Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analys av cellkantsdynamik under cellspridning

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/62369
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

I detta protokoll presenterar vi de experimentella förfarandena för en cell som sprider analys som är baserad på levande cellmikroskopi. Vi tillhandahåller ett beräkningsverktyg med öppen källkod för opartisk segmentering av fluorescerande märkta celler och kvantitativ analys av lamellipodia dynamik under cell spridning.

Abstract

Cellspridning är en dynamisk process där en cell som är upphängd i media fäster vid ett substrat och plattar ut sig från en rundad till en tunn och spridd form. Efter cell-substratet bifogas, cellen bildar ett tunt ark av lamellipodia som härrör från cellkroppen. I lamellipodin polymeriseras klotformiga aktinmonomer (G-aktin) monomerer till ett tätt filamentöst aktin (F-aktin) nät som trycker mot plasmamembranet och därigenom ger de mekaniska krafter som krävs för att cellen ska spridas. Särskilt de molekylära aktörer som styr aktinpolymeriseringen i lamellipodi är viktiga för många andra cellulära processer, såsom cellmigration och endocytos.

Eftersom celler sprids bildar kontinuerlig lamellipodi som sträcker sig över hela cellperiphery och ständigt expanderar utåt, har cellspridningsanalyser blivit ett effektivt verktyg för att bedöma kinetiken hos lamellipodial utskjutningar. Även om flera tekniska implementeringar av cellspridningsanalysen har utvecklats saknas för närvarande en detaljerad beskrivning av arbetsflödet, som skulle innehålla både ett steg-för-steg-protokoll och beräkningsverktyg för dataanalys. Här beskriver vi de experimentella procedurerna för cellspridningsanalysen och presenterar ett verktyg med öppen källkod för kvantitativ och opartisk analys av cellkantsdynamik under spridning. I kombination med farmakologiska manipuleringar och/eller gen-silencing tekniker, detta protokoll är mottagliga för en storskalig skärm av molekylära spelare som reglerar lamellipodial utskjutningar.

Introduction

Lamellipodial utskjutningar är framträdande cytoskeletala strukturer bildas på framsidan av en migrerande cell. I lamellipodi skapar polymerisation av aktin med hjälp av Arp2/3-komplexet och forminer ett snabbväxande förgrenat aktinnät som trycker motplasmamembranet 1,2. Den tryckkraft som genereras av aktinnätet driver cellen fysiskt framåt1,3,4,5. Utarmning av Arp2/3-komplexet eller störning av signalvägar som är nödvändiga för lamellipodial utskjutningar försämrar ofta cellmigration6, 7. Även om migration av lamellipodia-bristfälliga celler också harrapporterats 8,9, är vikten av lamellipodi i cellmigration uppenbar som utarmning av denna utskjutande struktur stör cellens förmåga att röra sig genom komplexa biologiska mikromiljöer6,10.

Ett stort hinder för att förstå regleringen av lamellipodi i migrerande celler är den naturliga variationen i lamellipodial utskjutningskinetik, storlek och form11,12,13,14. Dessutom har nyligen genomförda studier visat att lamellipodia uppvisar komplexa utskjutande beteenden, inklusive fluktuerande, periodiska och accelererande utskjutningar14,15. Jämfört med den mycket varierande lamellipodin av migrerande celler6,16, lamellipodia bildas under cellspridning är merenhetliga 12. Eftersom den utskjutande aktiviteten att sprida och migrera celler drivs av identiska makromolekylära sammansättningar, som inkluderar ett förgrenat aktinnätverk, kontraktila actomyosin-buntar och integrinbaserade cellmatrisankomplikationer17,18, har spridande celler använts i stor utsträckning som en modell för att undersöka regleringen av lamellipodiadynamik.

Cellspridning är en dynamisk mekanokemisk process där en cell i suspension först klibbar sig vid ett substrat genom integrinbaserade vidhäftningar17,19,20 och sedan sprider sig genom att förlänga aktinbaserade utskjutningar21,22,23. Under spridningsfasen sticker lamellipodi ut från cellkroppen isotropiskt och ihållande med liten eller ingen upprullning eller stalling12. De vanligaste cellspridningsprotokollen är endpoints-analyser, där spridande celler åtgärdas vid olika tidpunkter efterplätering 19,24. Dessa analyser, även om de är snabba och enkla, är begränsade i sin diagnostiska kraft för att upptäcka förändringar i lamellipodias dynamiska egenskaper. För att bestämma de molekylära mekanismerna som kontrollerar lamellipodidynamiken var Sheetz-gruppen pionjär för användningen av kvantitativ analys av levande spridande celler och avslöjade många grundläggande egenskaper hos cellkantsprotruderingar11,12,22. Dessa studier har visat att live-cell spridningsanalysen är en robust och kraftfull teknik i verktygslådan för ett cellbiologilaboratorium. Trots det är ett detaljerat protokoll och beräkningsverktyg med öppen källkod för en live-cell spridningsanalys för närvarande otillgängliga för cellbiologigemenskapen. I detta syfte beskriver vårt protokoll procedurerna för att avbilda levande spridande celler och tillhandahåller ett automatiserat bildanalysverktyg. För att validera denna metod använde vi Arp2/3 hämning som en experimentell behandling och visade att hämma funktionen hos Arp2/3 komplexet inte arresterade cell spridning men orsakade en betydande minskning av cell utskjutning hastighet, liksom stabiliteten i cell edge utskjutningar, vilket ger upphov till ojämna cell kanter. Dessa data visar att kombinationen av live-cell imaging och automatiserad bild analys är ett användbart verktyg för att analysera cellkant dynamik och identifiera molekylära komponenter som reglerar lamellipodia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sådd av celler

OBS: Det beskrivna cellspridningsprotokollet utfördes med hjälp av mus embryonala fibroblaster (MEFs) som uttrycker PH-Akt-GFP (en fluorescerande markör för PIP3/PI(3,4)P2). Denna cellinje genererades genom att genomiskt integrera en uttryckskonstruktion för PH-Akt-GFP (Addgene #21218) av CRISPR-medierad genredigering. Andra fluorescerande markörer som uttrycks tillfälligt eller integreras i genomet kan dock också användas i denna analys. För optimal bildsegmentering rekommenderar vi att du använder fluorescerande markörer som är jämnt fördelade i cytoplasman, t.ex. cytosolisk GFP.

  1. Kultur en 10 cm skål med celler till 90% konfluens.
  2. När cellerna har uppnått rätt sammanflöde, placera ett 22 mm x 22 mm täckskydd (#1,5; 0,17 mm tjocklek) i en 35 mm cellkulturrätt. Täck täcket med 400 μL fibronectin som har spädts ut i PBS till en slutlig koncentration på 2,5 μg/ml.
    OBS: Antalet täckglas som krävs för analysen bestäms av antalet försöksbetingade tillstånd och tekniska kopior.
  3. Placera 35 mm skålen med fibronectinbelagda täcken i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 1 timme.
  4. Ta bort skålen med täckglaset från inkubatorn. Aspirera fibronectin och tvätta täcket med PBS genom att försiktigt pipetting runt täcket två till tre gånger.
  5. Aspirera cellkulturmedierna från cellens 10 cm maträtt och tvätta skålen med PBS.
  6. Tillsätt 650 μL 0,05% trypsin-EDTA till cellernas 90% konfluenta skål och luta skålen för att jämnt fördela enzymet. Placera skålen med trypsin i inkubatorn i 1 minut.
  7. Ta bort skålen med cellerna från inkubatorn. Tillsätt 10 ml cellkulturmedier i ett 15 ml centrifugeringsrör. Tillsätt snabbt ytterligare 10 ml media i skålen för att släcka trypsinet.
  8. Pipett 1 ml av de trypsiniserade cellerna i 15 ml centrifugeringsröret för att späda ut cellerna. Pipett innehållet i röret upp och ner för att säkerställa en jämn fördelning av celler i mediet. För celltyper med hög aggregeringsbenensitet rekommenderas filtrering av celler genom en cellsil (100 μm nätstorlek) för att minimera förekomsten av cellklumpning.
  9. Från röret, pipett 500 - 1000 μL utspädda celler i 35 mm skålen som innehåller täckglaset.
  10. Skaka försiktigt skålen för att jämnt sprida ut cellerna. Se till att täcket har en sammanflöde på ~10 % (~50 000 celler/ml) och justera volymen av utspädda celler efter behov.
    OBS: Syftet med att ha celler med så låg beredskap är att säkerställa att det finns 1-2 polariserade celler i varje synfält som kommer att användas för att fokusera målet under hela cellspridningsförvärvet.
  11. Passage 1/5 av de återstående cellerna i 10 cm skålen i en 6 cm skål per behandlingstillstånd. Placera de passagede diskarna och 35 mm skålen med täcket i inkubatorn över natten.
    Obs: Det här är cellerna som kommer att analyseras för att sprida dynamik.

2. Läkemedelsinkubation och cellåtervinning

  1. Tillsätt 5 ml cellkulturmedier i vart och ett av två 15 ml centrifugeringsrör och 20 ml fenolrött fritt DMEM i vart och ett av två 50 ml centrifugeringsrör.
    OBS: Antalet rörpar (15 ml + 50 ml) bör motsvara antalet experimentella tillstånd.
  2. För att testa betydelsen av Arp2/3 för cellspridning, pipett antingen farmakologisk hämmare av Arp2/3, CK-666, eller kontrollbehandlingen, såsom DMSO, i varje par centrifugeringsrör upp till önskad koncentration.
  3. Ta bort de passagerade 6 cm-rätterna (se steg 1.11) från inkubatorn och aspirera på mediet. Tvätta disken med varm PBS.
  4. Tillsätt innehållet i CK-666- eller DMSO-kompletterade 15 ml centrifugeringsrör i var och en av de passagerade rätterna. Märk varje maträtt med rätt läkemedelsbehandling och placera disken i inkubatorn i en timme.
  5. Ta bort disken från inkubatorn och aspirera på mediet. Tvätta disken med varm PBS för att noggrant ta bort alla återstående fenolröda medier.
  6. Tillsätt 230 μL 0,05% trypsin-EDTA till varje 6 cm skål och inkubera celler i 1 minut.
    OBS: I förekommande fall kan trypsin ersättas av en icke-proteolytisk cell vidhäftningsblockerare.
  7. Ta bort disken från inkubatorn. För varje behandling, tillsätt 5 ml läkemedelstillskott fenolröd fri DMEM i ett 15 ml centrifugeringsrör betecknat som "Rör B". Tillsätt ytterligare 5 ml av samma medium i den relevanta skålen för att släcka trypsinet. Överför innehållet i skålen till ett 15 ml centrifugeringsrör betecknat som "Rör A".
  8. Överför 1 ml celler från rör A till rör B. Upprepa för varje behandling.
  9. Placera rör A och B i inkubatorn i 45 minuter så att cellerna kan återhämta sig från trypsinisering. Lossa locket på centrifugrören något innan du placerar dem i inkubatorn för att möjliggöra CO 2-penetrans.
    Varaktigheten av återställningstiden kan variera för olika celltyper. Även om i våra experiment 45-minuters lång återhämtning hade en försumbar effekt på cellens livskraft, kan vissa celltyper genomgå anoikis när de underhålls i suspension för länge. Därför rekommenderar vi att du bestämmer den optimala återhämtningstiden empiriskt. Den optimala återhämtningstiden möjliggör snabb och synkron cellspridning utan döda eller apoptotiska celler i provet.

3. Magnetisk kammare förberedelse

  1. Se till att alla delar av en 1 Well Chamlide Cell Magnetic Chamber som rymmer ett 22 mm x 22 mm fyrkantigt lock har rengjorts före användning.
  2. Ta bort 35 mm skålen med täcksplocket (se steg 1.11) från inkubatorn. Aspirera cellkulturmedierna och tvätta täcket med varm PBS.
  3. Ta bort täcket från 35 mm-skålen med ett par tångar och lägg försiktigt täcket på magnetkammarens bottenplatta.
  4. Placera silikonpackningen ovanpå täcket.
    OBS: En felaktigt placerad silikonpackning är den vanligaste orsaken till en läckande magnetkammare. Se till att packningen vilar i bottenplattans indrag och inte stiger över strecksatsen.
  5. Fäst huvudkroppen på bottenplattan.
    OBS: Gör denna del mycket långsamt. Ett bra tips är att hålla ner bottenplattan med en hand samtidigt som huvudkroppen placeras ovanpå. Detta säkerställer att huvudkroppens magneter inte lyfter upp bottenplattan, vilket potentiellt kan förskjuta och knäcka täcket.
  6. Tillsätt 1 ml läkemedelstillskott fenolröd dmem till magnetkammaren. Ta en luddfri vävnad och doppa försiktigt höljet mellan huvudkroppen och bottenplattan för att kontrollera eventuella läckor.
    OBS: Om det finns läckage, aspirera snabbt på mediet och fortsätt igen från steg 3.4.
  7. Sänk det genomskinliga locket på huvudkroppen för att omsluta magnetkammaren.
  8. Spraya först en laboratorievävnad med vatten och torka av botten av magnetkammaren (täcket, inte metalldelen). Efteråt spruta en andra laboratorievävnad med en liten mängd 70% etanol och torka, var försiktig så att du inte knäcker täcket.

4. Bildförvärv

  1. Förvärm sceninkubatorn och objektivvärmaren till 37 °C och ställ in CO2-nivån i scenens övre inkubator till 5 %.
    OBS: Om inkubatorn för scentoppar inte är ansluten till en CO2-tillförsel ska cellkulturmediet kompletteras med 25 mM HEPES för att bibehålla konstant pH 7.4.
  2. Applicera en tillräcklig mängd nedsänkningsolja på det förvärmda oljemålet 60X, 1.4 N.A.
    OBS: Vi använder ett 60X, 1.4 N.A. oljesänkningsmål i detta protokoll på grund av dess ganska stora synfält och enastående ljusuppsamlingseffektivitet. Om ett större synfält krävs kan ett lägre förstoringsmål(t.ex.20x) användas så länge bildernas signal-till-brusförhållande är större än 2,5.
  3. För både den färdiga magnetkammaren och rör B (steg 2.9) till det konfokala mikroskopet. Placera magnetkammaren på sceninkubatorn.
    OBS: Placera magnetkammaren försiktigt på scenen för att undvika att skapa bubblor i nedsänkningsoljan.
  4. Ställ in fokus på fluorescerande celler med GFP-kanalen. Kontrollera att cellkanten är skarp och väldefinierad.
  5. Ta bort magnetkammarens och pipettens genomskinliga lock 500 μL från rör B till magnetkammaren. Placera det genomskinliga locket på toppen av magnetkammaren.
  6. För att identifiera celler som är idealiska för cellspridningsanalys, sök efter "halos" av celler som ännu inte har fästs på täckglaset men inte längre rullar runt. Celler som befinner sig i de tidigaste stadierna av coverlip-bifogad fil är också bra kandidater, men bildförvärvet måste vara snabbt för att fånga spridning.
  7. Konfigurera avbildningsförvärvet för tidsfördröjning för den gröna kanalen så att den innehåller fyra synfält, avbildade med 6 sekunders intervall.
    OBS: På grund av den höga variationen hos lamellipodia utskjutning hastighet mellan olika celltyper, bör den optimala bildhastigheten bestämmas empiriskt. Bildframställningsintervallet på 6 sekunder som används i våra experiment är en bra utgångspunkt för analys av många mesenchymala och epitelceller. Celler som sprids mycket snabbt (t.ex.immunceller) kan dock kräva en mycket högre bildhastighet (kortare bildintervall). Den optimala bildhastigheten för cellspridningsfilmer säkerställer en förskjutning på 2-5 pixlar av den utskjutande cellkanten mellan efterföljande bildrutor. Med tanke på noggrannheten hos kurvkoppling som används för att identifiera cellspridningens platå bör den optimala bildhastigheten också säkerställa 50-100 mätningar av cellkantsförskjutning under den snabba expansionsfasen av cellspridning. Antalet synfält bör justeras beroende på exponeringstiden, avståndet mellan anskaffningspunkterna och stegrörelsehastigheten. Användare rekommenderas att bestämma det maximala antalet synfält som kan förvärvas med önskad bildhastighet.
  8. När du har identifierat ett lämpligt synfält sparar du mikroskopstegets X- och Y-koordinater. Fortsätt med att identifiera tre andra synfält som ligger relativt nära varandra på täckglaset. Spara koordinaterna för mikroskopsteget för alla önskade synfält.
    OBS: Det rekommenderas starkt att optimera stegrörelsebanan mellan synfälten för att minimera onödiga provrörelser. Sådan optimering kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Överdriven provrörelse saktar ner förvärvet och kan leda till att celler rullar ur sikte när de sjunker.
  9. Hämta bilder i 15 minuter med en bildhastighet på 6 sekunder och spara filerna. Om fler förvärv krävs, upprepa från och med steg 4.6.

5. Analys av cellområde, cirkularitet och utskjutningsdynamik vid cellspridning

  1. Förbereda bilder för databehandling och analys
    Programvaran kräver en bild i ett .tiff och en pixelstorlek som indataparametrar. Båda kraven kan uppfyllas med hjälp av förvärvsprogramvaran eller Fiji (i detta protokoll). Om dessa krav är uppfyllda fortsätter du till steg 5.2.
    1. Installera den senaste versionen av Fiji-programmet (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Öppna en timelapse-bild med Fiji.
    3. Kopiera bildens pixelstorlek genom att välja Bild > egenskaper. Kopiera och klistra in pixelstorleken i μm till Anteckningar/Word.
    4. För analys av cellspridningsområde och cirkularitet sparar du timelapse-bilden som en tiff-bildstack. Den anpassade analysprogramvaran stöder inte proprietära filformat. Spara den enskilda cell tiff-bildstacken genom att välja > Spara som > Tiff.
  2. Installera Python IDE (Spyder) och nödvändiga paket(PySimpleGUI och tifffile)för databehandling och analys.
    Installation av Python och paket krävs bara för den första installationen.
    1. Timelapse-filmerna kommer att analyseras i Spyder IDE med hjälp av ett specialbyggd Python-skript. För att ladda ner Spyder IDE, ladda ner Anaconda-distributören (https://www.anaconda.com/products/individual) som inkluderar Spyder IDE och de flesta nödvändiga bibliotek och paket för denna analys.
    2. Installera Anaconda och starta Spyder via Anaconda Navigator.
    3. På fliken IPython-konsol (som finns i det nedre högra avsnittet av Spyder) kopierar och klistrar du in följande kommando: pip installera PySimpleGUI och tryck på returknappen. Om du kör det här kommandot installeras det paket som behövs för att initiera det grafiska användargränssnittet (GUI).
    4. Kopiera och klistra in följande kommando i samma konsol: pip installera tifffile och tryck på Retur. Om du kör det här kommandot installeras det paket som behövs för att spara avbildningar som tiff-filer.
    5. Hämta alla Python-skript från tilläggsfilerna eller de mest uppdaterade skripten från GitHub på: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Kvantifiera cellområdes- och cellformsfaktorer vid cellspridning
    1. Öppna huvudanalysskriptet "cell_spreading_GUI.py" genom att välja alternativet öppen fil på den övre panelen i Spyder eller använda genvägen Ctrl + O.
    2. Öppna analys-GUI för cellspridning genom att välja "Kör fil" på den övre panelen eller använda genvägen F5.
    3. Klicka på fliken Cell uppslagsområde (bild 3A).
    4. Välj den tiff-bild som ska analyseras med bläddringsknappen.
      Obs: Den markerade filen måste vara en tiff-fil.
    5. Ange målkatalogen där datautdata (t.ex. cellmasker, värden) ska sparas.
    6. Ange datautmatningsinställningarna:
      1. Spara masker: Spara cellmasker som genereras under segmenteringsprocessen.
      2. Exportera data: Exportera ett Excel-kalkylblad (.xlsx) som innehåller alla analysdata till målmappen.
        Cellområde, cirkularitet och bildförhållande för alla spridande celler sparas som ett Excel-kalkylblad i målmappen. Cellområdet beräknas som:
        Equation 1 
        Cellcirkulariteten är ett mått på hur nära en cell är en helt rund cell. Den beräknas som:
        Equation 2 
        där A och P är cellområdet respektive cellomkretsen. Cellens bildförhållande representerar hur långsträckt cellen är. En spridarcell bör ha ett bildförhållande nära 1. Proportionerna beräknas som:
        Equation 3 
      3. Spara konturer: Spara cellgränsens konturöverläggsbilder i målmappen.
    7. Ange segmenteringsinställningarna
      1. Visa segmentering: Visa segmenteringsresultatet i Spyder-konsolen under analysprocessen.
      2. Minsta cellområde (μm2): Ange minimivärdet för cellområdet, inklusive cellområdesvärden i början av bifogade filer. Objekt med ett område som är mindre än det här tröskelvärdet betraktas inte som spridande celler. Det här numret påverkar segmenteringsprocessen.
    8. Ange bildparametrarna.
      1. Anskaffningsintervall (er): Ange frekvensen för bildförvärvet på några sekunder.
      2. Pixelstorlek (μm): Ange pixelstorleken som spelades in när du förberedde bilder för analys.
      3. Bildbitsdjup: Ange kamerans/detektorns bitdjup.
    9. Klicka på Kör. Om ett fel uppstår visas ett felmeddelande i Spyders konsol. Annars visas bildanalysprocessen i konsolen.
      Obs: Den första bilden som visas i avsnittet konsol/plottar (beroende på Spyder-inställningarna) visar alla celler som identifierats i synfältet. Gröna lådor placerade runt cellerna indikerar spridningsceller som är lämpliga för segmentering och analys. Grå rutor anger celler som inte är lämpliga för analys. Det totala antalet identifierade spridningsceller visas också på fliken Konsol. Programvaran ritar cellområdet (i blått) och cellcikularitet (i rött) som en funktion av tiden. Dessa diagram gör det möjligt för användare att utvärdera noggrannheten i cellsegmentering. En lyckad segmentering ger en monotont ökande kurva för cellområdet. För att få en representativ kurva för cellspridningsområdet bör fördröjningsfasen tas bort från diagrammet manuellt. Fördröjningsfasen inkluderar mätningar av cellområdet innan cellen börjar spridas. Fördröjningsfasen indikeras av snabba fluktuationer, som representeras i cellområdesdiagramet(figur 3C höger).

6. Kvantifiera cellkantsdynamiken vid cellspridning med hjälp av kymografier

  1. Innan du kör analysen beskär du de råa filmerna med spridande celler för att skapa tidsserier med enskilda spridningsceller.
    1. Använd rektangelverktyget i Fijis verktygsfält för att manuellt välja en intresseregion (ROI) som kapslar in en enskild cell. (För att säkerställa att ROI helt kapslar in spridningscellen använder du rullningsfunktionen för att inspektera ROI vid alla tidpunkter.)
    2. Högerklicka på ROI och välj Duplicera.
    3. Markera Dubblettstapel och klicka på OK.
  2. Öppna huvudanalysskriptet "cell_spreading_GUI.py" genom att välja knappen Öppna fil i Spyders verktygsfält eller använda genvägen Ctrl + O. Om gui-snittet redan har öppnats går du direkt till steg 6.3.
  3. Öppna analys-GUI för cellspridning genom att markera Kör fil på den övre panelen eller med genvägen F5 (Bild 3B).
  4. Klicka på fliken Kymograph generator & analys.
  5. Använd bläddringsknappen för att välja tiff-bilden för analysen.
    Obs: Proprietära filformat, t.ex. nd2, lif, zen, stöds inte av skriptet.
  6. Ange målmappen för att spara utdata (cellmasker och värden).
  7. Ange utdatainställningarna.
    1. Exportera data: Exportera ett Excel-kalkylblad (.xlsx) till målmappen som innehåller kymografiers relativa cellkantspositioner och upprullningshändelser.
  8. Ange bildparametrarna:
    1. Anskaffningsintervall (er): Ange bildförvärvsfrekvensen på några sekunder.
    2. Pixelstorlek (μm): Ange pixelstorleken som spelades in när du förbereder bilder för analysen i steg 5.1.3.
    3. Minsta cellområde (μm2): Ange minimivärdet för cellområdet, inklusive cellområdesvärden i början av bifogade filer. Objekt med ett område som är mindre än det här tröskelvärdet betraktas inte som spridande celler. Det här numret påverkar segmenteringsprocessen.
    4. Bildbitsdjup: Ange kamerans/detektorns bitdjup.
  9. Klicka på Kör. Om ett fel uppstår visas ett felmeddelande i Spyders konsol. Annars visas en sammanfattning av utskjutningsdynamikens kvantifieringar i konsolen. Det kommer att finnas 4 par upprullningsfrekvens och utskjutningshastighetsmätningar, som extraheras från 4 kymografer som genereras från cellens övre, nedre, vänstra och högra delar. Upprullningsfrekvensen beräknas som:
    Equation 4 
    OBS: Detta nummer visar hur ofta lamellipodiumet dras tillbaka under spridningen. Den genomsnittliga utskjutningshastigheten mäts av lutningen mellan utskjutningsstarten och platåpunkten på kymografen. En sammanfattande kymograph figur visas i konsolen efter segmenteringen. Om du vill spara sammanfattningssiffran högerklickar du på figuren och sparar bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovanstående protokoll beskriver de experimentella förfarandena för levande cell imaging av sprida celler och ett beräkningsverktyg för kvantitativ analys av cell spridning dynamik. Beräkningsverktyget kan användas i ett låg- eller höggenomströmningsformat för att identifiera de molekylära spelare som reglerar aktinpolymeriseringsmaskineriet vid cellens framkant.

Den schematiska representationen av försöksförfarandena beskrivs i figur 1. Cellspridningsanalysen utfördes på odödliga musembryon fibroblaster som stabilt uttrycker pleckstrinhomologi (PH) domänen för Akt proteinkinas märkt med eGFP25. Cellerna var fristående med trypsin-EDTA och tilläts återhämta sig i suspension i 45 minuter. Under återhämtningssteget fyllde cellerna på sina integrinreceptorer på plasmamembranet, vilket framgår av den snabba och synkrona fastsättningen av de återvunna cellerna på fibronectinbelagda täcken (figur 2). Utan återhämtningsperioden uppvisade spridande celler en bred fördelning av cellstorleken som indikerar en hög variabilitet vid cellspridningens början (figur 2A och B). Därefter pläterades celler på ett förvaltningsmärkt täckglas och deras spridningsdynamik visualiserades genom snurrande diskkonfokal mikroskopi(schemat som visas i figur 1A - H). Under hela bildförvärvet övervägde vi synfält som innehöll celler med ett signal-till-brus-förhållande på 2,5 eller högre. Detta var en viktig faktor eftersom den efterföljande bild segmenteringen är känslig för cellernas fluorescens intensitet i förhållande till bakgrunden. I våra experiment fick vi bilder var 6:e sekund i 15 minuter(ritningar som visas i figur 1I-J). I överenskommelsen med tidigarerapporter 16, avbildning med en 6 sekunders bildhastighet säkerställde tillräcklig tidsupplösning för att fånga dynamiken i enskilda utskjutnings- och tillbakadragandehändelser, samtidigt som vi kunde förvärva flera synfält parallellt. De resulterande timelapse-avbildningarna analyserades med hjälp av den specialbyggda Python-programvaran (Figur 3).

En opartisk kvantifiering av cellspridningen utfördes med hjälp av två distinktaanalysförfaranden: ( i) Morfodynamisk profilering av spridande celler (figur 3A,C och 4) ochii) kymografisk analys av cellkantsdynamik (figur 3B och 5). Analysen av cellspridning genom morfodynamisk profilering innebär automatisk detektering av spridnings- och fiducialcellerna i synfältet (figur 3C vänster), följt av en bildsegmentering för bildruta och detektering av den spridande cellgränsen. Segmenteringen utförs genom global intensitet som trösklar de enskilda bildrutorna. Tröskelvärdet beräknas som det lokala minimivärdet mellan det första och andra intensitetsläget på bildfetogrammet26. Bilder med ett oimodalt, högersnedvridet histogram segmenteras av triangelns tröskelvärdesalgoritm27. Efter cellsegmentering beräknades de morfodynamiska egenskapernahos de spridande cellerna ( dvs. cellområde, bildförhållande och cellcirkularitet ) (figur 3C höger).

I överensstämmelse medpublicerade resultat 12,28, cellspridning drevs av en isotropisk expansion av lamellipodia som indikeras av en sigmoidal form på det representativa cellområdesdiagramt(figur 3C höger, blå kurva och S1). Områdesområdet visade att cellområdet ökade med ungefär 3 gånger innan det nådde en platå (figur 4A och B). Under hela processen för cellspridning förblev cellerna cirkulära (cirkularitet = 0,70 ± 0,076) och visade slöjaliknande utskjutande cellkanter, som tyder på lamellipodial utskjutningar (Figur 4C).

För att validera cellspridningsanalysen hämmade vi Arp2/3 med 100 μM CK-666 i 1 timme och 45 minuter och bedömde effekten av denna behandling på cellspridningsdynamiken. I enlighet med tidigare rapporter13ledde undertryckandet av Arp2/3-aktiviteten inte till någon betydande minskning av cellspridningshastigheten (figur 4A och B, rosa kurva). Cellformsanalysen visade dock en signifikant skillnad i styrformens cirkularitet och CK-666-behandlade celler (Kontroll: 0,70 ± 0, 0, 0, < ± 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, x 10-3) (figur 4C). Medan kontrollcellerna förblev cirkulära fram till platån, förvärvade Arp2/3-hämmade celler en polygonal form som behölls under hela spridningen (figur 4A). Tillsammans visar dessa experimentella resultat att den beskrivna cellspridningsanalysen avslöjar måttliga förändringar i cellmorfodynamik orsakad av störningar i aktinpolymeriseringsmaskineriet.

Medan morfodynamisk profilering ofta är tillräcklig för att upptäcka bruttoförändringar i cellspridningsdynamiken, har denna analys begränsad förmåga att identifiera specifika cytoskeletala komponenter som reglerar cellkantens utskjutnings-upprullningscykler, vilket får oss att implementera ett opartiskt kymografanalysverktyg (Figur 5 vänster, streckade linjer). Analysen av cellkantshastigheten visade en måttlig men signifikant minskning av den genomsnittliga utskjutningshastigheten för Arp2/3-hämmade celler jämfört med kontroll (Kontroll: 37,1 ± 12,87 nm/s jämfört med CK-666: 28,7 ± 13,4 nm/s, p = 0, 9 x 10-3) (Figur 5C). Dessutom var dynamiken i cellkanten av kontroll och Arp2/3-hämmade celler anmärkningsvärt olika (figur 5A och D). Kontrollcellerna utskjutande ihållande med små eller inga tillbakadraganden under den snabba expansionsfasen, som varade ca 200 sekunder, och uppvisade intermittenta upprullningar under platåfasen (figur 5A och D). Däremot ingrep expansionen av Arp2/3-hämmade celler av upprullningshändelser, betecknade med de röda punkterna i diagrammen (figur 5B och D). Kvantifiering av upprullningsfrekvensen visade att Arp2/3-hämmade celler drog tillbaka 26% oftare än kontrollceller (Kontroll: 0,18 ± 0,22 s-1 jämfört med CK-666: 0,24 ± 0,19 s-1, p = 0,03) (Figur 5D). Dessa data visar den höga känsligheten hos kymograph analys för att upptäcka milda förändringar i lamellipodial dynamik.

Figure 1
Bild 1: Det experimentella arbetsflödet för en cellspridningsanalys. a)Ett locklip på 22 mm x 22 mm är belagt med fibronectin utspädd i PBS till en slutlig koncentration på 2,5 μg/ml. (B) En sammanflödesrätt på 10 cm ph-akt-gfp-uttryckande mus embryonala fibroblaster (MEF) tvättas med PBS och behandlas med 0,05% trypsin-EDTA. De trypsinbehandlade cellerna delas sedan upp i ett 15 ml centrifugeringsrör och en 6 cm vävnadskulturrätt, som båda innehåller cellkulturmedier. C)Från 15 ml centrifugeringsröret är 500-1000 μL rört på det fibronectinbelagda täckglaset. D)Skålen på 6 cm och skålen på 35 mm med täckglaset som innehåller de glest sådda cellerna placeras i en inkubator på 37 °C över natten. När dessa celler har polariserats kommer de att ge en ram av fokus för cellspridningsförvärvet. (E) En timme före bildförvärv ersätts 6 cm-skålens media med fenolröd dmem kompletterat med HEPES och det läkemedel som är av intresse. Efter 1 timme behandlas cellerna med 0, 05% trypsin-EDTA och överförs till ett 15 mL centrifugeringsrör (rör A) som innehåller HEPES/läkemedelskompenserad fenolröd fri DMEM. Cellerna i rör A späds sedan ut ytterligare i ytterligare 15 ml centrifugeringsrör (rör B), som placeras i inkubatorn i 45 minuter. (F) När cellerna återhämtar sig bereds magnetkammaren från botten till toppen: först placeras bottenplattan på en plan yta, sedan täcket med de polariserade cellerna, silikonpackningen, kammarens huvudkropp och slutligen läggs det genomskinliga locket ovanpå. G)1 ml läkemedels kompletterad fenolröd dmem är inspringad i magnetkammaren, som sedan förs till mikroskopstadiet. Ett CFI Plan Apo Lambda 60X Oil-mål väljs ut för bildförvärv. (H) Det genomskinliga locket avlägsnas och 500 μL av rör B:s innehåll är instända i magnetkammaren. (I) För bildförvärv kommer lämpliga synfält att innehålla gröna "halos", som är suspenderade celler som ännu inte har fästs på täckglaset. (J) Cellerna är bildade i 15 minuter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekten av återställningstid på cellspridning. Celler som underhålls i suspension under den angivna tiden (cellåterställningssteg i protokollet) pläterades på fibronectinbelagda täcken i 15 minuter, fixerade med 4% paraformaldehyd och avbildas genom faskontrastmikroskopi. (A) Topppaneler: faskontrastbilder förvärvade med ett 20X-mål. Nedre paneler: vattendelarsegmenterade cellmasker med cellområdena färgkodade. B)Kvantifiering av cellområde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Grafiskt användargränssnitt (GUI) och arbetsprinciperna för bildbehandlings- och analysprogramvara. Se steg 5.3 för instruktioner. (B) GUI för fliken "Kymograph generator & analysis". Se steg 6 för instruktioner. (C) Programvarans bildbehandlingspipeline. Programvaran identifierar först spridande celler (märkta med en grön begränsningsruta) i hela synfältet. De spridande cellerna identifieras baserat på deras intensitetsvärde, cirkularitet och bildförhållande. De identifierade spridningscellerna segmenteras sedan bildruta för bildruta med hjälp av tröskelvärde för global intensitet. Varje binär mask bearbetas genom medianfiltrering och binär hålfyllning följt av morfologisk stängning för att jämna ut cellkanten. Den röda konturen motsvarar den segmenterade cellgränsen. Cellens område, bildförhållande och cirkularitet extraheras från den binära cellkartan. Diagrammet visar området och cirkulariteten för en representativ cell över tid. Vid cellsådd börjar cellerna inte sprida sig omedelbart, vilket ger upphov till den fördröjningsfas som ses i diagrammet. Efter fördröjningsfasen spreds cellerna snabbt under den snabba expansionsfasen och når så småningom en platåfas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat av cellspridningsområdesanalys vid Arp2/3-hämning. (A) Representativa bilder av PH-Akt-GFP-uttrycks-MEF som sprids på ett fibronectin-belagt täckglas under loppet av 3 minuter. Den röda linjen anger cellgränsen som extraheras av cellsegmenteringsalgoritmen. Topppaneler: 0,1% DMSO-behandlade celler. Bottenpaneler: 100 μM CK-666 (Arp2/3-hämmare)-behandlade celler. (B) Ett diagram som visar cellspridningsområde över tid. Cellspridningsområdet kvantifierades när vikningen ändras i förhållande till det genomsnittliga cellspridningsområdet för kontrollceller. Blå och rosa linjer representerar kontroll respektive Arp2/3-hämmade celler. De skuggade områdena anger cellspridningsområdets övre och nedre standardavvikelse. C)Ett stapeldiagram med enskilda datapunkter som visar kontrollens genomsnittliga cellr cirkularitet och Arp2/3-hämmade celler. Alla felstaplar representerar standardavvikelse. *, s. < 0,05, **, s. < 0,01, ***, s. < 0,001, n.s. (ej signifikant, p > 0,05) som detekteras av parametriska student t-tester. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat av kymografianalys av celler som sprids vid Arp2/3-hämning. A - B) Representativa bilder och kymographs extraheras från 0,1% DMSO-behandlade (kontroll) celler och 100 μM CK-666-behandlade (Arp2/3 hämmare) celler. Vänsterpaneler: inverterade gråskalebilder av en kontroll och Arp2/3-hämmad cell. De streckade linjerna motsvarar de fördefinierade linjerna där kymografier extraherades. Höger paneler: kymografier extraheras längs de streckade linjerna som visas på gråskalebilderna. Ritschemagränserna är färgkodade för att matcha de streckade linjerna på gråskalebilderna. Den streckade linjen i varje område anger lutningen på den kurva från vilken den genomsnittliga utskjutningshastigheten beräknades. För att fastställa platåfasen monterades en logistisk tillväxtkurva på datapunkterna och platån härleddes från parametern c (Kompletterande figur 1). De röda punkterna betecknar upprullningshändelserna. C)Ett stapeldiagram med enskilda datapunkter som visar kontrollens genomsnittliga utskjutningshastigheter och Arp2/3-hämmade celler. Alla felstaplar representerar standardavvikelse. D)Ett stapeldiagram med enskilda datapunkter som visar frekvensen av upprullningshändelser för kontrollen och Arp2/3-hämmade celler. (C - D) *, s. < 0,05, **, s. < 0,01, ***, s. < 0,001, n.s. (ej signifikant, s. > 0,05) som detekteras genom icke-parametriska Mann-Whitney-tester. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: En representativ kymograf och kurvmonteringsresultatet. En kymograph extraheras från en spridande cell. Den blå streckade linjen motsvarar cellkantens avstånd i förhållande till den första bildrutan. Den röda heldragna linjen motsvarar den monterade kurvan. För att öka kurvkopplingens förtroende jämnades rådatapunkterna först ut av ett Savitzky-Golay-filter. Efter kurvpassning användes parametern c, från den logistiska ekvationen, för att identifiera platåpunkten. Den rådatapunkt som ligger närmast c betecknas som platåpunkt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna cellspridningsanalysen möjliggör kontinuerlig spårning av morfologiska förändringar(t.ex. cellstorlek och form)och cellkantsrörelser (dvs. utskjutningshastighet och upprullningsfrekvens), som är funktioner som saknas i de flesta cellspridningsprotokoll19,24. Medan vanliga cellspridningsanalyser för slutpunktsceller möjliggör bestämning av cellspridningshastighet, misslyckas dessa analyser med att lösa den temporala dynamiken i cellkantsrörelser. Bristen på tidsmässig information begränsar förmågan att upptäcka och kvantifiera förändringar i lamellipodial utskjutning-upprullning cykler.

Vår bildbehandlings- och analysprogramvara utför en strömlinjeformad analys av de spridande cellerna, från cellsegmentering till datak kvantifiering. Manuella bildanalyser av cellspridning innebär vanligtvis ett partiskt val av tröskelvärde eller tillämpning av en automatiserad segmenteringsalgoritm, som inte är lämplig för experiment med hög dataflöde där många bilder behöver analyseras. Vår programvara är därför utformad för att upptäcka och segmentera sprida celler på ett automatiserat sätt, förutom att kvantifiera utskjutande dynamik och morfologiska deskriptorer. Tillsammans gör dessa funktioner det beskrivna protokollet mottagligt för storgenomströmningskontroller av signalvägar och molekylära spelare som reglerar lamellipodi.

För att säkerställa att analysen av spridande celler är robust och korrekt måste några kritiska steg i protokollet utföras med extra försiktighet. Det första steget i cellspridningsanalysen innebär att man pläterar fluorescerande märkta celler med mycket låg densitet på ett fibronectinbelagt locklip dagen före avbildning (Figur 1A-D). Dessa polariserade celler möjliggör exakt fokusering av de spridande cellernas utskjutande kanter under bildförvärvet. Om densiteten hos polariserade celler är för hög har spridande celler stor chans att landa på eller överlappa de polariserade cellerna, vilket kan leda till ett cellsegmenteringsfel. Återställningsperioden efter trypsinisering är ett annat kritiskt steg i det här protokollet. Celler som behandlas med det läkemedel som är av intresse, t.ex. DMSO eller CK-666, lossas från cellkulturrätten genom trypsin-EDTA (steg 2), följt av en återhämtningsperiod på 45 minuter (figur 1E). Detta återhämtningssteg gör det möjligt för celler att återhämta sig från den proteolytiska klyvningen av cellytans proteiner genom trypsin19,24 och synkroniserar uppkomsten av cellspridning ( figur2). Om återhämtningssteget utelämnas ökar cell-till-cell-variabiliteten i cellspridningsområdet, vilket minskar konsistensen hos den biologiska fenotypen.

Under bildförvärvet minskar varje provdrift oundvikligen kvaliteten och precisionen i cellspridningsanalysen, särskilt kymografianalysen. För att minimera provdrift bör några åtgärder vidtas. Först bör användaren optimera scenrörelsen under bildförvärvet. Optimeringen inkluderar att minimera scenresor mellan synfält och minska hastigheten på scenrörelser. För det andra är det viktigt att ordentligt säkra provet på mikroskopstadiet. Om dessa föreslagna åtgärder inte eliminerar provdrift bör bearbetning efter förvärvet övervägas. Bland många proprietära och öppna källkodsberäkningsverktyg rekommenderar vi att du använder fiji-plugin-programmet "Deskriptorbaserad registrering" för att korrigera bildskift och justera filmerna för att sprida celler (instruktioner finns på: https://imagej.net/Descriptor-based_registration_(2d/3d)).

Det bör noteras att den kvantitativa analysen av cellområden och kantdynamik som utförs av programvaran är starkt beroende av cellsegmenteringens noggrannhet. För att säkerställa exakt segmentering rekommenderar vi att du visualiserar cellspridning med hjälp av ett konfokalt bildsystem, helst ett konfokalt mikroskop med snurrande disk som erbjuder hög upplösning, låg fotoblekning/fototoxicitet och högt signal-till-brusförhållande. Ett konfokalt mikroskop tar effektivt bort fluorescens utanför fokus som avges av de spridande cellerna, vilket annars skulle minska bildsegmenteringsnoggrannheten och cellgränsspårningen. Om ett widefieldmikroskop används för bildförvärv kan ytterligare bearbetning efter förvärv, t.ex. Därför bör valet av bildsystem övervägas.

Inom den beskrivna programvaran implementerades två bildsegmenteringsalgoritmer och optimerades för att tillförlitligt upptäcka celler märkta med dim till måttligt ljusa fluorescerande proteiner, såsom cytosoliska gröna och röda fluorescerande proteiner (GFP och RFP)26,27. Dessa segmenteringsalgoritmer har dock ett begränsat dynamiskt omfång och är inte lämpliga för att upptäcka celler märkta med extremt ljusa fluorescerande proteiner eller färgämnen. I våra händer tenderar dessa algoritmer att undersegment extremt ljusa celler på grund av bild histogrammets skevhet mot högintensiva pixlar. För ljusa prover kan bildernas intensitet styras genom att justera exponeringstiden eller excitationslaserns utgångseffekt.

Med dessa överväganden i åtanke är detta live-cell spridningsprotokoll ett robust och kraftfullt verktyg för att studera dynamiken i lamellipodi. Den automatiserade bildanalysplattformen lämpar sig för många biologiska undersökningar, t.ex. screening med hög halt av molekylära/signalfaktorer som reglerar lamellipodiala utskjutningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Connaught Fund New Investigator Award till S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (grants RGPIN-2015-05114 och RGPIN-2020-05881), University of Manchester och University of Toronto Joint Research Fund och University of Toronto XSeed Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA Wisent Bioproducts 325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented Starstedt 83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon 352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip Quorum Technologies CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish Falcon 353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal Nest 602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile VWR 10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 Millipore Sigma 182515
Camera, Prime 95B-25MM Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile BioShop DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red Wisent Bioproducts 319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red Gibco 11039021
D-PBS, 1X Wisent Bioproducts 311-425 CL
Fetal Bovine Serum Wisent Bioproducts 080-110
Fiji Software ImageJ
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg Millipore Sigma FC010
Immersion Oil Cargille 16241
L-Glutamine Solution (200 mM) Wisent Bioproducts 609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm VWR CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil Nikon MRD01605
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
Spinning Disk, Crest Light V2 CrestOptics
Spyder Anaconda
Stage top incubator Tokai Hit
Statistics Software, Prism GraphPad
Tweezers, Style 2 Electron Microscopy Sciences 78326-42

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).

Tags

Biologi nummer 171
Kvantitativ analys av cellkantsdynamik under cellspridning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S.… More

Iu, E., Bogatch, A., Plotnikov, S. V. Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading. J. Vis. Exp. (171), e62369, doi:10.3791/62369 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter