Summary
本プロトコルでは、生細胞顕微鏡に基づく細胞拡散アッセイの実験手順を提示する。蛍光標識細胞の偏りのないセグメンテーションや細胞拡散時のラメリポディアダイナミクスの定量分析のためのオープンソース計算ツールを提供します。
Abstract
細胞の拡散は、媒体に懸濁した細胞が基板に付着し、丸みを帯びた薄い広がり形状に平坦化する動的なプロセスです。細胞基板の付着に続いて、細胞は細胞体から発せられる薄いラメリポディアのシートを形成する。ラメリポディアでは、球状アクチン(G-アクチン)モノマーが、細胞膜に押し出される緻密な糸状アクチン(F-アクチン)メッシュワークに重合し、細胞が広がるのに必要な機械的力を提供する。特に、ラメリポディアにおけるアクチン重合を制御する分子奏者は、細胞移動やエンドサイトーシスなどの他の多くの細胞プロセスに不可欠です。
広がる細胞は、細胞周辺全体に広がる連続的なラメリポディアを形成し、持続的に外側に拡大するので、細胞拡散アッセイは、ラメリポジア性突起の運動を評価するための効率的なツールとなっています。細胞拡散アッセイのいくつかの技術的実装が開発されているが、データ分析のためのステップバイステップのプロトコルと計算ツールの両方を含むワークフローの詳細な説明は、現在欠けている。ここでは、細胞拡散アッセイの実験手順を説明し、広がる際の細胞エッジダイナミクスの定量的かつ公平な分析のためのオープンソースツールを提示する。薬理学的操作および/または遺伝子サイレンシング技術と組み合わせると、このプロトコルは、ラメリポアル突起を調節する分子プレーヤーの大規模なスクリーンに適しています。
Introduction
ラメリポジア性突起は、移動細胞の前部に形成される顕著な細胞骨格構造である。ラメリポディアでは、Arp2/3複合体およびフォルミンの助けを借りてアクチンを重合すると、血漿膜1,2に対して押し出される急速に成長する分岐アクチンメッシュワークが作成される。アクチンメッシュワークによって生じる押し出し力は、細胞を1、3、4、5に物理的に推進する。ラメリポジア突起に不可欠なArp2/3複合体またはシグナル伝達経路の破壊の枯渇は、しばしば細胞の移動を損なう6,7。 また、ラメリポディア欠損細胞の移動も報告されているが、8,9、細胞遊離におけるラメリポディアの重要性は、この突起構造の枯渇が、細胞が複雑な生物学的微小環境6,10を移動する能力を妨げるとして明らかである。
細胞の移動におけるラメリポディアの調節を理解する大きな障害は、ラメリポアル突起動態、サイズ、および形状11、12、13、14における自然変動である。さらに、最近の研究では、ラメリポディアは、変動、周期的、および加速する突起14,15を含む複雑な突起行動を示すことが実証されている。細胞6,16を移動させる非常に可変的なラメリポディアと比較して、細胞の広がりの間に形成されるラメリポディアはより均一である12。細胞の広がりと移動の突起活性は、分岐アクチンネットワーク、収縮アクトミオシン束、およびインテグリンベースの細胞マトリックス接着を含む同一の高分子集合体によって駆動されるため、細胞の広がりは、ラメリポディアダイナミクスの調節を調べるためのモデルとして広く用いられてきた。
細胞拡散は、懸濁液中の細胞がまずインテグリン系付着17、19、20を介して基質に付着し、次いでアクチンベースの突起部21、22、23を伸ばして広がる動的メカノケミカルプロセスである。 広がり段階の間、細胞体から発するラメリポディアは、引き込みや失速をほとんどあるいは全く伴わない、等熱帯かつ持続的に突出する。最も一般的に使用される細胞拡散プロトコルはエンドポイントアッセイであり、広がる細胞はめっき19、24の後のさまざまな時間に固定される。これらのアッセイは、迅速かつ簡単ではあるが、ラメリポディアの動的特徴の変化を検出するために診断力に制限されている。ラメリポディアダイナミクスを制御する分子機構を決定するために、Sheetzグループは、生きた広がり細胞の定量分析の使用を開拓し、細胞エッジ突起11、12、22の多くの基本的特性を明らかにした。これらの研究は、生細胞拡散アッセイが細胞生物学研究所のツールボックスにおける堅牢で強力な技術であることを実証した。それにもかかわらず、ライブセル拡散アッセイのための詳細なプロトコルとオープンソース計算ツールは、現在、細胞生物学コミュニティでは利用できません。この作業を行うために、当社のプロトコルは、ライブ拡散セルのイメージング手順を概説し、自動画像解析ツールを提供します。この方法を検証するために、実験的な治療法としてArp2/3阻害を用い、Arp2/3複合体の機能を阻害しても細胞拡散は阻止されず、細胞突起速度の大幅な低下、細胞端突起の安定性が著しく低下し、細胞縁部がギザギザに生じることを示した。これらのデータは、ライブセルイメージングと自動画像解析の組み合わせが、細胞エッジダイナミクスを分析し、ラメリポディアを調節する分子成分を同定するのに有用なツールであることを示しています。
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Protocol
1. 細胞の播種
注:記載された細胞拡散プロトコルは、PH-Akt-GFP(PIP3/PI(3,4)P2の蛍光マーカー)を発現するマウス胚性線維芽細胞(MEF)を用いて行った。この細胞株は、CRISPR媒介遺伝子編集によるPH-Akt-GFP(Addgene #21218)の発現構築物をジェノミスティックに統合して生成した。しかしながら、ゲノム中で一過性または一体に発現される他の蛍光マーカーも、このアッセイに使用することができる。最適な画像セグメンテーションのために、細胞質に均一に分布する蛍光マーカー(例えば、細胞質GFP)を使用することを推奨します。
- 培養細胞の10cm皿を90%合流する。
- 細胞が適切な合流度を達成したら、22 mm x 22 mm のカバースリップ(#1.5; 0.17 mm 厚さ)を 35 mm の細胞培養皿に入れます。PBSで希釈したフィブロネクチン400μLでカバースリップを最終濃度2.5μg/mLにコーティングします。
注: アッセイに必要なカバーリップの数は、実験条件と技術レプリカの数によって決まります。 - フィブロネクチンコーティングカバースリップ付きの35mm皿を37°C、5%CO2インキュベーターに1時間置きます。
- インキュベーターからカバースリップで皿を取り除きます。フィブロネクチンを吸引し、カバースリップを2~3回軽くピペットでPBSで洗います。
- 細胞の10cm皿から細胞培養培地を吸引し、PBSで洗う。
- 0.05%のトリプシンEDTAの650 μLを細胞の90%コンフルエント皿に加え、皿を傾けて酵素を均等に分配します。トリプシンと一緒に皿をインキュベーターに1分間入れます。
- インキュベーターから細胞と皿を取り除きます。15 mL遠心分離チューブに10 mLの細胞培養培地を加えます。すぐにトリプシンをクエンチするために皿に別の10 mLのメディアを追加します。
- トリプシン化した細胞のピペット1mLを細胞を希釈するために15mL遠心分離管に入った。管の内容物を上下にピペットして、メディア内の細胞の均等な分布を保証します。凝集傾向の高い細胞タイプでは、細胞凝集の発生を最小限に抑えるために、細胞ストレーナー(100 μmメッシュサイズ)を通して細胞をフィルタリングすることが推奨されます。
- チューブから、ピペット500-1000μLの希釈された細胞をカバースリップを含む35mm皿に入れた。
- 皿を軽く振って細胞を均等に広げます。カバースリップが約10%の合流度(約50,000細胞/mL)であることを確認し、必要に応じて希釈された細胞の体積を調整します。
注: このような低い合流度で細胞を持つことの目的は、細胞の広がり獲得全体にわたって目的を集中させるために使用される各視野に1-2の偏光細胞があることを保証することです。 - 10cm皿の残りの細胞の1/5を処理条件ごとに1つの6cm皿に1個にする。通路を通した皿と35mmの皿を蓋付きでインキュベーターに一晩置きます。
注: これらは、ダイナミクスを広げる解析対象となるセルになります。
2. 薬物インキュベーションと細胞回復
- 2つの15 mL遠心分離管のそれぞれに5mLの細胞培養培地を加え、20 mLのフェノールレッドフリーDMEMを2つの50 mL遠心分離管のそれぞれに加えます。
注: チューブペアの数(15 mL + 50 mL)は実験条件の数に対応する必要があります。 - 細胞の広がりにArp2/3の重要性をテストするために、ピペットはArp2/3、CK-666の薬理学的阻害剤、またはDMSOなどの対照処理を、所望の濃度までの遠心管の各ペアに入れる。
- インキュベーターから継がれた6cmの皿(ステップ1.11を参照)を取り出し、メディアを吸引します。温かいPBSで皿を洗います。
- CK-666-またはDMSO補数15 mL遠心チューブの内容物を各継ぎ皿に加えます。各料理に適切な薬物処理のラベルを付け、皿をインキュベーターに1時間置きます。
- インキュベーターから食器を取り出し、メディアを吸引します。残りのフェノールレッドメディアをすべて完全に取り除くために、温かいPBSで皿を洗います。
- 0.05%のトリプシンEDTAを6cmの皿に230 μL加え、細胞を1分間インキュベートします。
注:該当する場合、トリプシンは非タンパク質分解細胞接着ブロッカーに置き換えることができます。 - インキュベーターから食器を取り除きます。各治療に対して、「チューブB」として指定された15 mL遠心分離管に、薬物補充フェノールレッドフリーDMEMを5 mL加えます。関連する皿に同じ培地の5 mLを追加して、トリプシンをクエンチします。「チューブA」と指定された15 mL遠心分離管に皿の内容物を移します。
- チューブAからチューブBに1mLの細胞を移す。
- チューブAとBをインキュベーターに45分間入れ、細胞がトリプシン化から回復できるようにします。遠心分離管のキャップを少し緩めてからインキュベーターに入れ、CO2 の浸透を可能にします。
注: 回復時間は、セルの種類によって異なる場合があります。我々の実験では、45分間の回復は細胞の生存率にごくわずかな影響を及ぼしたが、一部の細胞タイプは、あまりにも長い間懸濁液中で維持されるとアノイキスを受ける可能性がある。そのため、最適な回復時間を経験的に決定することをお勧めします。最適な回復時間により、サンプル中に死細胞やアポトーシス細胞を使い、高速かつ同期的な細胞拡散が可能になります。
3. 磁気チャンバの準備
- 22 mm x 22 mm の四角いカバースリップを収容できる 1 ウェル・チャムライド・セル磁気チャンバーのすべての部品が使用前にクリーニングされていることを確認してください。
- 35 mm 皿をカバースリップで取り外します(ステップ 1.11 を参照)。細胞培養培地を吸引し、カバースリップを温かいPBSで洗浄する。
- 鉗子のペアを使用して35 mm皿からカバースリップを取り出し、磁気チャンバーの底板にカバースリップをそっと置きます。
- カバースリップの上にシリコーンガスケットを置きます。
注:不適切に配置されたシリコンガスケットは、漏れやすい磁気チャンバの最も一般的な原因です。ガスケットが底板のインデントに置かれ、インデントを超えて上昇しないようにしてください。 - 本体を底板に取り付けます。
注:この部分は非常にゆっくりと行ってください。良いヒントは、本体を上に置きながら、片手で底板を押さえます。これにより、本体の磁石が底板を持ち上げないようにし、カバースリップを置き換えて割る可能性があります。 - 磁性チャンバに薬物補充フェノールレッドフリーDMEMの1 mLを加えます。糸くずのないティッシュを取り、漏れを確認するために本体と底板の間にエンクロージャを慎重にダブる。
注:漏れがある場合は、すぐにメディアを吸引し、ステップ3.4からもう一度進んでください。 - 透明カバーを本体に下げて、磁気チャンバを囲みます。
- 最初に実験室のティッシュに水を吹き付け、磁気チャンバーの底を拭きます(金属部分ではなくカバースリップ)。その後、少量の70%エタノールで第2の実験室組織をスプレーし、カバースリップを割れないように注意してください。
4. 画像取得
- ステージトップインキュベーターと目的ヒーターを37°Cに予熱し、ステージトップインキュベーターのCO2 レベルを5%に設定します。
注:ステージトップインキュベーターがCO2 供給に接続されていない場合、細胞培養培地は、一定のpH 7.4を維持するために25 mM HEPESで補充する必要があります。 - 十分な量の浸漬油を、あらかじめ温めた60X、1.4 N.A.油の目的に適用します。
注:私たちは、合理的に大きな視野と優れた光収集効率のために、このプロトコルで60X、1.4 N.A.油浸漬目的を使用しています。より大きな視野が必要な場合、画像の信号対雑音比が2.5を超える限り、より低い倍率の目的(例えば、20倍)を使用することができます。 - 完成した磁気チャンバとチューブB(ステップ2.9)の両方を共焦点顕微鏡に持って行きます。磁気チャンバーをステージトップインキュベーターに置きます。
注:浸漬油に泡を作らないように、ステージ上に静かに磁性チャンバーを置きます。 - GFPチャネルを使用して蛍光細胞に焦点を当てます。セルの端がシャープで、適切に定義されていることを確認します。
- チューブBから磁気チャンバに、磁気チャンバとピペット500μLの透明カバーを取り外します。透明カバーを磁気チャンバの上に戻します。
- 細胞拡散解析に最適な細胞を特定するには、カバースリップにまだ付着していないが、もはや転がり回っていない細胞の「ハロー」を検索します。カバースリップアタッチメントの初期段階にあるセルも優れた候補ですが、画像の取得は、拡散をキャプチャするために迅速に行う必要があります。
- 緑色のチャネルのタイムラプス画像取得を、6秒間隔で画像化された4つの視野を含むように設定します。
注: 異なる細胞タイプ間のラメリポディア突起速度のばらつきが高いため、最適なフレームレートは経験的に決定する必要があります。我々の実験で使用される6秒のイメージング間隔は、多くの間葉細胞および上皮細胞の分析の出発点として良い。しかし、非常に迅速に広がる細胞(例えば、免疫細胞)は、はるかに高いフレームレート(短いイメージング間隔)を必要とするかもしれません。セル拡散ムービーの最適なフレームレートにより、後続のフレーム間の突出したセルエッジの 2 ~ 5 ピクセルの変位が保証されます。細胞拡散の高原を識別するために使用されるカーブフィッティングの精度を考慮すると、最適なフレームレートはまた、細胞の広がりの急速な膨張段階の間に細胞エッジ変位の50-100測定を確実にする必要があります。視野数は、露光時間、取得点間の距離、およびステージの移動速度に応じて調整する必要があります。ユーザーは、目的のフレームレートで獲得できる視野の最大数を決定することをお勧めします。 - 適切な視野を特定した後、顕微鏡ステージのX座標とY座標を保存します。カバースリップ上で互いに比較的近い他の3つの視野を特定します。すべての所望の視野のための顕微鏡の段階の座標を保存しなさい。
注: 不要なサンプルの動きを最小限に抑えるために、視野間のステージ移動パスを最適化することを強くお勧めします。このような最適化は、手動または自動で実行できます。過度のサンプルの動きは取得速度を低下させ、細胞が降下するにともなって見えなくなることがあります。 - 6秒のフレームレートで15分間画像を取得し、ファイルを保存します。さらに取得が必要な場合は、ステップ 4.6 から繰り返します。
5. 細胞の広がり時の細胞面積、円形、突起ダイナミクスの解析
- データ処理と分析のための画像の準備
注:ソフトウェアは、.tiff形式の画像と入力パラメータとしてピクセルサイズが必要です。両方の要件は、取得ソフトウェアまたはフィジー(このプロトコルで)を使用して満たすことができます。これらの要件が満たされている場合は、ステップ 5.2 に進みます。- フィジー アプリケーション (https://imagej.net/Fiji/Downloads) の最新バージョンをインストールします。
- フィジーを使用してタイムラプス画像を開きます。
- [イメージの>プロパティ] を選択して、イメージのピクセル サイズ をコピーします。ピクセルサイズをコピーして、メモ帳/Wordにμmで貼り付けます。
- セルの広がり領域と円形の解析のために、タイムラプス画像をtiff画像スタックとして保存します。カスタム ビルド分析ソフトウェアは、独自のファイル形式をサポートしていません。[ファイル] > [TIFF] を選択して、個々のセル tiff イメージ スタック >保存します。
- データ処理および分析のために、Python IDE (スパイダー) と必要なパッケージ(PySimpleGUI および tifffile) をインストールします。
注: Python とパッケージのインストールは、初期設定でのみ必要です。- タイムラプスムービーは、カスタムビルドのPythonスクリプトを使用してSpyder IDEで分析されます。Spyder IDE をダウンロードするには、Spyder IDE とこの分析に必要なライブラリとパッケージのほとんどを含む Anaconda ディストリビューター (https://www.anaconda.com/products/individual) をダウンロードします。
- アナコンダをインストールし、アナコンダナビゲーターを介してスパイダーを起動します。
- IPython コンソール タブ (スパイダーの右下のセクションにあります) で、次のコマンドをコピーして貼り付けます: Pip インストール PySimpleGUI と Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) の開始に必要なパッケージがインストールされます。
- 同じコンソールで、次のコマンドをコピーして貼り付けます: pip は、tifffile をインストールし 、Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、イメージを tiff ファイルとして保存するために必要なパッケージがインストールされます。
- 補助ファイルまたは GitHub から最新のスクリプトからすべての Python スクリプトをダウンロードする: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
- 細胞の広がり時の細胞面積と細胞形状因子の定量化
- Spyder の上部パネルで開いているファイルオプションを選択するか、ショートカット Ctrl + Oを使用して、メインの分析スクリプト 「cell_spreading_GUI.py」を開きます。
- 上部パネルで「ファイルを実行」を選択するか、ショートカット F5を使用して、セル拡散解析 GUI を開きます。
- [ セルの広がり範囲 ] タブ (図 3A)をクリックします。
- 参照ボタンを使用して、分析する tiff イメージを選択します。
注: 選択したファイルは tiff ファイルである必要があります。 - データ出力先のディレクトリ(セルマスク、値など)を指定します。
- データ出力設定を指定します。
- マスクを保存: セグメンテーションプロセス中に生成されたセルマスクを保存します。
- データのエクスポート: すべての分析データを含む Excel スプレッドシート (.xlsx) をエクスポート先のフォルダーにエクスポートします。
セル領域、すべての展開セルの円形度と縦横比は、コピー先のフォルダに Excel スプレッドシートとして保存されます。セル領域は次のように計算されます。
セルの円形度は、セルが完全に丸いセルにどれだけ近いかの尺度です。これは次のように計算されます。
ここで、A と P はそれぞれセル領域とセルの周長です。セルの縦横比は、セルの伸長を表します。広がるセルは、1 に近いアスペクト比を持つ必要があります。アスペクト比は次のように計算されます。
- コンターを保存: セル境界の輪郭オーバーレイ画像を保存先フォルダに保存します。
- セグメンテーション設定を指定する
- セグメンテーションの表示: 分析プロセス中に Spyder コンソールでセグメンテーション結果を表示します。
- 最小セル領域 (μm2):結合の開始段階のセルの面積値を含む、セル領域の最小値を入力します。この閾値より小さい領域を持つオブジェクトは、広がるセルとは見なされません。この数はセグメンテーションプロセスに影響します。
- イメージのパラメータを指定します。
- 取得間隔(秒単位):画像取得の頻度を秒単位で入力します。
- ピクセルサイズ(μm):解析用の画像を準備する際に記録されたピクセルサイズを入力します。
- イメージのビット深度: カメラ/検出器のビット深度を入力します。
- [ ファイルを実行 ]をクリックします。エラーが発生すると、Spyder のコンソールにエラー メッセージが表示されます。それ以外の場合は、イメージ分析プロセスがコンソールに表示されます。
注: コンソール/プロットセクションに表示される最初の画像(Spyder の設定に応じて)には、視野に示されているすべてのセルが表示されます。セルの周囲に配置された緑色のボックスは、セグメンテーションと分析に適した広がるセルを示します。灰色のボックスは、分析に適さないセルを示します。識別された広がりセルの総数は、[コンソール]タブにも表示されます。ソフトウェアは、セル領域(青)とセルの円形度(赤)を時間の関数としてプロットします。これらのグラフを使用すると、セルセグメンテーションの精度を評価できます。セグメンテーションが成功すると、細胞領域の単調に増加する曲線が得られます。セルの広がり領域の代表的な曲線を得るためには、ラグフェーズを手動でグラフから削除する必要があります。ラグフェーズには、細胞が広がる前のセル領域の測定値が含まれます。ラグフェーズは、セル領域プロット(図3C 右)に示されているように、速い変動によって示されます。
6. キモグラフを使用した細胞拡散時の細胞エッジダイナミクスの定量化
- 分析を実行する前に、細胞を広げる生のムービーをトリミングして、個々の広がるセルの時系列を作成します。
- フィジーのツールバーの [四角形 ] ツールを使用して、 単一のセルをカプセル化する対象領域 (ROI) を手動で選択します。(ROI が拡散セルを完全にカプセル化するようにするには、スクロール関数を使用して、すべての時点で ROI を検査します。
- ROI を右クリックし、[ 複製] を選択します。
- [重複スタック] をオンにし、[OK]をクリックします。
- Spyder のツール バーで [ファイルを開く ] ボタンを選択するか、ショートカット Ctrl + Oを使用して、メイン分析スクリプト "cell_spreading_GUI.py" を開きます。GUI がすでに開かれている場合は、ステップ 6.3 に直接進みます。
- 上部パネルで[ファイルを実行]を選択するか、ショートカットF5(図3B)を使用して、セル拡散解析GUIを開きます。
- [キモグラフ ジェネレータと解析] タブをクリックします。
- 参照ボタンを使用して、解析用の tiff イメージを選択します。
注: 独自のファイル形式、 例えば 、nd2、lif、zenは、スクリプトではサポートされていません。 - 出力データを保存する保存先フォルダ(セルマスクと値)を指定します。
- 出力設定を指定します。
- データのエクスポート: Excel スプレッドシート (.xlsx) を、相対セル エッジ位置と、キモグラフの取り消しイベントを含むエクスポート先のフォルダーにエクスポートします。
- イメージのパラメータを指定します。
- 取得間隔(秒):画像取得頻度を秒単位で入力します。
- ピクセルサイズ(μm):ステップ5.1.3で分析用の画像を準備する際に記録されたピクセルサイズを入力します。
- 最小セル領域 (μm2):結合の開始段階のセルの面積値を含む、セル領域の最小値を入力します。この閾値より小さい領域を持つオブジェクトは、広がるセルとは見なされません。この数はセグメンテーションプロセスに影響します。
- イメージのビット深度: カメラ/検出器のビット深度を入力します。
- [ ファイルを実行 ]をクリックします。エラーが発生すると、Spyder のコンソールにエラー メッセージが表示されます。それ以外の場合は、突起ダイナミクスの定量の概要がコンソールに表示されます。4組の引き込み周波数と突起速度測定があり、細胞の上下左右の部分から生成された4つのカイモグラフから抽出されます。引き込み頻度は次のように計算されます。
注:この数字は、ラメリ表彰台が拡散の過程で撤回する頻度を示しています。平均突起速度は、突起の始まりと、キモグラフ上のプラトー点との間の斜面によって測定されます。分割後にコンソールにサマリーカイモグラフの図が表示されます。サマリー図を保存するには、図を右クリックして画像を保存します。
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Representative Results
上記のプロトコルは、細胞拡散の生細胞イメージングのための実験手順と、細胞拡散ダイナミクスの定量的分析のための計算ツールを説明する。計算ツールは、低スループットまたはハイスループット形式で使用して、セルのリーディングエッジでアクチン重合機械を調節する分子プレーヤーを識別することができます。
実験手順の概略図を図 1に示します。細胞拡散アッセイは、eGFP25でタグ付けされたAktタンパク質キナーゼのプレクストリン相同性(PH)ドメインを安定的に発現する不死化マウス胚線維芽細胞に対して行った。細胞をトリプシン-EDTAで剥離し、45分間懸濁液中で回復させた。回復工程の間、細胞は、フィブロネクチン被覆唇への回収された細胞の迅速かつ同期的な付着によって示されるように、細胞膜上のインテグリン受容体を補充した(図2)。回復期間を経ずに、細胞の広い分布を示した広い細胞サイズは、細胞拡散の発症に高いばらつきを示した(図2A及びB)。次に、細胞を受託的に印示されたカバースリップ上にメッキし、それらの拡散ダイナミクスを回転ディスク共焦点顕微鏡(図1A-Hに示す概略)によって可視化した。 画像取得を通じて、シグナル対ノイズ比が2.5以上のセルを特徴とする視野を考えました。これは、その後の画像セグメンテーションが背景に対する細胞の蛍光強度に敏感であるため、重要な考慮事項でした。実験では、6秒ごとに15分間画像を取得しました(図1I-Jを参照)。以前のレポート16と一致して、6秒のフレームレートでのイメージングは、個々の突出および引き込みイベントのダイナミクスをキャプチャするための十分な時間分解能を確保し、同時にいくつかの視野を同時に取得することを可能にした。結果として得られたタイムラプスイメージは、カスタムビルドのPythonソフトウェアを使用して分析されました(図3)。
細胞拡散の公平な定量化は、(i)広がる細胞の形態力学プロファイリング(図3A、Cおよび4)および(ii)細胞端ダイナミクスのキモグラフ分析の2つの異なる分析手順を用いて行った(図3Bおよび5)。形態力学プロファイリングによる細胞拡散の解析では、視野内の広がり細胞と受託細胞(左図3C)の自動検出、続いて、フレーム単位の画像セグメンテーションと拡散細胞境界の検出が行われます。セグメンテーションは、個々のフレームをグローバル強度しきい値でしきい値することによって実行されます。しきい値は、画像ヒストグラム26上の第1および第2の強度モード間の局所最小値として計算される。単一モーダル、右歪みヒストグラムを持つ画像は、三角形の閾値アルゴリズム27によってセグメント化されます。細胞分節化後、広がる細胞の形態力学特性(すなわち、細胞面積、アスペクト比および細胞の円形度)を計算した(図3C右)。
公表された結果12,28と一致して、セル拡散は、代表細胞領域プロット上のシグモイド形状によって示されるようにラメリポディアの等方性拡張によって駆動された(図3C右、青曲線およびS1)。面積プロットは、細胞面積が高原に到達する前に約3倍に増加したことを示した(図4AおよびB)。細胞の広がりの過程を通して、細胞は円形(円形性=0.70±0.076)のままで、ラメリポジア性突起を示すベール状の突出細胞縁を示した(図4C)。
細胞拡散アッセイを検証するために、100μM CK-666を1時間45分間にArp2/3で阻害し、この処理が細胞拡散ダイナミクスに及ぼす影響を評価した。以前のレポート13と一致して、Arp2/3活性の抑制は、細胞の拡散速度の有意な低下をもたらさなかった(図4A及びB、ピンク曲線)。しかし、細胞形状解析は、制御とCK-666処理細胞の円形性に有意な差を明らかにした(Control:0.70±0.08対CK-666:0.54±0.09、p<0.1x10-3)(図4C)。コントロールセルは高原まで円形のままであったが、Arp2/3阻害細胞は広がりの過程を通して保持された多角形を獲得した(図4A)。これらの実験結果は、これらに記載された細胞拡散アッセイが、アクチン重合機械の摂動によって生じる細胞形態の中程度の変化を明らかにすることを示す。
形態力学プロファイリングは、多くの場合、細胞拡散ダイナミクスの大きな変化を検出するのに十分であるが、この分析は、細胞エッジの突起リトラクションサイクルを調節する特定の細胞骨格成分を同定する能力が限られており、偏りのないキモグラフ解析ツール(図5左、破線)を実装するよう促す。細胞端速度の分析は、対照と比較してArp2/3阻害細胞の平均突起速度が中程度であるが有意な減少を明らかにした(対照:37.1±12.87 nm/s対CK-666:28.7±13.4nm/s、p=0.9 x 10-3)(図5C)。さらに、制御の細胞端とArp2/3阻害細胞のダイナミクスは著しく異なっていた(図5AおよびD)。コントロール細胞は、約200秒間続いた急速膨張期中にほとんどまたは全く引き込みなしで持続的に突き出し、高原期の間に断続的な引き込み(図5AおよびD)を示した。これに対し、Arp2/3阻害細胞の拡張は、グラフ上の赤い点によって示される引き込みイベントによって介入された(図5BおよびD)。引き込み頻度の定量化は、Arp2/3阻害細胞が対照細胞よりも26%頻繁に引き込まれることを示した(Control:0.18±0.22 s-1 vs. CK-666:0.24 ± 0.19 s,p = 0.03) (図5D)。これらのデータは、ラメリポディアルダイナミクスにおける軽度の変化を検出する際のキモグラフ解析の高感度を示しています。
図1: 細胞拡散アッセイの実験ワークフロー( A -H) 細胞拡散アッセイの回路図(A)22 mm x 22 mm のカバースリップを、PBS で希釈したフィブロネクチンをコーティングし、最終濃度の 2.5 μg/mL にします。(B) PH-Akt-GFP発現マウス胚性線維芽細胞(MEF)のコンフルエント10cm皿をPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAで処理する。トリプシン処理細胞は、次いで、細胞培養培地を含む15mL遠心管及び6cm組織培養皿に分割される。(C)15 mL遠心分離管から、フィブロネクチンコーティングカバースリップに500-1000 μLを配管します。(D)6cmの皿と35mmの皿にまばらな播種の細胞を含むカバースリップを含む皿を、一晩37°Cのインキュベーターに入れます。一度偏光すると、これらの細胞は細胞拡散獲得のための焦点のフレームを提供する。(E) 画像取得の1時間前に、6cmの皿の培地は、HEPESと目的の薬物を補充したフェノールレッドフリーDMEMに置き換えられます。1時間後、細胞は0.05%トリプシン-EDTAで処理され、HEPES/薬物補充フェノールレッドフリーDMEMを含む15 mL遠心管(チューブA)に移管される。チューブAの細胞はさらに別の15 mL遠心管(チューブB)で希釈され、インキュベーターに45分間入れられます。(F)細胞が回復するにつれて、磁気チャンバは底面から上に準備されます:最初に底板が平らな表面に置かれ、次に、偏光セル、シリコーンガスケット、チャンバーの本体、そして最後に透明カバーが上に置かれます。(G)1 mLの薬物補充フェノールレッドフリーDMEMを磁気チャンバにパイプして、顕微鏡ステージに持ち込む。CFIプランアポラムダ60Xオイルの目的は、画像取得のために選択されています。(H)透明カバーを取り外し、チューブBの内容物の500 μLを磁気チャンバに配管します。(I) 画像取得の場合、適切な視野には、カバースリップにまだ付着していない浮遊セルである緑色の「ハロー」が含まれます。(J) セルは 15 分間画像化されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 細胞拡散に対する回復時間の影響 示された時間の懸濁液中に維持された細胞(プロトコルにおける細胞回収ステップ)をフィブロネクチンコーティングされたカバーリップ上で15分間メッキし、4%パラホルムアルデヒドで固定し、相コントラスト顕微鏡で画像化した。(A)トップパネル:20倍の目的で取得した位相コントラスト画像。下部パネル: セル領域が色分けされた集水域セグメントのセル マスク。(B) 細胞面積の定量化 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)と画像処理および解析ソフトウェアの動作原理( A) 「セルスプレッド領域」タブのGUI手順については、ステップ 5.3 を参照してください。(B)「キモグラフ発生器&解析」タブのGUI。手順については、ステップ 6 を参照してください。(C) ソフトウェアの画像処理パイプライン。ソフトウェアは、まず、視野全体に広がるセル(緑の境界ボックスでラベル付け)を識別します。広がる細胞は、強度値、円形度、アスペクト比に基づいて識別されます。次に、グローバル強度しきい値を使用して、識別された広がりセルをフレームごとにセグメント化します。各バイナリマスクは、中央値フィルタリングとバイナリホール充填に続いて、細胞のエッジを滑らかにするために形態学的な閉じで処理されます。赤いアウトラインは、セグメント化されたセル境界に対応します。セルの面積、縦横比、および円形度は、バイナリ セル マップから抽出されます。グラフは、一時の代表セルの面積と円形度を示しています。細胞の播種時に、細胞はすぐに広がらず、グラフに見られるラグフェーズを生み出します。ラグ相に続いて、細胞は急速な膨張段階の間に急速に広がり、最終的には高原相に達する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Arp2/3阻害時の細胞広域解析の代表的な結果(A)フィブロネクチン被覆滑りに広がるPH-Akt-GFP発現MEFの代表的な画像を3分間にわたって行った。赤い線は、セルセグメンテーションアルゴリズムによって抽出されたセル境界を示します。トップパネル:0.1%DMSO処理細胞。下部パネル:100 μM CK-666(Arp2/3阻害剤)処理細胞。(B) 時間の経過に対するセルの広がり領域を示すグラフ。細胞の広がり領域は、コントロール細胞の平均細胞スプレッド領域に対するフォールド変化として定量した。青とピンクの線は、それぞれコントロールと Arp2/3 阻害細胞を表します。シェーディング領域は、セルスプレッド領域の上下標準偏差を示します。(C)コントロールおよび Arp2/3 阻害細胞の平均細胞の円形度を示す個々のデータポイントを持つ棒プロット。すべての誤差範囲は標準偏差を表します。*, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001, n.s. (有意ではない, p > 0.05) パラメトリック学生のt検定によって検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Arp2/3阻害時の細胞の広がりのキモグラフ解析の代表的な結果(A - B)0.1%DMSO処理(対照)細胞および100 μM CK-666処理(Arp2/3阻害剤)細胞から抽出された代表的な画像およびキモグラフ。左パネル:コントロールとArp2 / 3阻害セルの反転グレースケール画像。破線は、キモグラフが抽出された定義済みの線に対応しています。右パネル: グレースケール画像に表示される破線に沿って、カイモグラフが抽出されます。印刷境界は、グレースケール イメージの破線と一致するように色分けされます。各プロットの破線は、平均突起速度を計算した曲線の傾きを示しています。プラトー相を特定するために、ロジスティック成長曲線をデータポイントに取り付け、高原をパラメータc(補足図1)から導出した。赤い点は、引き込みイベントを示します。(C)コントロールと Arp2/3 阻害セルの平均突起速度を示す個々のデータポイントを持つ棒プロット。すべての誤差範囲は標準偏差を表します。(D) コントロールおよび Arp2/3 阻害セルのリトラクション イベントの頻度を示す個々のデータ ポイントを持つ棒プロット。(C - D) *, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001, n.s. (有意ではない, p > 0.05) 非パラメトリックマンホイットニー検定によって検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:代表的なキモグラフとカーブフィッティング結果。 広がる細胞から抽出されたキモグラフ。青い破線は、最初のフレームを基準としたセルエッジの距離に対応します。赤い実線は、適合曲線に対応します。カーブフィッティングの信頼性を高めるために、生データポイントは最初にSavitzky-Golayフィルタによって平滑化されました。曲線フィッティングの後、パラメータcを、ロジスティック方程式から、高原点を同定するために使用した。c に最も近い生データ点は、プラトーポイントとして指定されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された細胞拡散アッセイは、形態変化(例えば、細胞サイズおよび形状)および細胞エッジの動き(すなわち、突起速度および引き込み頻度)の連続的追跡を可能にする。これは、ほとんどの細胞拡散プロトコル19、24において欠けている特徴である。一般的に使用されるエンドポイント細胞拡散アッセイは細胞拡散速度の決定を可能にするが、これらのアッセイは細胞エッジの動きの時間的ダイナミクスを解決することができない。時間情報の欠如は、ラメリポジア突起リトラクションサイクルの変化を検出し、定量化する能力を制限します。
当社の画像処理および解析ソフトウェアは、細胞セグメンテーションからデータ定量化まで、広がる細胞の合理化された分析を行います。細胞拡散の手動画像分析は、通常、しきい値の偏った選択または自動セグメンテーションアルゴリズムを適用することを含みます。したがって、当社のソフトウェアは、突起ダイナミクスと形態記述子を定量化することに加えて、自動化された方法で広がる細胞を検出し、セグメント化するように設計されています。これらの機能を組み合わせることで、ラメリポディアを調節するシグナル伝達経路および分子プレーヤーの大スループットスクリーニングに対して、記載されたプロトコルが好適になります。
広がる細胞の分析が堅牢で正確であることを保証するために、プロトコルのいくつかの重要なステップは、特別な注意を払って実行する必要があります。細胞拡散アッセイの第1段階は、イメージングの前日にフィブロネクチンコーティングカバースリップ上の非常に低密度で蛍光標識細胞をめっきすることを含む(図1A-D)。これらの偏光細胞は、画像取得中に広がる細胞の突き出た縁の正確な焦点合わせを可能にする。偏光セルの密度が高すぎると、細胞が広がり、偏光細胞に着陸または重なり合う可能性が高くなり、細胞のセグメンテーションが失敗する可能性があります。再試行後の回復期間は、このプロトコルのもう 1 つの重要なステップです。目的の薬剤で処理された細胞、例えば、DMSOまたはCK-666は、トリプシン-EDTA(ステップ2)によって細胞培養皿から剥離され、その後45分の回復期間が続く(図1E)。この回収ステップにより、細胞はトリプシン19,24により細胞表面タンパク質のタンパク質分解性切断から回復し、細胞拡散の発症を同期させる(図2)。回復工程を省略すると、細胞間広がり領域における細胞間変動性が増大し、生物学的表現型の一貫性を低下させる。
画像取得中、サンプルドリフトは必然的に細胞拡散解析、特にキモグラフ解析の品質と精度を低下させます。サンプルドリフトを最小限に抑えるには、いくつかの対策を講じる必要があります。まず、ユーザは画像取得中にステージの動きを最適化する必要があります。最適化には、視野間のステージ移動を最小限に抑え、ステージ移動の速度を下げることが含まれます。第2に、顕微鏡ステージ上で試料をしっかりと固定することが不可欠である。これらの提案されたメジャーがサンプルドリフトを排除しない場合は、取得後の処理を考慮する必要があります。多くの独自のオープンソースの計算ツールの中で、「記述子ベースの登録」フィジープラグインを使用して画像のシフトを修正し、広がるセルのムービーを揃えることをお勧めします(手順は、https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)にあります)。
なお、ソフトウェアによって行われる細胞領域およびエッジダイナミクスの定量的分析は、細胞セグメンテーションの精度に大きく依存する。正確なセグメンテーションを確実に行うために、共焦点イメージングシステム(好ましくは、高分解能、低い光漂白/光毒性、高い信号対雑音比を提供する回転ディスク共焦点顕微鏡)を用いて、細胞拡散を可視化することを推奨します。共焦点顕微鏡は、広がる細胞から放出される焦点外蛍光を効率的に除去し、それ以外の場合は画像セグメンテーション精度と細胞境界トレースを低下させる。広視野顕微鏡が画像取得に使用される場合、追加の取得後処理 、例えば、 画像デコンボリューションは、焦点外蛍光を除去し、細胞セグメンテーションの精度を向上させるために必要とされ得る。したがって、イメージングシステムの選択を考慮する必要があります。
記載されたソフトウェアの中で、細胞質緑および赤色蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)26,27のような薄暗い蛍光タンパク質で標識された細胞を確実に検出するために、2つの画像セグメンテーションアルゴリズムを実装し、最適化した。しかし、これらのセグメンテーションアルゴリズムはダイナミックレンジが限られており、極めて明るい蛍光タンパク質や色素で標識された細胞の検出には適していません。私たちの手では、これらのアルゴリズムは、画像ヒストグラムが高輝度ピクセルに向かって歪んでいるため、非常に明るい細胞を下線分化する傾向があります。明るいサンプルの場合、画像の強度は、露光時間または励起レーザーの出力電力を調整することによって制御することができます。
これらの考慮事項を念頭に置いて、このライブセル拡散プロトコルは、ラメリポディアのダイナミクスを研究するための堅牢で強力なツールです。自動画像解析プラットフォームは、多くの生物学的調査、 例えば、 ラメリポアル突起を調節する分子/シグナル伝達因子の高コンテンツスクリーニングに適しています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、コノート基金の新調査官賞(S.P.、カナダイノベーション財団、NSERCディスカバリー補助金プログラム)(RGPIN-2015-05114とRGPIN-2020-05881)、マンチェスター大学とトロント大学共同研究基金、トロント大学XSeedプログラムによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
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