Summary
In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.
Abstract
Celspreiding is een dynamisch proces waarbij een cel die in media is opgehangen zich hecht aan een substraat en zichzelf afvlakt van een afgeronde naar een dunne en uitgespreide vorm. Na de aanhechting tussen cel en substraat vormt de cel een dun vel lamellipodie dat uit het cellichaam komt. In de lamellipodia polymeriseren bolvormige actine (G-actine) monomeren tot een dicht filamenteus actine (F-actine) gaaswerk dat tegen het plasmamembraan duwt, waardoor de mechanische krachten worden geleverd die nodig zijn om de cel te verspreiden. Met name de moleculaire spelers die de actinepolymerisatie in lamellipodia beheersen, zijn essentieel voor veel andere cellulaire processen, zoals celmigratie en endocytose.
Sinds het verspreiden van cellen continue lamellipodie vormt die de hele celperiferie overspannen en voortdurend naar buiten uitzetten, zijn celspreidingstesten een efficiënt hulpmiddel geworden om de kinetiek van lamellipodiële uitsteeksels te beoordelen. Hoewel verschillende technische implementaties van de celverspreidingstest zijn ontwikkeld, ontbreekt momenteel een gedetailleerde beschrijving van de workflow, die zowel een stapsgewijs protocol als rekentools voor gegevensanalyse zou bevatten. Hier beschrijven we de experimentele procedures van de celverspreidingstest en presenteren we een open-source tool voor kwantitatieve en onbevooroordeide analyse van celranddynamiek tijdens het verspreiden. In combinatie met farmacologische manipulaties en/of gen-dempingstechnieken is dit protocol vatbaar voor een grootschalig scherm van moleculaire spelers die lamellipodiële uitsteeksels reguleren.
Introduction
Lamellipodiale uitsteeksels zijn prominente cytoskeletstructuren gevormd aan de voorkant van een migrerende cel. In lamellipodia creëert polymerisatie van actine met behulp van het Arp2/3-complex en formines een snelgroeiend vertakt actinegaaswerk dat tegen het plasmamembraanduwt 1,2. De duwkracht die door het actinenetwerk wordtgegenereerd,drijft de cel fysiek naar voren1,3,4,5. Uitputting van het Arp2/3-complex of verstoring van signaleringsroutes die essentieel zijn voor lamellipodiële uitsteeksels, tasten vaak de celmigratie aan6, 7. Hoewel migratie van lamellipodia-deficiënte cellen ook is gemeld8,9, is het belang van lamellipodie bij celmigratie duidelijk , aangezien uitputting van deze uitstekende structuur het vermogen van de cel om zich door complexe biologische micromilieus te bewegen6,10verstoort .
Een belangrijke belemmering voor het begrijpen van de regulatie van lamellipodia in migrerende cellen is de natuurlijke variabiliteit in lamellipodiële uitsteekkinetiek, grootte en vorm11,12,13,14. Bovendien hebben recente studies aangetoond dat lamellipodia complex uitstekend gedrag vertonen, waaronder fluctuerende, periodieke en versnellende uitsteeksels14,15. In vergelijking met de zeer variabele lamellipodia van migrerende cellen6,16, zijn lamellipodia gevormd tijdens celverspreiding uniformer12. Aangezien de uitstekende activiteit van het verspreiden en migreren van cellen wordt aangedreven door identieke macromoleculaire assemblages, waaronder een vertakt actinenetwerk, contractiele actomyosinebundels en op integrin gebaseerde celmatrixadhesie17,18, zijn spreidcellen veel gebruikt als model voor het onderzoeken van de regulatie van lamellipodiadynamiek.
Celspreiding is een dynamisch mechanochemisch proces waarbij een cel in suspensie zich eerst aan een substraat hecht door adhesies op basis van integrin17,19,20 en vervolgens verspreidt door actinegebaseerde uitsteeksels21,22,23uit te breiden . Tijdens de verspreidingsfase steken lamellipodia afkomstig van het cellichaam isotropisch en aanhoudend uit met weinig tot geen intrekking of vertraging12. De meest gebruikte celverspreidingsprotocollen zijn eindpunttesten, waarbij spreidcellen op verschillende tijdstippen na plating19,24worden gefixeerd . Deze tests, hoewel snel en eenvoudig, zijn beperkt in hun diagnostische vermogen om veranderingen in de dynamische kenmerken van lamellipodia te detecteren. Om de moleculaire mechanismen te bepalen die de lamellipodiedynamiek beheersen, pionierde de Sheetz-groep met het gebruik van kwantitatieve analyse van levende verspreidingscellen en ontdekte veel fundamentele eigenschappen van celranduitsteeksels11,12,22. Deze studies hebben aangetoond dat de levende celspreidingstest een robuuste en krachtige techniek is in de gereedschapskist van een celbiologisch laboratorium. Desondanks zijn een gedetailleerd protocol en een open-source computationele tool voor een live-cell spreading assay momenteel niet beschikbaar voor de celbiologiegemeenschap. Hiertoe schetst ons protocol de procedures voor het weergeven van levende verspreidingscellen en biedt het een geautomatiseerde tool voor beeldanalyse. Om deze methode te valideren, gebruikten we Arp2/3-remming als een experimentele behandeling en toonden we aan dat het remmen van de functie van het Arp2/3-complex de celspreiding niet arresteerde, maar een aanzienlijke vermindering van de uitsteeksnelheid van cellen veroorzaakte, evenals de stabiliteit van celranduitsteeksels, waardoor gekartelde celranden ontstonden. Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van live-cell imaging en geautomatiseerde beeldanalyse een nuttig hulpmiddel is voor het analyseren van celranddynamica en het identificeren van moleculaire componenten die lamellipodia reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel zaaien
OPMERKING: Het beschreven celverspreidingsprotocol werd uitgevoerd met behulp van embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen die PH-Akt-GFP (een fluorescerende marker voor PIP3/PI(3,4)P2) uitdrukken. Deze cellijn werd gegenereerd door genomisch een expressieconstructie voor PH-Akt-GFP (Addgene #21218) te integreren door CRISPR-gemedieerde genbewerking. Andere fluorescerende markers die tijdelijk worden uitgedrukt of geïntegreerd in het genoom kunnen echter ook in deze test worden gebruikt. Voor een optimale beeldsegmentatie raden we aan fluorescerende markers te gebruiken die gelijkmatig in het cytoplasma zijn verdeeld, bijvoorbeeld cytosolische GFP.
- Kweek een schaal van 10 cm cellen tot 90% samenvloeiing.
- Zodra de cellen de juiste samenvloeiing hebben bereikt, plaatst u een afdeklip van 22 mm x 22 mm (#1,5; dikte van 0,17 mm) in een celkweekschaal van 35 mm. Bekleed de afdeklip met 400 μL fibronectine die in PBS is verdund tot een eindconcentratie van 2,5 μg/ml.
OPMERKING: Het aantal deklips dat nodig is voor de test wordt bepaald door het aantal experimentele omstandigheden en de technische replica. - Plaats de schaal van 35 mm met de fibronectine-gecoate afdeklip gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
- Haal de schaal met de afdeklip uit de incubator. Aspireer de fibronectine en was de afdeklip met PBS door de afdeklip twee tot drie keer voorzichtig rond te gieten.
- Aspireer de celkweekmedia uit de 10 cm celschaal en was de schaal met PBS.
- Voeg 650 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de 90% samenvloeiende schaal van cellen, waarbij de schaal wordt gekanteld om het enzym gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal met de trypsine 1 minuut in de incubator.
- Verwijder de schaal met de cellen uit de incubator. Voeg 10 ml celkweekmedia toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg snel nog eens 10 ml media toe aan de schaal om de trypsine te doven.
- Pipetteer 1 ml van de trypsinized cellen in de centrifugebuis van 15 ml om de cellen te verdunnen. Pipetteer de inhoud van de buis op en neer om een gelijkmatige verdeling van cellen in de media te garanderen. Voor celtypen met een hoge aggregatiereeriteit wordt het filteren van cellen door een celzeef (maaswijdte van 100 μm) aanbevolen om het optreden van celklonteren te minimaliseren.
- Pipet 500 - 1000 μL verdunde cellen uit de buis met de afdeklip.
- Schud de schaal voorzichtig om de cellen gelijkmatig uit te spreiden. Zorg ervoor dat de coverslip zich op een ~10% samenvloeiing (~50.000 cellen/ml) bevindt en pas het volume verdunde cellen indien nodig aan.
OPMERKING: Het doel van het hebben van cellen bij zo'n lage samenvloeiing is om ervoor te zorgen dat er 1-2 gepolariseerde cellen in elk gezichtsveld zijn die zullen worden gebruikt om het doel te concentreren tijdens de celverspreidingsverwerving. - Passage 1/5 van de resterende cellen in de 10 cm schaal in één 6 cm schaal per behandelingsconditie. Plaats de door gevoerde vaat en de 35 mm schotel met de deksellip een nacht in de broedmachine.
OPMERKING: Dit zijn de cellen die worden geanalyseerd voor het verspreiden van dynamiek.
2. Incubatie van geneesmiddelen en celherstel
- Voeg 5 ml celkweekmedia toe aan elk van de twee centrifugebuizen van 15 ml en 20 ml fenolroodvrije DMEM in elk van de twee centrifugebuizen van 50 ml.
OPMERKING: Het aantal buisparen (15 ml + 50 ml) moet overeenkomen met het aantal experimentele omstandigheden. - Om het belang van Arp2/3 voor celverspreiding te testen, pipeteert u ofwel de farmacologische remmer van Arp2/3, CK-666, ofwel de controlebehandeling, zoals DMSO, in elk paar centrifugebuizen tot de gewenste concentratie.
- Verwijder de door de gangen gepasseerde schotels van 6 cm (zie stap 1.11) uit de incubator en aspireer de media. Was de afwas met warme PBS.
- Voeg de inhoud van de CK-666- of DMSO-aangevulde centrifugebuizen van 15 ml toe aan elk van de doorgepasseerde schotels. Etiketeer elk gerecht met de juiste medicamenteuze behandeling en plaats de gerechten gedurende een uur in de incubator.
- Haal de vaat uit de couveuse en aspireer de media. Was de vaat met warme PBS om alle resterende fenolrode media grondig te verwijderen.
- Voeg 230 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan elke schaal van 6 cm en incubeer cellen gedurende 1 minuut.
OPMERKING: Indien van toepassing kan trypsine worden vervangen door een niet-proteolytische celadhesieblokker. - Haal de vaat uit de couveuse. Voeg voor elke behandeling 5 ml met geneesmiddelen aangevulde fenolvrije DMEM toe aan een centrifugebuis van 15 ml die is aangeduid als "tube B". Voeg nog eens 5 ml van hetzelfde medium toe aan de betreffende schaal om de trypsine te doven. Breng de inhoud van de schaal over in een centrifugebuis van 15 ml die is aangeduid als "Buis A".
- Breng 1 ml cellen over van buis A naar buis B. Herhaal dit voor elke behandeling.
- Plaats buizen A en B gedurende 45 minuten in de incubator zodat cellen kunnen herstellen van trypsinisatie. Maak de dop van de centrifugebuizen iets los voordat u ze in de incubator plaatst om CO 2-penetrantie mogelijk te maken.
OPMERKING: De duur van de hersteltijd kan variëren voor verschillende celtypen. Hoewel in onze experimenten 45 minuten lang herstel een verwaarloosbaar effect had op de levensvatbaarheid van cellen, kunnen sommige celtypen anoiki's ondergaan wanneer ze te lang in suspensie worden gehouden. Daarom raden we aan om de optimale hersteltijd empirisch te bepalen. De optimale hersteltijd maakt snelle en synchrone celverspreiding mogelijk zonder dode of apoptotische cellen in het monster.
3. Magnetische kamervoorbereiding
- Zorg ervoor dat alle delen van een 1 well chamlide cel magnetische kamer die plaats biedt aan een 22 mm x 22 mm vierkante afdeklip zijn gereinigd voor gebruik.
- Verwijder de schaal van 35 mm met de afdeklip (zie stap 1.11) uit de incubator. Aspireer de celkweekmedia en was de coverslip met warme PBS.
- Verwijder de afdeklip van de 35 mm schotel met een tang en leg de afdeklip voorzichtig op de bodemplaat van de magneetkamer.
- Plaats de siliconen pakking op de afdeklip.
OPMERKING: Een verkeerd geplaatste siliconen pakking is de meest voorkomende oorzaak van een lekkende magnetische kamer. Zorg ervoor dat de pakking in het inspringingspunt van de bodemplaat rust en niet verder uitstijgt dan het inspringingspunt. - Bevestig het hoofdlichaam op de bodemplaat.
OPMERKING: Doe dit deel heel langzaam. Een goede tip is om de bodemplaat met één hand vast te houden terwijl je het hoofdlichaam erop plaatst. Dit zorgt ervoor dat de magneten van het hoofdlichaam de bodemplaat niet optillen, wat de afdeklip mogelijk kan verplaatsen en barsten. - Voeg 1 ml met geneesmiddelen aangevulde fenolvrije DMEM toe aan de magnetische kamer. Neem een pluisvrij weefsel en dep de behuizing voorzichtig tussen het hoofdlichaam en de bodemplaat om te controleren op eventuele lekken.
OPMERKING: Als er lekkage is, moet u de media snel aspireren en vanaf stap 3.4 opnieuw te werk gaan. - Laat het transparante deksel op het hoofdlichaam zakken om de magnetische kamer te omsluiten.
- Spuit eerst een laboratoriumweefsel met water en veeg de bodem van de magnetische kamer af (de afdeklip, niet het metalen deel). Spuit daarna een tweede laboratoriumweefsel met een kleine hoeveelheid van 70% ethanol en veeg af, waarbij u voorzichtig bent om de afdeklip niet te kraken.
4. Beeldverwerving
- Verwarm de stage top incubator en de objectieve heater voor op 37 °C en stel het CO2-niveau in de stage top incubator in op 5%.
OPMERKING: Als de stage top incubator niet is aangesloten op een CO2-voeding, moeten de celkweekmedia worden aangevuld met 25 mM HEPES om een constante pH 7,4 te behouden. - Breng voldoende dompelolie aan op de voorverwarmde 60X, 1.4 N.V. oliedoelstelling.
OPMERKING: We gebruiken een 60X, 1.4 N.A. olie-onderdompelingsdoelstelling in dit protocol vanwege het redelijk grote gezichtsveld en de uitstekende efficiëntie van de lichtafname. Als een groter gezichtsveld vereist is, kan een lagere vergrotingsdoelstelling(bijv.20x) worden gebruikt zolang de signaal-ruisverhouding van de beelden groter is dan 2,5. - Breng zowel de voltooide magneetkamer als buis B (stap 2.9) naar de confocale microscoop. Plaats de magnetische kamer op de incubator van het podium.
OPMERKING: Plaats de magneetkamer voorzichtig op het podium om te voorkomen dat er bellen in de dompelolie ontstaan. - Stel de focus in op de fluorescerende cellen met behulp van het GFP-kanaal. Zorg ervoor dat de celrand scherp en goed gedefinieerd is.
- Verwijder het transparante deksel van de magneetkamer en pipet 500 μL van buis B in de magneetkamer. Plaats het transparante deksel terug op de magnetische kamer.
- Om cellen te identificeren die ideaal zijn voor celverspreidingsanalyse, zoekt u naar "halo's" van cellen die zich nog aan de coverslip moeten hechten, maar niet meer rondrollen. Cellen die zich in de vroegste stadia van coverslip-bijlage bevinden, zijn ook geweldige kandidaten, maar beeldverwerving moet snel zijn om verspreiding vast te leggen.
- Configureer de time-lapse-afbeeldingsaanwinst voor het groene kanaal met vier weergavevelden, met intervallen van 6 seconden.
OPMERKING: Vanwege de hoge variabiliteit van de uitsteeksnelheid van lamellipodia tussen verschillende celtypen, moet de optimale framesnelheid empirisch worden bepaald. Het beeldvormingsinterval van 6 seconden dat in onze experimenten wordt gebruikt, is een goed uitgangspunt voor de analyse van veel mesenchymale en epitheelcellen. Cellen die zich echter zeer snel verspreiden(bijv.immuuncellen) kunnen een veel hogere framesnelheid (korter beeldinterval) vereisen. De optimale framesnelheid voor celverspreidingsfilms zorgt voor een verplaatsing van 2-5 pixels van de uitstekende celrand tussen volgende frames. Gezien de nauwkeurigheid van de curve fitting die wordt gebruikt om het plateau van celspreiding te identificeren, moet de optimale framesnelheid ook zorgen voor 50-100 metingen van celrandverplaatsing tijdens de snelle expansiefase van celverspreiding. Het aantal gezichtsvelden moet worden aangepast afhankelijk van de belichtingstijd, de afstand tussen acquisitiepunten en de snelheid van de podiumbeweging. Gebruikers wordt geadviseerd om het maximale aantal weergavevelden te bepalen dat kan worden verkregen met de gewenste framesnelheid. - Nadat u een geschikt gezichtsveld hebt geïdentificeerd, slaat u de X- en Y-coördinaten van het microscoopstadium op. Ga verder met het identificeren van drie andere gezichtsvelden die relatief dicht bij elkaar liggen op de coverslip. Bewaar de coördinaten van het microscoopstadium voor elk gewenst gezichtsveld.
OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om het fasebewegingspad tussen gezichtsvelden te optimaliseren om onnodige monsterbewegingen te minimaliseren. Een dergelijke optimalisatie kan handmatig of automatisch worden uitgevoerd. Overmatige monsterbeweging vertraagt de verwerving en kan ertoe leiden dat cellen uit het zicht rollen terwijl ze afdalen. - Verzamel afbeeldingen gedurende 15 minuten met een framesnelheid van 6 seconden en sla de bestanden op. Als er meer acquisities nodig zijn, herhaalt u dit vanaf stap 4.6.
5. Analyse van celgebied, circulariteit en uitsteekdynamiek tijdens celverspreiding
- Afbeeldingen voorbereiden op gegevensverwerking en -analyse
OPMERKING: De software vereist een afbeelding in .tiff formaat en een pixelgrootte als invoerparameters. Aan beide vereisten kan worden voldaan met behulp van de acquisitiesoftware of Fiji (in dit protocol). Als aan deze vereisten is voldaan, gaat u verder met stap 5.2.- Installeer de nieuwste versie van fiji applicatie (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Open een time-lapse-afbeelding met Fiji.
- Kopieer de pixelgrootte van de afbeelding door Afbeelding > eigenschappente selecteren. Kopieer en plak de pixelgrootte in μm naar Kladblok/Word.
- Sla voor de analyse van het celspreidingsgebied en de circulariteit de timelapse-afbeelding op als een tiff-afbeeldingsstapel. De op maat gemaakte analysesoftware ondersteunt geen eigen bestandsindelingen. Sla de afzonderlijke cel tiff-afbeeldingsstapel op door Bestand > Opslaan als > Tiff teselecteren.
- Installeer de Python IDE (Spyder) en de benodigde pakketten(PySimpleGUI en tifffile)voor gegevensverwerking en analyse.
OPMERKING: De installatie van Python en pakketten is alleen vereist voor de eerste installatie.- De timelapse-films worden geanalyseerd in de Spyder IDE met behulp van een op maat gemaakt Python-script. Om de Spyder IDE te downloaden, downloadt u de Anaconda-distributeur (https://www.anaconda.com/products/individual) die Spyder IDE en de meeste noodzakelijke bibliotheken en pakketten voor deze analyse bevat.
- Installeer Anaconda en lanceer Spyder via Anaconda Navigator.
- Kopieer en plak op het tabblad IPython-console (rechtsonder in Spyder) de volgende opdracht: pip installeer PySimpleGUI en druk op de enter-toets. Als u deze opdracht uitvoert, wordt het pakket geïnstalleerd dat nodig is om de grafische gebruikersinterface (GUI) te starten.
- Kopieer en plak in dezelfde console de volgende opdracht: pip install tifffile en druk op enter. Als u deze opdracht uitvoert, wordt het pakket geïnstalleerd dat nodig is om afbeeldingen op te slaan als tiff-bestanden.
- Download alle Python-scripts uit de aanvullende bestanden of de meest bijgewerkte scripts van GitHub op: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
- Celgebied en celvormfactoren kwantificeren tijdens celverspreiding
- Open het hoofdanalysescript "cell_spreading_GUI.py" door de optie Bestand openen in het bovenste paneel van Spyder te selecteren of de sneltoets Ctrl + O te gebruiken.
- Open de GUI voor celverspreidingsanalyse door "Bestand uitvoeren" in het bovenste paneel te selecteren of de snelkoppeling F5te gebruiken.
- Klik op het tabblad Celspreidingsgebied (figuur 3A).
- Selecteer de tiff-afbeelding die moet worden geanalyseerd met behulp van de bladerknop.
OPMERKING: Het geselecteerde bestand moet een tiff-bestand zijn. - Geef de doelmap op waar gegevensuitvoer (bijvoorbeeld celmaskers, waarden) wordt opgeslagen.
- Geef de instellingen voor gegevensuitvoer op:
- Maskers opslaan: sla celmaskers op die tijdens het segmentatieproces zijn gegenereerd.
- Gegevens exporteren: Exporteer een Excel-spreadsheet (.xlsx) dat alle analysegegevens bevat naar de doelmap.
Celgebied, circulariteit en beeldverhouding van alle spreidcellen worden opgeslagen als Excel-spreadsheet in de doelmap. Het celgebied wordt berekend als:
De cel circulariteit is een maat voor hoe dicht een cel bij een perfect ronde cel is. Het wordt berekend als:
waarbij A en P respectievelijk het celgebied en de celomtrek zijn. De beeldverhouding van de cel geeft aan hoe langgerekt de cel is. Een spreidcel moet een beeldverhouding van bijna 1 hebben. De beeldverhouding wordt berekend als:
- Contouren opslaan: Sla de contouroverlayafbeeldingen voor celgrenscontouren op in de doelmap.
- Geef de segmentatie-instellingen op
- Segmentatie weergeven: Toon het segmentatieresultaat in de Spyder-console tijdens het analyseproces.
- Kleinste celgebied (μm2):Voer de minimumwaarde voor celgebied in, inclusief gebiedswaarden van cellen in de beginfasen van de aanhechting. Objecten met een gebied dat kleiner is dan deze drempelwaarde, worden niet beschouwd als spreidcellen. Dit nummer is van invloed op het segmentatieproces.
- Geef de afbeeldingsparameters op.
- Acquisitie-interval(s): Voer de frequentie van de beeldverwerving in seconden in.
- Pixelgrootte (μm): Voer de pixelgrootte in die is vastgelegd bij het voorbereiden van afbeeldingen voor analyse.
- Beeldbitdiepte: Voer de bitdiepte van de camera/detector in.
- Klik op Uitvoeren. Als er een fout optreedt, verschijnt er een foutbericht in de console van Spyder. Anders wordt het beeldanalyseproces weergegeven in de console.
OPMERKING: De eerste afbeelding die wordt weergegeven in de sectie console/plots (afhankelijk van de Spyder-instellingen) toont alle cellen die in het gezichtsveld zijn geïdentificeerd. Groene vakjes rond de cellen geven spreidcellen aan die geschikt zijn voor segmentatie en analyse. Grijze vakken geven cellen aan die niet geschikt zijn voor analyse. Het totale aantal geïdentificeerde spreidcellen wordt ook weergegeven op het tabblad Console. De software plot het celgebied (in blauw) en cel circulariteit (in rood) als functie van de tijd. Met deze grafieken kunnen gebruikers de nauwkeurigheid van celsegmentatie evalueren. Een succesvolle segmentatie levert een monotoon stijgende curve op voor het celgebied. Om een representatieve curve van het celspreidingsgebied te verkrijgen, moet de vertragingsfase handmatig uit de grafiek worden verwijderd. De vertragingsfase omvat metingen van het celgebied voordat de cel zich begint te verspreiden. De vertragingsfase wordt aangegeven door snelle fluctuaties, zoals weergegeven in het celgebiedsperceel(figuur 3C rechts).
6. Kwantificeer de dynamiek van de celrand tijdens het verspreiden van cellen met behulp van kymografieën
- Voordat u de analyse uitvoert, snijdt u de onbewerkte films van het verspreiden van cellen bij om tijdreeksen van individuele spreidcellen te maken.
- Gebruik het gereedschap Rechthoek op de werkbalk Fiji om handmatig een interessegebied (ROI) te selecteren dat één celinkapselt. (Om ervoor te zorgen dat de ROI de spreidcel volledig inkapselt, gebruikt u de scrollfunctie om de ROI op alle tijdstippen te inspecteren.)
- Klik met de rechtermuisknop op de ROI en selecteer Dupliceren.
- Vink Dubbele stapel aan en klik op OK.
- Open het hoofdanalysescript "cell_spreading_GUI.py" door de knop Bestand openen in de gereedschapsbalk van Spyder te selecteren of de sneltoets Ctrl + O te gebruiken. Als de GUI al is geopend, gaat u rechtstreeks naar stap 6.3.
- Open de GUI voor celverspreidingsanalyse door Bestand uitvoeren in het bovenste paneel te selecteren of de snelkoppeling F5 (figuur 3B) te gebruiken.
- Klik op het tabblad Kymograph generator & analyse.
- Gebruik de bladerknop om de tiff-afbeelding voor de analyse te selecteren.
OPMERKING: Eigen bestandsindelingen, bijvoorbeeld nd2, lif, zen, worden niet ondersteund door het script. - Geef de doelmap op om de uitvoergegevens (celmaskers en waarden) op te slaan.
- Geef de uitvoerinstellingen op.
- Gegevens exporteren: Exporteer een Excel-spreadsheet (.xlsx) naar de doelmap met relatieve celrandposities en intrekkingsgebeurtenissen van de kymografieën.
- Geef de afbeeldingsparameters op:
- Acquisitie-interval(s): Voer de frequentie van beeldverwerving in seconden in.
- Pixelgrootte (μm): Voer de pixelgrootte in die is opgenomen bij het voorbereiden van afbeeldingen voor de analyse in stap 5.1.3.
- Kleinste celgebied (μm2):Voer de minimumwaarde voor celgebied in, inclusief gebiedswaarden van cellen in de beginfasen van de aanhechting. Objecten met een gebied dat kleiner is dan deze drempelwaarde, worden niet beschouwd als spreidcellen. Dit nummer is van invloed op het segmentatieproces.
- Beeldbitdiepte: Voer de bitdiepte van de camera/detector in.
- Klik op Uitvoeren. Als er een fout optreedt, verschijnt er een foutbericht in de console van Spyder. Anders wordt een samenvatting van de kwantificeringen van de uitsteekdynamiek weergegeven in de console. Er zullen 4 paar intrekfrequentie en uitsteeksnelheidsmetingen zijn, die worden geëxtraheerd uit 4 kymografieën die worden gegenereerd uit de bovenste, onderste, linker- en rechtergedeelten van de cel. De intrekfrequentie wordt berekend als:
OPMERKING: Dit getal geeft aan hoe vaak het lamellipodium zich tijdens het verspreiden terugtrekt. De gemiddelde uitsteeksnelheid wordt gemeten aan de hand van de helling tussen het begin van het uitsteeksel en het plateaupunt op de kymografie. Een samenvattend kymografiecijfer wordt na de segmentatie in de console weergegeven. Als u het overzichtscijfer wilt opslaan, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding en slaat u de afbeelding op.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedures voor de live-cell imaging van spreading cells en een computational tool voor de kwantitatieve analyse van celspreidingsdynamiek. De computationele tool kan worden gebruikt in een formaat met lage of hoge doorvoer om de moleculaire spelers te identificeren die de actinepolymerisatiemachines aan de voorrand van de cel reguleren.
De schematische weergave van de experimentele procedures is weergegeven in figuur 1. De celverspreidingstest werd uitgevoerd op vereeuwigde muisembryofiblasten die het pleckstrine homologie (PH) domein van het Akt-eiwitkinase met eGFP25stabiel uitdrukken. De cellen werden losgemaakt met trypsine-EDTA en mochten 45 minuten in suspensie herstellen. Tijdens de herstelstap vulden cellen hun integrinreceptoren op het plasmamembraan aan, zoals aangegeven door de snelle en synchrone hechting van de teruggewonnen cellen aan de fibronectine gecoate coverslips (Figuur 2). Zonder de herstelperiode vertoonden de spreidende cellen een brede verdeling van de celgrootte, wat wijst op een hoge variabiliteit bij het begin van de celverspreiding (figuur 2A en B). Vervolgens werden cellen geplateerd op een fiduciaal gemarkeerde coverslip en hun verspreidingsdynamiek werd gevisualiseerd door het draaien van schijfconocale microscopie (schema's weergegeven in figuur 1A - H). Tijdens de beeldverwerving hebben we gekeken naar gezichtsvelden met cellen met een signaal-ruisverhouding van 2,5 of hoger. Dit was een belangrijke overweging omdat de daaropvolgende beeldsegmentatie gevoelig is voor de fluorescentie-intensiteit van de cellen ten opzichte van de achtergrond. In onze experimenten kregen we elke 6 seconden beelden gedurende 15 minuten(schema's weergegeven in figuur 1I-J). In overeenstemming met eerdere rapporten16zorgde beeldvorming met een framesnelheid van 6 seconden voor voldoende temporele resolutie voor het vastleggen van de dynamiek van individuele uitsteek- en terugtrekgebeurtenissen, terwijl we tegelijkertijd verschillende gezichtsvelden konden verwerven. De resulterende time-lapse-afbeeldingen zijn geanalyseerd met behulp van de op maat gemaakte Python-software (figuur 3).
Een onbevooroordete kwantificering van celspreiding werd uitgevoerd met behulp van twee verschillende analytische procedures: (i) Morfodynamische profilering van spreidcellen (figuur 3A, C en 4) en (ii) Kymografische analyse van de dynamiek van de celrand (figuur 3B en 5). De analyse van celspreiding door morfodynamische profilering omvat de geautomatiseerde detectie van de spreidende en fiduciale cellen in het gezichtsveld(figuur 3C links),gevolgd door een frame-voor-frame beeldsegmentatie en detectie van de grens van de spreidende cel. De segmentatie wordt uitgevoerd door globale intensiteit die de afzonderlijke frames drempelt. De drempelwaarde wordt berekend als het lokale minimum tussen de eerste en tweede intensiteitsmodus op het beeld histogram26. Afbeeldingen met een unimodaal, rechts scheef histogram worden gesegmenteerd door het driehoeksdrempelalgoritme27. Na celsegmentatie werden de morfodynamische kenmerken van de spreidcellen (d.w.z. celgebied, beeldverhouding en celcirculaire) berekend (figuur 3C rechts).
In overeenstemming met de gepubliceerde resultaten12,28, werd de celspreiding gedreven door een isotrope expansie van lamellipodia , zoals aangegeven door een sigmoidale vorm op het representatieve celgebiedsperceel (figuur 3C rechts, blauwe curve en S1). Uit het gebiedsperceel bleek dat het celoppervlak ongeveer 3 keer zo groot werd voordat het een plateau bereikte (figuur 4A en B). Tijdens het proces van celverspreiding bleven de cellen circulair (circulariteit = 0,70 ± 0,076) en vertoonden ze sluierachtige uitstekende celranden, die indicatief zijn voor lamellipodiële uitsteeksels (figuur 4C).
Om de celverspreidingstest te valideren, remden we Arp2/3 met 100 μM CK-666 gedurende 1 uur en 45 minuten en beoordeelden we het effect van deze behandeling op de celspreidingsdynamiek. In overeenstemming met eerdere rapporten13heeft de onderdrukking van de Arp2/3-activiteit niet tot een significante afname van de celspreidingssnelheid (figuur 4A en B, roze curve) . De celvormanalyse toonde echter een significant verschil aan in de circulariteit van de controle en de met CK-666 behandelde cellen (Controle: 0,70 ± 0,08 vs. CK-666: 0,54 ± 0,09, p < 0,1 x 10-3) (figuur 4C). Terwijl de controlecellen cirkelvormig bleven tot het plateau, kregen Arp2/3-geremde cellen een veelhoekige vorm die tijdens de verspreiding werd behouden (figuur 4A). Samen tonen deze experimentele resultaten aan dat de beschreven celverspreidingstest matige veranderingen in de celmorfodynamica onthult die worden veroorzaakt door verstoringen van de actinepolymerisatiemachines.
Hoewel morfodynamische profilering vaak voldoende is om grove veranderingen in de celspreidingsdynamiek te detecteren, heeft deze analyse een beperkt vermogen om specifieke cytoskeletcomponenten te identificeren die de uitsteek-retractiecycli van de celrand reguleren, wat ons ertoe aanzet om een onbevooroordeeld Kymograph Analysis-hulpmiddel te implementeren (figuur 5 links, stippellijnen). De analyse van de celrandsnelheid toonde een matige maar significante daling van de gemiddelde uitsteeksnelheid van Arp2/3-geremde cellen aan ten opzichte van de controle (Controle: 37,1 ± 12,87 nm/s vs. CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0, 9 x 10-3) ( figuur5C). Bovendien was de dynamiek van de celrand van de controle en Arp2/3-geremde cellen opmerkelijk verschillend (figuur 5A en D). De controlecellen steken voortdurend uit met weinig tot geen intrekingen tijdens de snelle expansiefase, die ongeveer 200 seconden duurde, en vertoonden intermitterende retracties tijdens de plateaufase (figuur 5A en D). Daarentegen werd de uitzetting van Arp2/3-geremde cellen ingegrepen door retractiegebeurtenissen, aangeduid met de rode stippen op de grafieken (figuur 5B en D). Kwantificering van de intrekfrequentie toonde aan dat Arp2/3-geremde cellen 26% vaker introkken dan controlecellen (Controle: 0,18 ± 0,22 s-1 vs. CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) ( Figuur5D). Deze gegevens tonen de hoge gevoeligheid van de kymografische analyse aan bij het detecteren van milde veranderingen in de lamellipodiale dynamica.
Figuur 1: De experimentele workflow van een celverspreidende test. ( A -H) Schema's van de celverspreidingstest. (A) Een afdeklip van 22 mm x 22 mm is bedekt met fibronectine verdund in PBS tot een eindconcentratie van 2,5 μg/ml. (B) Een samenvloeiende schaal van 10 cm PH-Akt-GFP-uitdrukkende embryonale fibroblasten (MEF's) wordt gewassen met PBS en behandeld met 0,05% trypsine-EDTA. De met trypsine behandelde cellen worden vervolgens opgesplitst in een centrifugebuis van 15 ml en een weefselkweekschaal van 6 cm, beide met celkweekmedia. (C) Van de centrifugebuis van 15 ml wordt 500-1000 μL op de met fibronectine bedekte afdeklip gepijpt. (D) De schaal van 6 cm en de schaal van 35 mm met de afdeklip met de schaars gezaaide cellen worden 's nachts in een incubator van 37 °C geplaatst. Eenmaal gepolariseerd, zullen deze cellen het scherpstelkader bieden voor de celverspreidingsverwerving. (E) Een uur voor het verkrijgen van het beeld worden de media van de 6 cm schotel vervangen door fenolrode vrije DMEM aangevuld met HEPES en het geneesmiddel van belang. Na 1 uur worden de cellen behandeld met 0,05% trypsine-EDTA en overgebracht naar een centrifugebuis van 15 ml (buis A) met de HEPES/drug-supplemented fenol rode vrije DMEM. De cellen in buis A worden vervolgens verder verdund in een andere centrifugebuis van 15 ml (buis B), die gedurende 45 minuten in de incubator wordt geplaatst. (F) Terwijl de cellen zich herstellen, wordt de magnetische kamer van onder naar boven voorbereid: eerst wordt de bodemplaat op een plat oppervlak geplaatst, vervolgens wordt de afdekplaat met de gepolariseerde cellen, de siliconenpakking, het hoofdlichaam van de kamer en ten slotte de transparante hoes erop gelegd. (G) 1 ml met geneesmiddelen aangevulde fenolrode vrije DMEM wordt in de magnetische kamer gepijpt, die vervolgens naar het microscoopstadium wordt gebracht. Een CFI Plan Apo Lambda 60X Oil doelstelling is geselecteerd voor beeldverwerving. (H) Het transparante deksel wordt verwijderd en 500 μL van de inhoud van buis B wordt in de magnetische kamer gepijpt. (I) Voor beeldverwerving bevatten de juiste gezichtsvelden groene "halo's", dat zijn zwevende cellen die nog niet aan de coverslip zijn bevestigd. (J) De cellen worden gedurende 15 minuten afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Het effect van hersteltijd op celverspreiding. Cellen die gedurende de aangegeven tijd in suspensie werden gehouden (celherstelstap in het protocol) werden gedurende 15 minuten geplateerd op fibronectine-gecoate coverslips, gefixeerd met 4% paraformaldehyde en afgebeeld door fasecontrastmicroscopie. (A) Bovenpanelen: fasecontrastbeelden verworven met een 20X-objectief. Onderste panelen: waterscheidingsgesegmenteerde celmaskers met de kleurgecodeerde celgebieden. (B) Kwantificering van het celgebied. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Grafische gebruikersinterface (GUI) en de werkprincipes van beeldverwerkings- en analysesoftware. (A) De GUI van het tabblad "Cell spread area". Raadpleeg stap 5.3 voor instructies. (B) De GUI van het tabblad "Kymograph generator & analysis". Raadpleeg stap 6 voor instructies. (C) De beeldverwerkingspijplijn van de software. De software identificeert eerst spreidcellen (gelabeld door een groen selectiekader) in het hele gezichtsveld. De spreidcellen worden geïdentificeerd op basis van hun intensiteitswaarde, circulariteit en beeldverhouding. De geïdentificeerde spreidcellen worden vervolgens frame voor frame gesegmenteerd met behulp van globale intensiteitsdrempels. Elk binair masker wordt verwerkt door mediaanfiltering en binaire gatvulling, gevolgd door morfologische sluiting om de celrand glad te strijken. De rode omtrek komt overeen met de gesegmenteerde celgrens. Het gebied, de beeldverhouding en de circulariteit van de cel worden geëxtraheerd uit de binaire celtoewijzing. De grafiek toont het gebied en de circulariteit van een representatieve cel in de loop van de tijd. Bij het zaaien van cellen beginnen cellen zich niet onmiddellijk te verspreiden, waardoor de vertragingsfase in de grafiek ontstaat. Na de vertragingsfase verspreiden cellen zich snel tijdens de snelle expansiefase en bereiken uiteindelijk een plateaufase. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van celspreidingsgebiedanalyse bij Arp2/3-remming. (A) Representatieve beelden van PH-Akt-GFP-expresserende MEF's die zich in de loop van 3 minuten verspreiden op een fibronectine-gecoate deklip. De rode lijn geeft de celgrens aan die wordt geëxtraheerd door het algoritme voor celsegmentatie. Toppanelen: 0,1% DMSO-behandelde cellen. Onderste panelen: 100 μM CK-666 (Arp2/3 remmer)behandelde cellen. (B) Een grafiek die celspreidingsgebied in de loop van de tijd toont. Het celspreidingsgebied werd gekwantificeerd als vouwveranderingen ten opzichte van het gemiddelde celspreidingsgebied van controlecellen. Blauwe en roze lijnen vertegenwoordigen respectievelijk controle en Arp2/3-geremde cellen. De gearceerde gebieden geven de bovenste en onderste standaardafwijking van het celspreidingsgebied aan. (C) Een staafplot met afzonderlijke gegevenspunten die de gemiddelde cel circulariteit van controle en Arp2/3-geremde cellen weergeven. Alle foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking. *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (niet significant, p > 0,05) zoals gedetecteerd door parametrische student t-tests. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van kymografische analyse van verspreidende cellen bij Arp2/3 inhibitie. (A - B) Representatieve beelden en kymografieën geëxtraheerd uit 0,1% DMSO-behandelde (controle)cellen en 100 μM CK-666-behandelde (Arp2/3-remmer) cellen. Linkerpanelen: omgekeerde grijswaardenafbeeldingen van een besturingselement en Arp2/3-geremde cel. De stippellijnen komen overeen met de vooraf gedefinieerde lijnen waar kymografieën werden geëxtraheerd. Rechterpanelen: kymografieën worden geëxtraheerd langs de stippellijnen die op de grijswaardenafbeeldingen worden weergegeven. De plotgrenzen zijn kleurgecodeerd om overeen te komen met de onderbroken lijnen op de grijswaardenafbeeldingen. De stippellijn in elk perceel geeft de helling aan van de curve waaruit de gemiddelde uitsteeksnelheid is berekend. Om de plateaufase te bepalen, werd een logistieke groeicurve op de gegevenspunten aangebracht en werd het plateau afgeleid van de parameter, c (Aanvullend figuur 1). De rode stippen geven de intrekkingsgebeurtenissen aan. (C) Een staafplot met afzonderlijke gegevenspunten die de gemiddelde uitsteeksnelheden van de controle- en Arp2/3-geremde cellen weergeven. Alle foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking. (D) Een staafplot met afzonderlijke gegevenspunten die de frequentie van intrekgebeurtenissen van de controle- en Arp2/3-geremde cellen weergeven. (C - D) *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001, n.s. (niet significant, p > 0,05) zoals gedetecteerd door niet-parametrische Mann-Whitney-tests. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Een representatieve kymografie en het resultaat van de curvemontage. Een kymografie geëxtraheerd uit een spreidende cel. De blauwe stippellijn komt overeen met de afstand van de celrand ten opzichte van het eerste frame. De rode effen lijn komt overeen met de gemonteerde curve. Om het vertrouwen van de curve fitting te vergroten, werden de ruwe datapunten eerst gladgestreken door een Savitzky-Golay filter. Na de curve-fitting werd de parameter c, uit de logistieke vergelijking, gebruikt om het plateaupunt te identificeren. Het onbewerkte gegevenspunt dat zich het dichtst bij c bevindt, wordt aangeduid als het plateaupunt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven celspreidingstest maakt het mogelijk om continu morfologische veranderingen(bijv. celgrootte en -vorm) en celrandbewegingen(d.w.z. uitsteeksnelheid en intrekfrequentie) te volgen, die kenmerken zijn die ontbreken in de meeste celspreidingsprotocollen19,24. Hoewel veelgebruikte eindpuntcelspreidingstesten de bepaling van de celspreidingssnelheid mogelijk maken, slagen deze assays er niet in om de temporele dynamiek van celrandbewegingen op te lossen. Het gebrek aan tijdsinformatie beperkt het vermogen om veranderingen in lamellipodiële uitsteek-retractiecycli te detecteren en te kwantificeren.
Onze beeldverwerkings- en analysesoftware voert een gestroomlijnde analyse uit van de spreidcellen, van celsegmentatie tot gegevenskwantificering. Handmatige beeldanalyses van celverspreiding omvatten meestal een bevooroordeelde selectie van een drempelwaarde of het toepassen van een geautomatiseerd segmentatiealgoritme, dat niet geschikt is voor experimenten met hoge doorvoer waarbij veel afbeeldingen moeten worden geanalyseerd. Onze software is daarom ontworpen om verspreidende cellen op een geautomatiseerde manier te detecteren en te segmenteren, naast het kwantificeren van uitsteekdynamiek en morfologische descriptoren. Samen maken deze functies het beschreven protocol vatbaar voor screenings met grote doorvoer van signaleringsroutes en moleculaire spelers die lamellipodia reguleren.
Om ervoor te zorgen dat de analyse van spreidcellen robuust en nauwkeurig is, moeten een paar kritieke stappen in het protocol met extra voorzichtigheid worden uitgevoerd. De eerste stap van de celverspreidingstest omvat het plateren van fluorescerend gelabelde cellen met een zeer lage dichtheid op een fibronectine-gecoate deklaag de dag voor beeldvorming (figuur 1A-D). Deze gepolariseerde cellen maken nauwkeurige scherpstelling van de uitstekende randen van de spreidcellen mogelijk tijdens de beeldverwerving. Als de dichtheid van gepolariseerde cellen te hoog is, hebben spreidcellen een grote kans om op de gepolariseerde cellen te landen of te overlappen, wat kan leiden tot een celsegmentatiefout. De herstelperiode na de trypsinisatie is een andere kritieke stap in dit protocol. Cellen die worden behandeld met het geneesmiddel van belang, bijvoorbeeld DMSO of CK-666, worden losgemaakt van de celkweekschotel door trypsine-EDTA (stap 2), gevolgd door een herstelperiode van 45 minuten (figuur 1E). Deze herstelstap stelt cellen in staat om te herstellen van het proteolytische decolleté van celoppervlakeiwitten door trypsine19,24 en synchroniseert het begin van celverspreiding ( Figuur2). Als de herstelstap wordt weggelaten, neemt de cel-naar-celvariabiliteit in het celspreidingsgebied toe, waardoor de consistentie van het biologische fenotype wordt verminderd.
Tijdens de beeldverwerving vermindert elke monsterafwijking onvermijdelijk de kwaliteit en precisie van celverspreidingsanalyse, met name de kymografische analyse. Om de monsterdrift te minimaliseren, moeten een paar maatregelen worden genomen. Eerst moet de gebruiker de fasebeweging tijdens de beeldverwerving optimaliseren. De optimalisatie omvat het minimaliseren van podiumreizen tussen gezichtsvelden en het verminderen van de snelheid van podiumbewegingen. Ten tweede is het essentieel om het monster stevig vast te stellen op het microscoopstadium. Als deze voorgestelde maatregelen de monsterafwijking niet elimineren, moet verwerking na verwerving worden overwogen. Onder veel eigen en open-source computationele tools, raden we aan om de Fiji-plug-in "Descriptor-based registration" te gebruiken om beeldverschuivingen te corrigeren en de films van het verspreiden van cellen uit te lijnen (instructies zijn te vinden op: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_ (2d / 3d)).
Opgemerkt moet worden dat de kwantitatieve analyse van celgebieden en randdynamiek die door de software wordt uitgevoerd, sterk afhangt van de nauwkeurigheid van celsegmentatie. Om een nauwkeurige segmentatie te garanderen, raden we aan om celverspreiding te visualiseren met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem, bij voorkeur een confocale microscoop met draaiende schijf die een hoge resolutie, lage fotobleaching / fototoxiciteit en een hoge signaal-ruisverhouding biedt. Een confocale microscoop verwijdert efficiënt onscherp fluorescentie die wordt uitgezonden door de spreidcellen, wat anders de nauwkeurigheid van beeldsegmentatie en celgrenstracering zou verminderen. Als een widefieldmicroscoop wordt gebruikt voor beeldverwerving, kan aanvullende postacquisitieverwerking, bijvoorbeeld beelddeconvolutie, nodig zijn om on-of-focus fluorescentie te verwijderen en de nauwkeurigheid van celsegmentatie te verbeteren. Daarom moet de keuze van het beeldvormingssysteem worden overwogen.
Binnen de beschreven software werden twee beeldsegmentatiealgoritmen geïmplementeerd en geoptimaliseerd om cellen met een zwak tot matig helder fluorescerend eiwit, zoals cytosolische groene en rode fluorescerende eiwitten (GFP en RFP)26,27,betrouwbaar te detecteren. Deze segmentatiealgoritmen hebben echter een beperkt dynamisch bereik en zijn niet geschikt voor het detecteren van cellen die zijn gelabeld met extreem heldere fluorescerende eiwitten of kleurstoffen. In onze handen hebben deze algoritmen de neiging om extreem heldere cellen te ondersegmenteren vanwege de scheefheid van het beeld histogram naar pixels met hoge intensiteit. Voor heldere monsters kunnen de intensiteiten van de beelden worden geregeld door de belichtingstijd of het uitgangsvermogen van de excitatielaser aan te passen.
Met deze overwegingen in gedachten is dit live-cell spreading protocol een robuust en krachtig hulpmiddel om de dynamiek van lamellipodia te bestuderen. Het geautomatiseerde beeldanalyseplatform is geschikt voor veel biologische onderzoeken, bijvoorbeeld screening met een hoog gehalte aan moleculaire/signaalingsfactoren die lamellipodiële uitsteeksels reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Connaught Fund New Investigator Award aan S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subsidies RGPIN-2015-05114 en RGPIN-2020-05881), University of Manchester en University of Toronto Joint Research Fund en University of Toronto XSeed Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
- Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
- Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
- Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
- Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
- Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
- Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
- Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
- Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
- Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
- Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
- Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
- Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
- Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
- Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
- Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
- Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
- Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
- Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).
