Summary
Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.
Abstract
Las especies de micobacterias pueden diferir entre sí en la tasa de crecimiento, la presencia de pigmentación, la morfología de la colonia mostrada en los medios sólidos, así como otras características fenotípicas. Sin embargo, todas tienen en común el carácter más relevante de las micobacterias: su pared celular única y altamente hidrofóbica. Las especies de micobacterias contienen un complejo unido a la membrana covalente que incluye arabinogalactano, peptidoglicano y cadenas largas de ácidos micólicos con tipos que difieren entre las especies de micobacterias. Además, las micobacterias también pueden producir lípidos que se localizan, no unidos covalentemente, en sus superficies celulares, como los dicicocerosatos de fteocerol (PDIM), los glicolípidos fenólicos (PGL), los glicopptidolípidos (GPL), las aciltrehalosas (AT) o los narizidos de fosfatidil-inositol (PIM), entre otros. Algunos de ellos se consideran factores de virulencia en micobacterias patógenas, o lípidos antigénicos críticos en la interacción huésped-micobacterias. Por estas razones, existe un interés significativo en el estudio de los lípidos micobacterianos debido a su aplicación en varios campos, desde la comprensión de su papel en la patogenicidad de las infecciones por micobacterias, hasta una posible implicación como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades infecciosas y otras patologías como el cáncer. Aquí, se presenta un enfoque simple para extraer y analizar el contenido total de lípidos y la composición de ácido micólico de las células de micobacterias cultivadas en un medio sólido utilizando mezclas de solventes orgánicos. Una vez obtenidos los extractos lipídicos, se realiza cromatografía de capa fina (TLC) para monitorizar los compuestos extraídos. El experimento de ejemplo se realiza con cuatro micobacterias diferentes: mycolicibacterium brumae y Mycolicibacterium fortuitum de rápido crecimiento ambiental, el bacilo atenuado de crecimiento lento Mycobacterium bovis Calmette-Guérin (BCG) y el patógeno oportunista de rápido crecimiento Mycobacterium abscessus, lo que demuestra que los métodos mostrados en el presente protocolo se pueden utilizar para una amplia gama de micobacterias.
Introduction
Mycobacterium es un género que comprende especies patógenas y no patógenas, caracterizadas por tener una pared celular altamente hidrofóbica e impermeable formada por sus peculiares lípidos. Específicamente, la pared celular micobacteriana contiene ácidos micólicos, que son ácidos grasos α-alquilo y β-hidroxi, en los que la rama α es constante en todos los ácidos micólicos (excepto en la longitud) y la cadena β, llamada cadena de meromycolate, es una cadena alifática larga que puede contener diferentes grupos químicos funcionales descritos junto con la literatura (α-, α'-, metoxi-, metoxi-, κ-, epoxi-, carboxi-, y ω-1-metoxi-micolatos), produciendo así siete tipos de ácidos micólicos (I-VII)1. Además, otros lípidos con una importancia incuestionable también están presentes en la pared celular de las especies de micobacterias. Especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis2 producen factores de virulencia específicos basados en lípidos como dilipocerol dimycocerosatos (PDIMs), glicolípidos fenólicos (PGL), di-, tri-, y penta-aciltrehalosas (DAT, TAT y PAT), o sulfolípidos, entre otros.3. Su presencia en la superficie micobacteriana se ha asociado con la capacidad de modificar la respuesta inmune del huésped y por tanto, la evolución y persistencia de la micobacteria dentro del huésped.4. Por ejemplo, la presencia de triacilgliceroles (TAG) se ha asociado con el fenotipo hipervirulento del linaje 2-Beijing sublinaje de M. tuberculosis, posiblemente debido a su capacidad para atenuar la respuesta inmune del huésped5,6. Otros lípidos relevantes son los lipooligosacáridos (LOS) presentes en micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. En el caso de Mycobacterium marinum, la presencia de LOSs en su pared celular está relacionada con la motilidad deslizante y la capacidad de formar biopelículas e interfiere con el reconocimiento por parte de los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos, afectando la absorción y eliminación de las bacterias por los fagocitos del huésped.7,8. Además, la ausencia o presencia de algunos lípidos permite clasificar a los miembros de una misma especie en diferentes morfotipos con perfiles virulentos o atenuantes al interactuar con las células huésped. Por ejemplo, la ausencia de glicopeptidolípidos (GPL) en el morfotipo rugoso de Mycobacterium abscessus se ha asociado con la capacidad de inducir acidificación intrafagosómica y, en consecuencia, apoptosis celular9, a diferencia del morfotipo liso que posee G L GPL en su superficie. Además, el contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana está relacionado con la capacidad de modificar la respuesta inmune en el huésped. Esto es relevante en el contexto del uso de algunas micobacterias para desencadenar un perfil inmune protector contra diferentes patologías.10,11,12,13. Se ha demostrado, por ejemplo, que Mycolicibacterium vaccae, una micobacteria saprófita, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase III como vacuna inmunoterapéutica para la tuberculosis, muestra dos morfotipos coloniales. Mientras que el fenotipo liso, que contiene un poliéster en su superficie, desencadena una respuesta Th2, el fenotipo rugoso desprovisto del poliéster puede inducir un perfil Th1 cuando interactúa con las células inmunes del huésped.14. El repertorio de lípidos presentes en la célula micobacteriana no solo depende de las especies de micobacterias, sino también de las condiciones de los cultivos de micobacterias: tiempo de incubación.15,16 o composición del medio de cultivo17,18. De hecho, los cambios en la composición del medio de cultivo afectan a la actividad antitumoral e inmunoestimuladora de M. bovis BCG y Mycolicibacterium brumae in vitro17. Además, el perfil inmune protector desencadenado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis El desafío en modelos de ratones también depende de los medios de cultivo en los que M. bovis BCG crece17. Estos podrían estar relacionados con la composición lipídica de las micobacterias en cada condición de cultivo. Por todas estas razones, el estudio del contenido lipídico de las micobacterias es relevante. Se presenta un procedimiento visual para extraer y analizar la composición lipídica de la pared celular micobacteriana.
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Protocol
1. Extracción del total de lípidos no ligados a covalentes de micobacterias (Figura 1)
- Rasque 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y agréguelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir una solución compuesta por 5 ml de cloroformo y 10 ml de metanol (cloroformo:metanol, 1:2).
NOTA: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, solo se debe usar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además, se necesitan tapones de rosca de revestimiento de PTFE para botellas.
PRECAUCIÓN: El cloroformo es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El metanol es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana.
NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible. - Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro, filtre los disolventes orgánicos y recójalos en un tubo de vidrio.
- Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, cúbralo y guárdelo a 4 °C.
NOTA: Conecte una pipeta Pasteur de vidrio a la corriente de gas nitrógeno para evaporar específicamente el tubo deseado. Además, mantenga el tubo dentro de un calentador de bloque seco para tubos a 37 °C. Cuando el disolvente se evapore, llene el tubo con gas nitrógeno antes de cerrarlo. - Añadir 15 ml de una solución de cloroformo:metanol (2:1) a los desechos celulares. Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana.
NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible. - Deja reposar la mezcla durante 1 h. Con una pipeta Pasteur, recupera los disolventes orgánicos. Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro y filtre los disolventes orgánicos y recójalos en el mismo tubo de vidrio utilizado anteriormente en el paso 1.3. Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo de nuevo a 4 °C.
2. Extracción de ácido micólico por metanolisis ácida (Figura 2A)
- Agregue 2-5 ml de solución esterificante en un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE. Agregue 0,2 g de biomasa de micobacterias en el tubo de vidrio.
NOTA: La solución esterificante se forma mezclando 30 ml de metanol, 15 ml de tolueno y 1 ml de ácido sulfúrico. Las células de micobacterias se pueden tomar de cultivos sólidos o, incluso, de células deslipidas después de realizar la extracción de lípidos totales no ligados a covalentes de micobacterias (células restantes después del filtrado en el paso 1.6).
PRECAUCIÓN: El tolueno es una sustancia inflamable y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es una sustancia corrosiva y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Mezclar el contenido mediante vórtice. Deje reposar la mezcla dentro de un baño seco a 80 °C durante la noche.
- Deje que el tubo se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente y luego agregue 2 ml de n-hexano al tubo. Mezclar el contenido mediante vórtice durante 30 s y dejar que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras.
PRECAUCIÓN: El n-hexano es una sustancia potencialmente inflamable, irritante, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Recuperar la fase superior correspondiente a la fase n-hexano. Transfiéralo a un tubo nuevo.
- Repita el paso 2.3. Recupere la fase superior de nuevo y transfiérala al mismo tubo utilizado en el paso 2.4.
- Evaporar el contenido del tubo utilizando un flujo de gas nitrógeno. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo a 4 °C.
3. Extracción de ácido micólico por saponificación y metilación (Figura 2B)
- Rasca 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y añádelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de PTFE.
- Añadir 2 ml de solución de metanol-benceno (80:20) que contenga hidróxido de potasio al 5%. Mezclar el contenido mediante vórtice. Calentar la mezcla durante 3 h a 100 °C.
PRECAUCIÓN: El benceno es una sustancia inflamable, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente. Añadir un 20% de ácido sulfúrico para acidificar las muestras y lograr un pH = 1.
- Añadir 3 ml de éter dietílico. Mezcle suavemente el contenido mediante vórtice.
- Deje que las dos fases se formen asentándose. Recuperar la fase de éter dietílico y transferir a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.
- Lave el extracto de éter dietílico con 2 ml de agua destilada y transfiera la parte superior correspondiente al éter dietílico a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.
- Agregue 2 g de sulfato de sodio anhidro sobre el extracto de éter dietílico para secarlo.
- Filtra la suspensión. Evaporar el contenido utilizando un flujo de gas nitrógeno.
- Para realizar la etapa de metilación, disolver 3 g de N-nitroso-N-metil urea en una solución preenfriada formada por 45 mL de éter dietílico y 9 mL de KOH al 40% en agua destilada.
PRECAUCIÓN: La N-nitroso-N-metilurea es una sustancia tóxica, irritante, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Transfiera el sobrenadante (diazometano) a un nuevo matraz enfriado en hielo que contenga gránulos de hidróxido de potasio (aproximadamente 30 g).
NOTA: Si el sobrenadante no se utiliza inmediatamente, se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 h.
PRECAUCIÓN: Los gránulos de hidróxido de potasio son una sustancia irritante y corrosiva. Este material debe utilizarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (capa de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El diazometano es altamente tóxico y potencialmente explosivo. Debe usarse en una campana de flujo laminar con vidrio de seguridad que use el equipo de protección personal apropiado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Añadir 2 ml de la solución de éter que contiene diazometano, obtenida en el paso 3.10, en el extracto de éter dietílico seco que contiene ácidos micólicos, obtenido en el paso 3.8. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Evaporar la suspensión a 40 °C. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y almacene los lípidos metilados a 4 °C.
NOTA: Evapore el diazometano de la solución de éter debajo de la campana de flujo laminar, hasta que el éter pierda el color amarillo.
4. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC)
- Saturar la cámara TLC de vidrio. Para ello, cubra una de las paredes de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro y deje que esté en contacto con la fase móvil compuesta por la mezcla de disolventes. Coloque el volumen restante del disolvente en la parte inferior de la cámara TLC.
NOTA: La parte inferior de la cámara TLC debe estar cubierta por al menos 1 cm de la fase móvil. En los presentes experimentos, se utilizaron diferentes fases móviles para desarrollar los TMIC. Consistieron en 85 ml de n-hexano más 15 ml de éter dietílico; 100 ml de diclorometano; 90 ml de cloroformo, 10 ml de metanol y 1 ml de agua; 30 ml de cloroformo, más 8 ml de metanol y 1 ml de agua; 60 ml de cloroformo, más 35 ml de metanol y 8 ml de agua; 95 ml de cloroformo más 5 ml de metanol; y 90 ml de éter de petróleo (60-80 °C) más 10 ml de éter dietílico.
NOTA: En el TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con tolueno:acetona (97:3) en la segunda dirección para analizar la composición del ácido micólico. Para analizar los PPY, use cloroformo: metanol: agua (60: 30: 6) en la primera dirección una vez, y use cloroformo: ácido acético: metanol: agua (40: 25: 3: 6) en la segunda dirección. Para analizar PDIM y AG, use éter de petróleo (60-80 ° C): acetato de etilo (98: 2) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con éter de petróleo (60-80 ° C): acetona (98: 2) en la segunda dirección.
PRECAUCIÓN: El éter dietílico es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El diclorometano es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El éter de petróleo es una sustancia potencialmente inflamable, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El ácido acético es una sustancia potencialmente inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El acetato de etilo es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: La acetona es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). - Cierre la cámara TLC para saturarla durante al menos 20 min. Mientras tanto, disuelva los lípidos presentes en el tubo de vidrio en 0.2-1 ml de cloroformo.
NOTA: El volumen utilizado para disolver los lípidos puede modificarse dependiendo de la concentración deseada o esperada de la muestra. - Aplique 10 μL de cada suspensión utilizando un tubo de vidrio capilar directamente sobre la placa TLC y deje secar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Las muestras deben aplicarse en la parte inferior de la placa dejando 1 cm a cada lado. Las muestras deben separarse unas de otras durante al menos 0,5 cm. Una vez que la muestra se aplica en la placa, los tubos se pueden evaporar nuevamente con gas nitrógeno y almacenarse a 4 ° C para su uso posterior. - Inserte la placa en la cámara TLC saturada que contiene la fase móvil. Permita que la fase móvil se ejecute a través del TLC.
NOTA: Cualquier movimiento aplicado a la cámara TLC afecta al disolvente en funcionamiento en la placa y afecta la movilidad de los lípidos. En el caso de realizar TLC bidimensional, se requieren dos cámaras TLC para contener ambos sistemas de elución. - Retire la placa de la cámara TLC cuando el disolvente alcance 1 cm de distancia del extremo superior de la placa. Deje la placa bajo flujo laminar hasta que la sílice esté totalmente seca.
NOTA: En el caso de analizar la composición del ácido micólico, utilizando n-hexano y dietil-éter (85:15), repita los pasos 4.4 y 4.5 dos veces más, hasta ejecutar la fase móvil tres veces sobre la placa TLC. - Revelar la placa con la mancha requerida; calentar la placa si es necesario.
NOTA: En el presente experimento, se utilizaron 15-20 ml de las siguientes soluciones para rociar las placas TLC: 10% de ácido molibdatofosfórico hidratado en etanol hasta que la placa sea de color amarillo brillante, seguido de calentar la placa a 120 ° C; 5% en etanol de 20% α-naftol en ácido sulfúrico seguido de calentar la placa a 120 °C; Reactivo de molibdeno azul (1,3% de óxido de molibdeno en ácido sulfúrico de 4,2 M) hasta que aparecieron bandas de fosfato o antrono al 1% en ácido sulfúrico.
PRECAUCIÓN: El hidrato de ácido molibdatofosfórico es una sustancia inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El etanol es una sustancia potencialmente inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El 1-naftol es una sustancia inflamable, corrosiva y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
PRECAUCIÓN: El reactivo de pulverización azul de molibdeno es una sustancia corrosiva, tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
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Representative Results
Con el objetivo de mostrar una amplia gama de lípidos presentes en diferentes especies de micobacterias, se seleccionó M. bovis BCG por tratarse de micobacterias rugosas y de crecimiento lento. En el procedimiento se añadieron M. fortuitum y M. brumae rugosas y de rápido crecimiento y, finalmente, también se incluyó el morfotipo liso de M. abscessus. Estas cuatro especies nos permiten visualizar un amplio espectro de lípidos derivados de micobacterias como aciltrehalosas (AT), GGL, PDIM, PGL, PIM, TDM y TMM. Además, las cuatro especies tienen diferentes patrones de ácido micólico.
Después de realizar los protocolos de extracción de ácido micólico, los extractos de lípidos se analizaron a través del análisis 1D-TLC utilizando dos sistemas de elución diferentes, igualmente válidos (Figura 3A,B). La primera fase móvil(Figura 3A)estuvo compuesta por n-hexano y dietil-éter (85:15), y la placa se ejecutó tres veces. La segunda fase móvil consistió en 100% de diclorometano y la placa se eluyó una vez(Figura 3B). En ambos sistemas de elución, los ácidos micólicos se encuentran aproximadamente en el centro de la placa TLC desde el origen de la aplicación de la muestra. Como muestra la Figura 3, M. brumae solo posee ácidos micólicos tipo I, un ácido micólico presente en todas las especies de micobacterias. M. bovis BCG tiene perfiles de ácidos micólicos tipo I y IV, M. fortuitum tipo I y V, y M. abscessus,tipo I y II. La realización de dos tipos de procedimientos de metilación nos permite confirmar la presencia de ácido micólico tipo V, ya que el ácido micólico tipo V se escinde durante el procedimiento de metanolisis ácida. Como muestra la Figura 3, solo después del procedimiento de saponificación se observó el punto correspondiente al ácido micólico tipo V. Después de la metanolisis, TLC mostró los compuestos derivados de la escisión tipo V que migraron cerca del punto de aplicación19. Para los investigadores de neófitos, 2D-TLC puede permitir un método complementario para identificar cada tipo de ácidomicólico (Figura 3C,D). Los extractos de ácido micólico deben ejecutarse primero en un sistema de elución formado por éter de petróleo (60-80 °C) y acetona (95:5) tres veces. Luego, la placa debe correr en la segunda dirección con una fase móvil formada por tolueno y acetona (97: 3). 2D-TLC combinado con espectrometría de masas (MS) se ha utilizado para identificar y caracterizar químicamente los grupos funcionales de los ácidos micólicos y se ha utilizado ampliamente para caracterizar los ácidos micólicos20,21,22. Por lo tanto, el patrón de ácido micólico es una de las características bioquímicas de valor en la evaluación sistemática de micobacterias en combinación con otros análisis debido a los patrones compartidos de ácido micólico entre diferentes especies.
Después de realizar el procedimiento mencionado anteriormente para extraer los lípidos ligados no covalentes, se seleccionaron diferentes sistemas de elución en función de la polaridad y el tamaño del perfil lipídico encontrado en las células de micobacterias. La combinación ideal de disolventes en los sistemas de elución debe permitir visualizar los lípidos deseados en la zona media de la placa TLC para facilitar su posterior purificación, si se desea. En la Figura 4,las placas TLC se ordenan desde el sistema de elución que permite monitorizar la mayor cantidad de lípidos apolares(Figura 4A)hasta el sistema de elución que permite visualizar la mayor cantidad de lípidos polares(Figura 4E).
Los gliceroles de acil (AG) y los PDIM son dos de los lípidos más apolares presentes en la pared celular de las micobacterias y se visualizan fácilmente a través de análisis 1D-TLC utilizando una fase móvil formada por éter de petróleo: éter dietílico (90:10). La Figura 4A muestra que los AG estaban presentes en M. bovis BCG, M. fortuitum y M. brumae pero no en el morfotipo liso de M. abscessus. Aunque 1D-TLC sugirió la presencia de PDIM en M. bovis BCG y M. fortuitum,sólo fue corroborado en M. bovis BCG cuando se realizó el análisis 2D-TLC(Figura 4B). En conjunto, estos resultados demuestran la importancia de corroborar la presencia de un compuesto micobacteriano por al menos dos sistemas de elución diferentes. Otro lípido interesante para analizar en la composición de micobacterias es el PGL. En las micobacterias elegidas, la PGL sólo está presente en M. bovis BCG, y se nota cuando se eluye TLC con el sistema de elución formado por cloroformo y metanol (95:5)(Figura 4C). Siguiendo la idea de visualizar más componentes polares, se utilizó el sistema de elución consistente en la mezcla de 90:10:1 (cloroformo:metanol:agua) para monitorear la presencia de GCL(Figura 4D),que solo están presentes en el morfotipo liso de M. abscessus. En el mismo TLC: también se puede observar PGL, dicolato de trehalosa (TDM), acil trehalosas (AT) y monomielato de trehalosa (TMM). PGL, GGL, TDM, AT también se observaron en la parte superior de la placa cuando el sistema de elución consistía en 30:8:1 (cloroformo:metanol:agua)(Figura 4E). TMM se encuentra en el centro de la placa. TDM y TMM se expresaron claramente en todas las micobacterias estudiadas. A pesar de que se observan nariz de fosfatidil-inositol (PIL) en la parte inferior de la placa, el mejor sistema de elución para analizar piMs es 60:35:8 (cloroformo:metanol:agua) como se muestra en la Figura 5A,B. Mientras que todos los lípidos que contienen azúcar se revelan con antrona(Figura 5A),los PIM contienen grupos fosfato que se revelan específicamente con el reactivo Azul de Molibdeno(Figura 5B). Al igual que los ácidos micólicos, AG y PDIMs, los PIMs también se pueden visualizar fácilmente a través de análisis 2D-TLC(Figura 5C). Por otra parte, en el caso de analizar micobacterias que sean capaces de sintetizar LOSs, PIMs y LOSs se diferenciarían utilizando el mismo sistema de elución 2D, tal y como se detalla en Ren et al.8.
Figura 1: Esquema del procedimiento de extracción del contenido lipídico de micobacterias cultivadas en medios sólidos. Pasos principales para descifrar los lípidos presentes en las células de micobacterias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema del procedimiento para extraer el contenido de ácido micólico de micobacterias cultivadas en medios sólidos. Pasos principales para descifrar los ácidos micólicos presentes en las células de micobacterias utilizando la metanolisis ácida(A)o la saponificación(B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de la extracción de lípidos de micobacterias. Análisis por cromatografía en capa delgada (TLC) de ácidos micólicos desarrollados en (A) 85 mL de n-hexano, más 15 mL de dietil éter (tres tiradas), y (B) 100 mL de diclorometano. (C) Análisis bidimensional de TLC de ácidos micólicos extraídos por metanolisis ácida desarrollada en 95:5 (n-hexano:acetona) (tres tiradas) en la primera dirección y 97:3 (tolueno:acetona) en la segunda dirección. (D) Análisis bidimensional de TLC de ácidos micólicos de M. fortuitum extraídos por saponificación desarrollados en 95:5 (n-hexano:acetona) (tres tiradas) en la primera dirección y 97:3 (tolueno:acetona) en la segunda dirección. Se revelaron TLC con hidrato de ácido molibdatofosfórico al 10% en etanol seguido de calentamiento de la placa a 120 °C. M. bovis BCG Connaught (Línea 1 y 1'); M. fortuitum (líneas 2 y 2'); M. abscessus morfotipo liso (Línea 3 y 3') y M. brumae (Línea 4 y 4'). 1-4 ácidos micólicos obtenidos por metanolisis ácida y 1'-4' ácidos micólicos obtenidos por saponificación. Yo, α-micolatos; II, α'-micolatos; IV, cetomiecolatos; V, epoximielatos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la extracción de lípidos de micobacterias. (A) Análisis TLC de acilgliceroles (AG) y diquicocerosatos de ftiocerol (PDIMs) desarrollado en 90:10 (éter de petróleo (60-80 °C):d éter de sitilo). (B) Análisis TLC bidimensional de PDIMs y AG desarrollado en 98:2 (éter de petróleo (60-80 °C):acetato de etilo) (tres tiradas) en la primera dirección y 98:2 (éter de petróleo (60-80 °C):acetona) en la segunda dirección. (C) Análisis TLC de glicolípidos fenólicos (PGL) desarrollado en 95:5 (cloroformo:metanol). (D) Análisis de TLC desarrollados en 90:10:1 (cloroformo:metanol:agua) de PGL, glicopeptidolípidos (GPL), ditilelato de trehalosa (TDM), acil trehalosas (AT) y monomielato de trehalosa (TMM). (E) Análisis TLC de PGL, GPL, AT, TMM y fosfatidil-inositol mansósidos (PIMs) desarrollados en 30:8:1 (cloroformo:metanol:agua). A-B-C se revelaron con 10% de hidrato de ácido molibdatofosfórico en etanol seguido de calentamiento de la placa a 120 ° C. D-E se revelaron con 5% en etanol de 20% α-naftol en ácido sulfúrico y calentado a 120 ° C. Línea 1: M. bovis BCG Connaught; Línea 2: M. fortuitum; Línea 3: Morfotipo liso de M. abscessus; Línea 4: M. brumae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de PIMs de micobacterias. (A-B) Análisis TLC de PIMs desarrollado en 60:35:8 (cloroformo:metanol:agua). (C) Análisis TLC bidimensional de PIMs desarrollado en 60:30:6 (cloroformo:metanol:agua) en la primera dirección y 40:25:3:6 (cloroformo:ácido acético:metanol:agua) en la segunda dirección. A-C se revelaron con antrona al 1% en ácido sulfúrico seguido de calentamiento de la placa a 120 ° C. B se reveló con el reactivo Molybdenum Blue hasta que aparecieron bandas de fosfato. Línea 1: M. bovis BCG Connaught; Línea 2: M. fortuitum; Línea 3: Morfotipo liso de M. abscessus; Línea 4: M. brumae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta un protocolo simple considerado como el método estándar de oro para la extracción de compuestos lipídicos no unidos covalentemente de la pared celular micobacteriana. Se muestra una visualización adicional por TMIC unidimensionales y bidimensionales de los lípidos extraídos de cuatro micobacterias diferentes.
Dos mezclas combinadas consecutivas de cloroformo y metanol para recuperar el contenido lipídico de las células micobacterianas es la mezcla de disolventes más utilizada23,24, 25,26,27,28,29. Esta mezcla permite la recuperación de una amplia gama de lípidos apolares y polares de las células. Sin embargo, algunos otros métodos han sido descritos en la literatura para extraer lípidos micobacterianos totales o específicos, que han sido revisados recientemente por Hameed et al.29. Por ejemplo, el método Folch es uno de los protocolos más utilizados desarrollados para recuperar el total de lípidos micobacterianos de los tejidos30 y también se ha adaptado a cultivos de micobacterias puras. Consiste en suspender las células micobacterianas en cloroformo:metanol (1:2), seguido de centrifugación y la adición de cloroformo para obtener una relación de 1:1. Finalmente, KCl se utiliza para eliminar componentes no lipídicos del extracto31. Paralelamente, se han desarrollado otros protocolos para extraer lípidos específicos. Slayden etal. utilizaron una mezcla de cloroformo:metanol más acetona para recuperar específicamente glicolípidos como TDM o TMM32. En conjunto, los métodos publicados se basan en exponer las células micobacterianas a diferentes concentraciones de disolventes, principalmente cloroformo y metanol. Asimismo, ocasionalmente se añaden algunas sales para descartar otros componentes celulares presentes en la muestra.
Además de los lípidos unidos no covalentemente, también se muestra la extracción de ácido micólico mediante dos procedimientos diferentes. Mientras que la metanolisis ácida permite la fácil extracción de ácidos micólicos con reactivos menos peligrosos, el procedimiento de saponificación conserva la estructura de todos los tipos de ácido micólico, incluido el ácido micólico tipo V, que se escinde durante los procedimientos de metanolisis. Una vez que se extraen los lípidos, 1D- o 2D-TLC son métodos estándar para monitorearlos, y el ensayo utilizado varía dependiendo de las características fisicoquímicas de los lípidos. La polaridad y el tamaño de cada molécula determinarán la selección del sistema de elución necesario, permitiendo la determinación de los lípidos que forman parte de la micobacteria. El TLC unidimensional se puede elegir cuando los factores de retención (Rf) entre los lípidos micobacterianos son diferentes, mientras que el 2D-TLC facilita la visualización cuando diferentes lípidos comparten el peso molecular y las características de polaridad. Para facilitar la identificación, los lípidos purificados deben ejecutarse en paralelo a la muestra extraída para comparar Rf similares. La identificación de un lípido se puede lograr cuando funciona con el mismo Rf que el del control purificado conocido al menos en dos sistemas TLC (dos fases móviles diferentes). Los lípidos purificados se pueden obtener de proveedores comerciales o de laboratorios de investigación de micobacterias. Finalmente, la naturaleza bioquímica de la molécula indica qué tinción se puede utilizar para revelar placas de TLC. Existen métodos de tinción universales, como el ácido fosfomolídico, que permite visualizar la visualización de cualquier componente orgánico a medida que se une a los enlaces de carbono. Mientras que otros como el a-naftol o el antrono proporcionan colores específicos a los residuos de azúcar, el azul de molibdeno se une específicamente a los residuos de fosfato.
La consideración más importante para analizar el contenido lipídico de las micobacterias es evitar el uso de material plástico durante todo el procedimiento, ya que el contacto de disolventes orgánicos con plástico puede contaminar las muestras y se puede observar en las placas TLC. También es relevante considerar que la composición del medio de cultivo utilizado para el cultivo de micobacterias, así como la temperatura o los días de incubación, pueden modificar el patrón lipídico de cada micobacteria, como se describió anteriormente16. Las micobacterias cultivadas en medios líquidos y sólidos se pueden utilizar para extraer los lípidos ligados no covalentes o los ácidos micólicos. Al obtener células de cultivo líquido, deben filtrarse y secarse adecuadamente para evitar la presencia de medios líquidos en la muestra. Además, cuando se utilizan micobacterias de medios líquidos, las bacterias deben cultivarse de manera adecuada e igualitaria entre experimentos para obtener resultados reproducibles a lo largo del tiempo. Además, las células micobacterianas también se pueden cultivar en películos17,33,34,35,36,de los cuales los lípidos más externos pueden recuperarse utilizando solventes orgánicos y monitoreados por TLC, como mostramos en el presente artículo.
La principal limitación de los procedimientos de extracción de lípidos micobacterianos sigue siendo la utilización de disolventes tóxicos en condiciones seguras. El procedimiento TLC es menos sensible que otras técnicas, como la cromatografía de gases o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Además, TLC no permite la cuantificación de muestras, y es necesario aplicar técnicas adicionales para identificar la estructura de los compuestos extraídos. Por ejemplo, la resonancia magnética nuclear debe realizarse para distinguir los isómeros lipídicos. Cabe destacar que para describir la estructura de un lípido micobacteriano por primera vez, se requiere espectrometría de masas o espectroscopia infrarroja. Por lo tanto, el análisis cuantitativo y cualitativo de las clases de lípidos normalmente requiere combinaciones de diferentes métodos de extracción, derivatización, cromatografía y detección, como la cromatografía líquida de alto o ultra rendimiento, la espectrometría de masas en tándem y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear37,38,39,40. Estudios recientes han demostrado que el uso de una técnica de detección de cromatografía de capa delgada de un solo paso-ionización de llama permite la cuantificación y el cribado preliminar de ácidos micólicos en Actinobacteria41. Sin embargo, TLC es una técnica extremadamente útil, que ahorra tiempo y es barata para detectar y evaluar la composición lipídica de las micobacterias. En general, los procedimientos presentados aquí son altamente versátiles proporcionando herramientas básicas para analizar la característica más relevante de las células de micobacterias: su compleja pared celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-098777-B-I00), los Fondos FEDER y la Generalitat de Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido es beneficiaria de un contrato de doctorado (FI) de la Generalitat de Catalunya.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
