은 잠재적으로 독성이 있고 유해한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 석유 에테르는 잠재적인 인화성, 환경적으로 손상되고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 아세트산은 잠재적인 인화성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 에틸 아세테이트는 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 아세톤은 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. - TLC 챔버를 닫아 최소 20분 동안 포화시다. 한편, 유리튜브에 존재하는 지질을 0.2-1mL의 클로로포름으로 용해한다.
참고: 지질을 용해하는 데 사용되는 부피는 시료의 원하는 또는 예상 농도에 따라 수정될 수 있습니다. - TLC 플레이트에 모세관 유리 튜브를 사용하여 각 서스펜션의 10 μL을 바르고 실온에서 5 분 동안 시료를 건조시키십시오.
참고: 샘플은 플레이트 의 하단 부분에 적용되어야 하며 각 면에 1cm를 남겨두어야 합니다. 샘플은 0.5cm 이상 다른 샘플과 분리되어야 합니다. 샘플이 플레이트에 적용되면 튜브는 질소 가스로 다시 증발하고 추가 사용을 위해 4 °C에 저장 될 수 있습니다. - 플레이트를 이동상이 포함된 포화 TLC 챔버에 삽입합니다. 모바일 단계가 TLC를 통해 실행되도록 허용합니다.
참고: TLC 챔버에 적용된 모든 움직임은 플레이트의 실행 용매에 영향을 미치고 지질 이동성에 영향을 미칩니다. 2차원 TLC를 수행하는 경우 두 개의 TLC 챔버가 모두 용출 시스템을 포함해야 합니다. - 용매가 플레이트의 상부 끝에서 1cm 거리에 도달하면 TLC 챔버에서 플레이트를 제거합니다. 실리카가 완전히 건조 될 때까지 라미나르 플럭스 아래에 접시를 둡니다.
참고: 진골산 조성물을 분석하는 경우, n-헥산 및 디틸 에테르(85:15)를 사용하여, TLC 플레이트를 통해 3배 의 이동상을 실행할 때까지 4.4 및 4.5배 더 반복한다. - 필요한 얼룩으로 접시를 공개; 필요한 경우 접시를 가열합니다.
참고: 본 실험에서, 다음 의 용액의 15-20 mL은 TLC 플레이트를 분사하는 데 사용하였다: 플레이트가 밝은 노란색이 될 때까지 에탄올에서 10% 몰리브다토포스포릭산 수분염, 120°C에서 플레이트가열; 황산에서 20%α-나프톨의 에탄올 5%는 120°C에서 플레이트를 가열하는 데 이어; 몰리브덴 블루 시약(4.2M 황산산의 1.3% 몰리브덴 산화물)이 인산염 밴드가 나타나거나 황산에 1% 반위한다.
주의: 몰리브다포스포릭산 수분공급은 인화성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 에탄올은 잠재적인 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 1-Naphthol은 인화성, 부식성 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
주의: 몰리브덴 블루 스프레이 시약은 부식성, 독성 및 매우 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.
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Representative Results
다른 진균 종에 존재하는 지질의 넓은 범위를 보여주는 목적으로, M. bovis BCG는 거칠고 느린 성장 진균으로 선택되었다. 거칠고 빠르게 성장하는 M. fortuitum 및 M. brumae는 절차에 추가되었고, 마지막으로 M. 농양의 부드러운 형태도 포함되었습니다. 이 4개의 종은 우리가 아실트레할로스 (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM 및 TMM과 같은 진균 유래 지질의 넓은 스펙트럼을 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 네 종 은 모두 다른 진동성 패턴을 가지고있다.
진골산 추출 프로토콜을 수행한 후, 지질 추출물은 1D-TLC 분석을 통해 두 개의 다른, 동등하게 유효하며 용출시스템(그림 3A,B)을사용하여 분석하였다. 제1 이동단계(도3A)는n-헥산 및 디틸 에테르(85:15)에 의해 구성되었고, 플레이트는 세 번 실행되었다. 제2 이동상은 디클로로메탄의 100%로 구성되었으며 플레이트는 한번(도 3B)을발동하였다. 용출 시스템 모두에서, 진동산은 샘플 응용 프로그램의 기원으로부터 TLC 플레이트의 중간에 대략 위치한다. 그림 3에서 알 수 있듯이, M. brumae는 모든 진균 종에 존재하는 진동산인 I 형골산만 을 소유하고 있습니다. M. 보비스 BCG에는 타입 I 및 IV, M. fortuitum 타입 I 및 V, M. 농양,유형 I 및 II 진골산 프로파일이 있습니다. 2가지 유형의 메틸화 시술을 수행하면 V형 골수산이 산성 메탄수산 시술 중에 갈라지므로 V형 골수산의 존재를 확인할 수 있습니다. 도 3에서 알 수 있듯이, 묘목 시술 후에만 V형 진동산 관찰에 대응하는 지점이었다. 메탄온용해 후, TLC는 응용점(19)근처에서 마이그레이션된 V형 골짜기로부터 유래 화합물을 보여주었다. 신생아 연구원의 경우, 2D-TLC는 각 진동산유형(도 3C,D)을식별하는 보완적인 방법을 허용할 수 있다. 진동성 추출물은 석유 에테르(60-80°C)와 아세톤(95:5)에 의해 형성된 용출 시스템에서 먼저 세 번 실행되어야 한다. 이어서, 플레이트는 톨루엔과 아세톤(97:3)에 의해 형성된 이동상으로 두 번째 방향으로 실행되어야 한다. 질량 분석법(MS)과 결합된 2D-TLC는 진동산의 기능성 군을 식별하고 화학적으로 특성화하는 데 사용되어 왔으며,진척산(20,21,22)을특성화하기 위해 광범위하게 사용되고 있다. 따라서, 진막산 패턴은 상이한 종 들 사이에서 공유된 진동산 패턴으로 인하여 다른 분석과 결합하여 체계적인 진균 평가에서 가치의 생화학적 특징 중 하나입니다.
전술한 절차를 수행하여 비-공유 연계 지질을 추출한 후, 상이한 용출 시스템은 진균세포에서 발견되는 지질 프로파일의 극성 및 크기의 기능에서 선택되었다. 용출 시스템에서 용매의 이상적인 조합은 원하는 경우 추가 정화를 용이하게하기 위해 TLC 플레이트의 중간 영역에서 원하는 지질을 시각화 할 수 있어야합니다. 도 4에서,TLC 플레이트는 가장 극성 지질을 모니터링할 수 있는 용출 시스템에서 가장 많은 극성 지질을 시각화할 수 있는 용출시스템(도 4E)으로주문한다( 도 4E).
아실 글리세롤(AG)과 PDIM은 진균 세포벽에 존재하는 가장 아폴라 지질 의 두 가지이며 석유 에테르:diethyl ether(90:10)에 의해 형성된 이동상을 사용하여 1D-TLC 분석을 통해 쉽게 시각화된다. 도 4A는 AGs가 M. bovis BCG, M. fortuitum 및 M. brumae에 존재했지만 M. 농양의부드러운 형태는 존재하지 않는다는 것을 보여줍니다. 1D-TLC는 M. bovis BCG 및 M. fortuitum에서PDIM의 존재를 제안했지만, 2D-TLC 분석이 수행되었을 때 M. bovis BCG에서만 확증되었습니다(그림4B). 전부, 이러한 결과는 적어도 두 개의 다른 용출 시스템에 의해 진균 화합물의 존재를 확증의 중요성을 보여줍니다. 진균 조성물에서 분석하는 또 다른 흥미로운 지질은 PGL입니다. 선택된 진균에서 PGL은 M. bovis BCG에만 존재하며, TLC가 클로로폼과 메탄올(95:5)으로 구성된 용출 시스템으로 용출될 때 눈에 띈다(도4C). 더 많은 극지 성분을 시각화하는 아이디어에 따라, 90:10:1(클로로폼:메탄올:물)의 혼합물로 구성된 용출 시스템은 M. 농양연형에만 존재하는 GPLs(도4D)의존재를 모니터링하는 데 사용되었다. 같은 TLC에서: PGL, 트레할로오스 디미콜레이트(TDM), 아실 트레할로스(AT), 트레할로오스 단색화(TMM)도 관찰할 수 있다. PGL, GPLs, TDM, AT는 용출 시스템이 30:8:1(클로로폼:메탄올:물)(도4E)으로구성되었을 때 플레이트 의 상부에서 관찰되었다. TMM은 플레이트 의 중간에 위치하고 있습니다. TDM과 TMM은 연구된 모든 진균에서 명확하게 표현되었다. 피규어 5A,B에도시된 바와 같이, 피오디딜-이노시톨 만노사이드(PIM)가 플레이트 의 바닥에서 관찰되고 있음에도 불구하고, PIM을 분석하는 최고의 용출 시스템은 60:35:8(클로로폼:메탄올:물)이다. 모든 설탕 함유 지질은왕좌(그림 5A)로드러나지만, PIM에는 몰리브덴 블루 시약(그림5B)으로구체적으로 드러나는 인산염 군을 함유하고 있습니다. 진골산, AG 및 PDIM과 마찬가지로 PIM은 2D-TLC분석(그림 5C)을통해 쉽게 시각화할 수 있습니다. 더욱이, LOS를 합성할 수 있는 진균균을 분석하는 경우, PIM 및 LOS는 Ren 외8에상세히 설명된 바와 같이 동일한 2D 용출 시스템을 사용하여 차별화될 것이다.
그림 1: 고체 매체에서 자란 진균의 지질 함량을 추출하는 절차의 계획. 진균 세포에 존재하는 지질을 해독하는 주요 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고체 매체에서 자란 진균균의 진균산 함량을 추출하는 절차의 계획. (A)산 메탄분해 또는(B)수취화를 사용하여 진균 세포에 존재하는 진동산을 해독하는 주요 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 진균으로부터 지질 추출의 대표적인 결과. (A)n-헥산의 85mL, 디틸 에테르 15mL(3회), 디클로로메탄 100mL에서 개발된 진골산의 씬층 크로마토그래피(TLC) 분석. (C)산성 메탄올리시스에 의해 추출된 진골산의 2차원 TLC 분석은 제1 방향에서 95:5(n-헥산:아세톤)(3회 실행)와 97:3(톨루엔:아세톤)로 개발되었다. (D)제2 방향에서 95:5(n-헥산:아세톤) (3런)로 개발된 소포화에 의해 추출된 M. fortuitum의 진골산2차원 TLC 분석. TCC는 에탄올에서 10% 몰리브다포스포릭산 수분염으로 밝혀졌고, 그 다음으로 120°C. Bovis BCG Connaught(1호선 및 1호선)에서 플레이트를 가열하였다. M. fortuitum (2호선 및 2호선); M. 농양 부드러운 형태형 (3 호선 및 3') 및 M. brumae (4 호선 및 4'). 산성 메탄올리시스에 의해 얻어진 1-4개의 진동산과 1'-4' 진동산은 사포화에 의해 얻어진다. 나, α-균주; II, α'-균주; IV, 케토마이콜레이트; V, 에폭시마이쿨레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 진코박테리아로부터지질 추출의 대표적인 결과. (A)90:10(석유 에테르(60-80°C):d이티에테르)로 개발된 아킬글리세롤(AG) 및 피티오세롤 디마이코세로사테(PDIMs)의 TLC 분석. (B)PDIM 및 AG의 2차원 TLC 분석은 98:2(석유 에테르(60-80°C):에틸 아세테이트(3개의 실행)를 제1 방향으로, 98:2(석유 에테르(60-80°C):아세톤)으로 2방향으로 개발하였다. (C)95:5 (클로로폼:메탄올)에서 개발된 페놀 글리콜리피드(PGL)의 TLC 분석. (D)TLC 분석은 90:10:1 (클로로폼:메탄올:물) PGL, 글리코펜티올리피드(GPL), 트레할로오스 디미콜리트(TDM), 아실레트알로스(AT), 트레할로오스 모노미쿨레이트(TMM)로 개발되었다. (E)PGL, GPL, AT, TMM 및 포스파디딜-이노시톨 만노사이드(PIM)의 TLC 분석은 30:8:1(클로로폼:메탄올:물)에 개발되었다. A-B-C는 에탄올에서 10% 몰리브다포스포릭산 수분염으로 밝혀졌고, 120°C에서 플레이트를 가열한후-E는 황산에서 20%α-나흐트홀의 20%의 에탄올에서 5%로 밝혀졌고 120°C에서 가열하였다. 1호선: M. 보비스 BCG 코노트; 선 2: M. fortuitum; 선 3: M. 농양 부드러운 형태유형; 4호선: M. 브루매. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 진균으로부터의 PIM의 대표적인 결과. (A-B)60:35:8 (클로로폼:메탄올:물)에 개발된 PIM의 TLC 분석. (C)60:30:6 (클로로폼:메탄올:물)에 개발된 PIM의 2차원 TLC 분석은 제1 방향과 40:25:3:6 (클로로폼:아세트산:메탄올:물)을 제2 방향으로 개발하였다. A-C는 황산에서 1%의 반왕좌로 나타났고, 120°C에서 플레이트를 가열한 후, 인산밴드가 등장할 때까지 몰리브덴 블루 시약으로 밝혀졌다. 1호선: M. 보비스 BCG 코노트; 선 2: M. fortuitum; 선 3: M. 농양 부드러운 형태유형; 4호선: M. 브루매. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
골균 세포벽으로부터 비연하 로 연결된 지질 화합물의 추출을 위한 금표준 방법으로 간주되는 간단한 프로토콜이 제시된다. 4개의 상이한 진균균의 추출된 지질으로부터 1차원 및 2차원 TCC에 의한 추가 시각화가 도시된다.
클로로폼과 메탄올의 2연연속 결합 혼합물은 균균 세포의 립액함량을 회수하는 데 가장 널리 사용되는 용매혼합물(23,24,25, 26,27,27, 28,29)이다. 이 혼합물은 세포에서 극성 및 극성 지질의 넓은 범위의 회복을 허용한다. 그럼에도 불구하고, 일부 다른 방법은 최근 Hameed 외29에의해 검토된 총 또는 특정 진균 지질을 추출하기 위해 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, Folch 방법은조직(30)으로부터 총 진균 지질을 회수하기 위해 개발된 가장 널리 사용되는 프로토콜 중 하나이며 순수한 진균 배양에도 적용되어 있다. 클로로폼:메탄올(1:2)에서 진균세포를 일시 중단하는 것으로 구성되며, 원심분리 및 클로로폼을 첨가하여 1:1의 비율을 얻는 것으로 구성된다. 마지막으로, KCl은추출물(31)으로부터비지질 성분을 제거하는 데 사용된다. 병렬로, 다른 프로토콜은 특정 지질을 추출하기 위해 개발되었습니다. Slayden외는 클로로폼:메탄올 플러스 아세톤의 혼합물을 사용하여 TDM 또는 TMM32와같은 글리콜리피드를 구체적으로 회수했다. 전부, 간행된 방법은 주로 클로로폼 및 메탄올의 다른 농도에 진균 세포를 노출에 기초합니다. 마찬가지로, 일부 염은 때때로 샘플에 존재하는 다른 세포 구성 요소를 폐기하기 위해 추가됩니다.
비응성 지질 외에도 두 가지 다른 절차에 의한 진골산 추출도 표시됩니다. 산성 메탄올리시스는 덜 위험한 시약으로 진동산을 쉽게 추출할 수 있도록 허용하지만, 묘포화 절차는 메탄올리시스 시술 중에 갈라진 V 균산을 포함한 모든 진동산 유형의 구조를 보존합니다. 지질을 추출하면 1D 또는 2D-TLC는 이를 모니터링하는 표준 방법이며, 활용된 분석법은 지질의 물리화학적 특성에 따라 다릅니다. 각 분자의 극성과 크기는 필요한 용출 시스템의 선택을 결정하여 진균의 일부를 형성하는 지질의 결정을 허용합니다. 1차원 TLC는 진균 지질 사이의 보존 인자(Rf)가 다를 때 선택할 수 있으며, 2D-TLC는 다른 지질이 분자량과 극성 특성을 공유할 때 시각화를 용이하게 합니다. 식별을 용이하게 하기 위해 정제된 지질은 추출된 샘플과 병행하여 실행하여 유사한 Rf를 비교해야 합니다. 지질의 식별은 적어도 두 개의 TLC 시스템(두 개의 서로 다른 모바일 단계)에서 알려진 정제 제어와 동일한 Rf로 실행될 때 달성될 수 있다. 정제된 지질은 상업적 인 공급 업체 또는 진균 연구 실험실에서 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 분자의 생화학적 특성은 TLC 플레이트를 드러내기 위해 어떤 얼룩을 사용할 수 있는지 나타냅니다. 탄소 결합에 결합될 때 어떤 유기 성분의 시각화를 시각화할 수 있는 인산과 같은 보편적인 염색 방법이 있습니다. 낮피톨이나 안왕좌와 같은 다른 사람들은 설탕 잔류물에게 특정 색상을 제공하지만 몰리브덴 블루는 특히 인산염 잔류물류에 결합합니다.
진균의 지질 함량을 분석하는 가장 중요한 고려 사항은 플라스틱을 사용한 유기 용매의 접촉이 시료를 오염시킬 수 있고 TLC 플레이트에서 관찰될 수 있기 때문에 절차 전반에 걸쳐 플라스틱 물질의 사용을 피하는 것이다. 또한 균균 재배에 사용되는 배양 배지 조성물뿐만 아니라 침구의 온도 또는 일뿐만 아니라, 이전에 설명된바와같이 각 진균의 지질 패턴을 수정할 수 있다는 점을 고려한 것과 관련이 있다. 액체 및 고체 매체에서 자란 진균은 비 공유 연결 지질 또는 진동산을 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 액체 배양에서 세포를 얻을 때, 그들은 적절하게 여과 및 샘플에 액체 매체의 존재를 피하기 위해 건조해야합니다. 또한 액체 미디어에서 균균을 사용할 때, 박테리아는 시간이 지남에 따라 재현 가능한 결과를 얻기 위해 실험 사이에 적절하고 동등하게 성장해야합니다. 더욱이, 진균세포는 또한펠리클(17,33,34,35,36)에서재배될 수 있으며, 이 로부터 가장 바깥쪽 지질은 유기 용매를 이용하여 회수하고 TLC에 의해 모니터링될 수 있으며, 본 발명에서 알 수 있다.
균 성 지질 추출 절차의 주요 제한은 안전한 조건에서 독성 용매의 활용 남아있다. TLC 절차는 가스 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 다른 기술보다 덜 민감합니다. 더욱이, TLC는 시료의 정량화를 허용하지 않으며, 추출된 화합물의 구조를 식별하기 위해 추가 기술을 적용해야 한다. 예를 들어, 핵 자기 공명지질 이소마를 구별하기 위하여 수행될 필요가 있습니다. 처음으로 균균 지질의 구조를 설명하기 위해서는 질량 분광법 또는 적외선 분광법이 필요합니다. 따라서, 지질 클래스의 정량적 및 질적 분석은 일반적으로 고-또는 초고성능 액체 크로마토그래피 와 같은 상이한 추출, 파생, 크로마토그래피 및 검출 방법의 조합을 필요로 하며 핵 자기 공명 분광법37,38,39,40. 최근 연구에 따르면 1단계 씬층 크로마토그래피-화염 이온화 검출 기술을 사용하면액티노박테리아(41)에서진동산의 정량화 및 예비 스크리닝을 허용하고 있다. 그럼에도 불구하고 TLC는 진균의 립지액 조성물을 선별하고 평가하는 데 매우 유용하고 시간 절약적이며 저렴한 기술입니다. 전반적으로, 여기에 제시된 절차는 진균 세포의 가장 관련성이 높은 특징인 복잡한 세포벽을 분석하는 기본 도구를 제공하는 매우 다재다능합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 과학, 혁신 및 대학의 스페인 부에 의해 투자되었다 (RTI2018-098777-B-I00), 페더 펀드, 그리고 카탈루냐의 일반 (2017SGR-229). 산드라 과라-가리도는 일반타트 드 카탈루냐에서 박사 학위 계약(FI)을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
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