Summary
ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。
Abstract
ゼブラフィッシュ幼虫異種移植片は、ヒト癌の インビボ およびリアルタイム研究を行うための癌研究に広く使用されている。抗癌療法(化学療法、放射線療法、および生物学的)、血管新生および単一細胞分解能による転移に対する応答を迅速に可視化する可能性は、ゼブラフィッシュ異種移植片モデルを前臨床試験を開発するための最有力選択肢としている。
ゼブラフィッシュ幼虫異種移植アッセイは、他のモデルと比較していくつかの実験的な利点を提示するが、おそらく最も顕著なのは、サイズスケールとその結果的に時間の減少である。このスケールの縮小は、単一細胞イメージング、比較的少ない数のヒト細胞(生検と互換性がある)の使用を可能にする、中高スループット薬物スクリーニング、最も重要なのは、アッセイの時間の大幅な短縮を可能にする。これらすべての利点は、ゼブラフィッシュ異種移植アッセイを将来の個別化医療用途にとって非常に魅力的なものにします。
多くのゼブラフィッシュ異種移植プロトコルは、ヒト腫瘍の広い多様性と開発されています。しかし、ゼブラフィッシュ幼虫異種移植片を効率的に生成するための一般的かつ標準化されたプロトコルはまだ欠けている。ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。
Introduction
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、発達と病気を研究するための強力な脊椎動物モデル生物として登場しています。ゼブラフィッシュは、高度に保存された遺伝(70%の遺伝的相同性および〜84%の疾患関連遺伝子)および基本的な器官形態学的特徴をヒト1,2と共有する。この保存により、ゼブラフィッシュを使用して、がん3、4を含むいくつかのヒト疾患をモデル化することができます。
ゼブラフィッシュの取り扱いとメンテナンスは、その小さなサイズ、一年中高い胎児性、および外受精3、5のためにマウスよりもはるかに簡単で費用対効果が高いです。ゼブラフィッシュ胚は、生後5〜7日間の生き物を必要とせず、発達、感染、および癌1、4、6、7の有効モデルとして使用されてきた。ゼブラフィッシュ胚は、受精後48時間(hpf)で孵化し、すべての器官が形成された自由遊泳動物であり、鼓動心臓および機能的循環系、肝臓、脳、腎臓骨髄、1、3などである。また、現段階では先天性免疫のみが遊びで、適応免疫が未だに発達しており、免疫不全変異体7,8を使用する必要のないヒト細胞の一般的な効率的な生着が可能となる。それにもかかわらず、すべてのヒト細胞が等しく9を生着するわけではないことに注意することが重要であり、例えば白血病細胞については、貪食細胞(好中球およびマクロファージ)が効率的な生着10のために枯渇する必要が示された。
ゼブラフィッシュの遺伝的難解性とその初期胚段階の光学的透明性は、単一細胞の生体内イメージングを高解像度で可能にし、したがって、生物学の多様な分野における最先端のイメージング技術の確立を可能にする。さらに、癌の文脈において、これらの特徴は、血管新生および転移性の可能性を研究する、ならびに自然免疫系8、9、11、12、13との相互作用のような宿主と腫瘍相互作用の初期段階のリアルタイム研究に有用である。
短い異種移植片アッセイでは転移性の「進化」の時間はないが、腫瘍細胞の転移能を分析することが可能である(すなわち、その効率は、浸潤、内膜、循環中の生存、飛び出し、および植民地化のような転移的なステップを経て、したがって、生体内およびリアルタイム8、11、13、14でこれらのプロセスを研究する)。
そのライフサイクルの特徴は、癌の個別化医療のためのユニークなモデルとしてゼブラフィッシュを置きます。アッセイは、より短い期間で実行することができ、数週間で得られた結果7,8,9,9,11,12,15,16.これらのアッセイのセレリティと実現可能性は、医師や研究者に、時間が不可欠なニーズであるがん患者に有用な翻訳結果を得る可能性を提供します。
ゼブラフィッシュ胚異種移植片の生成に成功する試みが増えているにもかかわらず、注射手順の標準化と、注射後の細胞生存率および腫瘍挙動の評価が依然として必要である。
このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚におけるヒトがん細胞株の注入とその後の固定、免疫染色、イメージング、腫瘍細胞挙動の定量化に関する明確で詳細なステップバイステップガイドを研究者に提供します。
Protocol
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)モデルは、欧州動物福祉法、指令2010/63/EU(欧州委員会、2016)およびシャンパリモー魚プラットフォームの標準プロトコルに従って処理され、維持されました。すべての議定書は、シャンパリモー動物倫理委員会とポルトガルの機関組織ORBEA(オルガン・デ・ベム・エティカ動物/動物福祉倫理団体)とDGAV(ディレサン・ジェラル・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア/食品獣医総局)によって承認されました。
注:主な実験を開始する前に、ヒト大腸癌(CRC)細胞株HCT116を練習してください。この細胞株は、(高度に増殖)、非常に効率的に(約95〜100%)を注入し、生着することが容易な(高度な増殖)調製が容易である。過剰な細胞(約12x106 個の細胞、T-75フラスコ)と余分な魚(400匹の魚)から、訓練中に多くの細胞や魚が失われるため、この技術に堪能になるまで始めます。実験者は、HCT116異種移植片で〜95%の生着が達成されると準備ができています。完全なプロトコルの概略については、 図 1 を参照してください。
1. 注射用のセットアップ
- 注射の2週間前に、培養中の細胞を拡大する(いくつかの細胞株の注入のための最適なインビトロ合流の詳細なガイドについては表1を参照)。
- 注射の3日前に、所望の背景のゼブラフィッシュを横切る。
2. 24 時間前に注射
- ゼブラフィッシュの胚プレート(死んだ胚と未開発の胚をすべて捨てる)をきれいにし、E3培地をリフレッシュします。
- 細胞培養室では、注入予定のフラスコから細胞培養培地を捨て、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、死んだ細胞を除去し、新鮮な培地を添加する。
- マイクロインジェクション針、アガロースプレート、ヘアピンなどの注射手順のツールを準備して、注射用の胚を整列させます(図2A-D、下記を詳述)。
- マイクロインジェクション針(図2A)
- ホウケイ酸ガラス毛細血管(4インチ、OD 1.0 mm、マイクロピペットプーラーにフィラメントなし(熱:≈500;フィル:10;vel:50;12月:60;プル:100)。。
- プレートの準備 (図 2B)
- H2 Oで2%アガロースを準備し、加熱し、きれいなペトリ皿の蓋に溶解アガロースの1層を注ぎます。それを重合させ、定規の助けを借りて、胚の整列のために3〜4本のまっすぐなアガロースラインを作ります。
- ヘアピンアセンブリ (図2C-D)
- ガラスの毛管の中に1本の毛を入れて、約1センチの毛をチューブの外に残します。
- 約0.5mmの長さのループを形成するガラスキャピラリーチューブに鉗子の助けを借りて髪の外側の先端をカール。
- 毛細管の端をマニキュアの滴で密封します。これは、ループを所定の位置に固定するのにも役立ちます。乾かします。チューブの他の端で手順を繰り返します。
- 電気テープを切る(通常の粘着テープよりも抵抗力があり、不浸透性で、硬い)。
- テープをキャピラリーの周りに密封して、破損しないようにします。
- マイクロインジェクション針(図2A)
3. 注射日
- 孵化した胚を孵化していない卵から分離する。この段階で1xプロナーゼ(0.6mg/mL、 表3)を胚培地に添加すると、孵化を促進することができる。インキュベーターに胚を入れ(28°C)注射するまで入れる。
注:酵素は孵化した胚に作用し、死亡リスクを高めるので、胚をプロナーゼ溶液に1時間以上放置しないでください。胚の発達段階が、浮腫および死亡率のリスクを回避するために、48 hpf(図3A、A')に対応するものであることを確認してください。 - 1xトリケーヌ(25x株から)を準備します。
注:詳細なレシピは 、表3 とゼブラフィッシュ情報ネットワーク - ZFINウェブページ17で見つけることができます。
4. 注射用の細胞ラベリング
注:細胞のラベリングは、フラスコ内または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心チューブのいずれかで直接行うことができます。詳細については 、「ディスカッション」 を参照してください。
- 細胞培養培地を取り出し、フラスコを1XPBSで2回洗浄します。
- フラスコ(2 mL溶液/T75フラスコ)で直接、または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに好ましい脂溶性色素で細胞にラベルを付けます。光への暴露を避け、37°Cで細胞をインキュベートします(条件/解決策については 表1 および 表2 を参照)。
- フラスコでラベリングする場合
- 染料を取り出し、1x PBSで洗浄し、EDTAとセルスクレーパーで細胞を取り外します。
- 細胞を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。遠心分離機は300 x g で5分間、ステップ4.5に進みます。
- 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブでラベリングする場合:
- 遠心分離機を300xgで5分間、染料を除去し、上清を捨てる。1x PBSで再び洗ってください。
- 遠心分離機は300 x g で5分、ステップ4.5に進みます。
- 上清を捨て、細胞培養培地でペレットを再懸濁します(50μLペレット添加~培地150~200μL)。
- トリパンブルー排除または他の選択方法を用いてノイバウアーチャンバーを使用して細胞生存率を定量化する。
- 遠心分離機を300xgで4分間、上清を捨てる。注射媒体の細胞を再中断します。
注:推奨される細胞濃度(一般的に0.25-0.5x106 セル/μL)および培地は 表1にあります。 - この時点から、細胞を氷の上に置いておきます。
5. 注入手順
- 1x Tricaineで5分間胚を麻酔します。
- プラスチック製のパスツールピペットを使用して、少量(〜50)の麻酔下の胚をアガロースプレートに移し、ヘアピンループの助けを借りて慎重に整列させます。胚の間の距離、特に1個の黄身と次の卵黄の頭部との間の距離を維持するようにしてください(図4A)。
注:整列する胚の数は、注射を行う研究者の専門知識のレベルによって異なります。いくつかの(〜10-20)から始めます。寒天/アガロースプレートにおける胚の正しい位置の概略については 、図4Aを参照してください。 - 1-3滴のトリケーヌ溶液をプレートに慎重に加えることによって、アガロースプレートで整列した胚が乾燥しないようにして、死亡率を防ぎます。
- マイクロ遠心チューブを軽くタップして細胞を再懸濁します。彼らは胚の完全性を損なうことができるので、気泡を避けるマイクロローダーチップを使用して細胞懸濁液で注射針をバックロードします。
- 空気圧弁(40 psi)を開き、マイクロインジェクターを設置し、マイクロインジェクションニードルをホルダーに慎重に設置します。
注:次の推奨マイクロインジェクタ設定を使用してください:圧力を保持する - ベント(3 psi)。圧力を排出する - 通気孔。範囲 - 100ミリ秒。 - 顕微鏡下で#5または類似のDumont鉗子で先端近くのマイクロインジェクション針を切ります。
注:先端は、細胞が詰まることなく通過し、胚を損傷して細胞を失うことを避けるために十分に鈍く、薄くなければなりません。太いマイクロ注射針の先端は、胚を傷つけると浮腫やゼブラフィッシュの死の形成を促進します.経緯線は針の校正には使用されません。詳細な 説明については、「ディスカッション 」を参照してください。 - 胚を注入する前に、マイクロインジェクター圧を、ゼブラフィッシュ胚の目の大きさと同様の体積を〜1〜3パルスパルスするまで、最も低い排出圧力で始まるかどうかを試験する。
注:トレーニングの開始時に可能な限り蛍光体顕微鏡を使用することをお勧めします。これにより、蛍光標識された細胞の同定が容易になります。 - 胚の黄身の真ん中に慎重に突き刺し、針の角度を下げ、針の先端がペリビテリン空間(PVS)に達するまで慎重に押す(図4B-D)。
- マイクロインジェクタペダルを押して、PVSに細胞を注入します。胚の目をガイドとして使用してください。心臓浮腫を防ぐために、胚の目の大きさに似た細胞の量と心臓から可能な限り遠くに細胞を注入してみてください。
- 慎重に針を取り出し、次の胚に移動します。
- 必要に応じてマイクロインジェクターの圧力を調整します。
注:セルは詰まりを開始する傾向があるため、圧力が高くなる可能性があります。必要に応じて、圧力を下げながら毛細管を切断(直径を大きくする)することが可能です。 - 注入した胚を1x Tricaine溶液できれいなペトリ皿(表4)に移し、5〜10分間休ませます。これは傷が閉じる時間を与えるでしょう。
注:寒天プレートからペトリ皿に胚を移すために、胚の上に1x Tricaine溶液を数滴加え、プラスチック製のパスツールピペットで慎重に収集します。採取した胚を1xトリケーヌ溶液で新しいペトリ皿に落とします。 - 1x Tricaine溶液を取り外し、新鮮なE3培地を追加します。
- 34°Cで異種移植片をインキュベートする(ヒト細胞株生存とゼブラフィッシュの発達8との間の温度が損なわれる)。
6. 転移アッセイ
- 約1時間の注入後(hpi)で、注入された胚を蛍光体顕微鏡でスクリーニングし、異種移植片を2つのグループに分類します(図5A)または循環中の細胞の存在(図5B)。。
注:心臓または循環で1つの癌細胞しか検出されない場合でも、循環中の細胞を持つ異種移植片のグループにこれらの異種移植片が含まれる。あるいは、細胞を循環に直接注入して、この群の異種移植片の数を増やすことができる。
7. 1日ポストインジェクション
- 蛍光体型顕微鏡では各胚を注意深く分析し、適切に注射された腫瘍を持つものを選択する(図6)。
注:必要に応じて、スクリーニング前にトリケーヌ1X溶液で注入された胚を麻酔してください。 - 次の胚/異種移植片を捨てる(図6A-A'):
• 腫瘍/異常形態/死なず、
• 心臓および/または黄身浮腫
• 卵黄の腫瘍細胞のみで、
•非常に少数の癌細胞を有する。 - 腫瘍のサイズに応じて選択した異種移植片を並べ替えます。比較のために目のサイズを使用します(図6B-B'、6C)。
• 眼の大きさよりも小さい腫瘍(+)
• 眼と同じ大きさの腫瘍(++)
• 眼の大きさよりも大きい腫瘍 (+++). - 所望の実験レイアウトに従って異種移植片を配布し、薬物アッセイ(対照対薬物等)を開始する。薬物およびE3培地を毎日交換する(表4)。
- アッセイの終わりまで34°Cの温度を維持する異種移植片をインキュベートする。
8. 4日投与後注射
- アッセイの最終日に、1x Tricaine溶液で異種移植片を麻酔し、寒天プレートに慎重に位置合わせします。
注:死んだ、または腫れた異種移植片を捨てよ。薬物治療およびいくつかの腫瘍細胞は、毒性を誘発し、最終的に異種移植片の死亡率を引き起こす可能性がある。これらの異種移植片は、生着定量のために考慮されていません。 - 生着の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各生きた異種移植片を分析し、PVSにおける腫瘍の存在(図6D)/存在(図6E)を評価する。
- 転移の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各異種移植片を分析し、以前に定義された2つのグループの尾状造血組織(CHT)における微小転移の有無を評価する(CIRCおよびNO CIRC、図6F)
- 実験のセットアップによると、目的の異種移植片を選択し、25倍トリケーヌでそれらを安楽死させる(表3)。
- 室温(RT)または4°Cで一晩で少なくとも4時間4%ホルムアルデヒド(FA)でそれらを固定します。
注:PBS/0.1%トリトンで4%で希釈したメタノールフリーホルムアルデヒド(16%FA)を使用してください。固定性でチューブを上部に充填します。チューブを水平に配置して、すべての異種移植片の均質な固定を確保し、透過性を高め、ゼブラフィッシュが底部に凝集するのを防ぎます。 - または、パイプ(1 mLあたり:1 Mパイプナトリウム塩(4°C)の1μL、1M MgSO 4(RT)の1 μL、0.5 M EGTA(RT)の4 μL、16%FA(RT)の93.7 μL、ddH2Oの801.3 μLを使用して固定します。
注:パイプは、4%FAよりも優れたRFPとmCherryトランスジェニックラインの蛍光を保持します。 - 免疫染色が別の日に行われる場合は、FAを100%メタノール(MetOH)に置き換えます。100%メタノールに固定された異種移植片は、−20°Cで無期限に保存することができる。
注:MetOHは、いくつかの染色(すなわち、ファロイジン)の効率を損ない、いくつかの蛍光標識をクエンチすることができます。あらかじめ、MetOH固定サンプル中の抗体の効率を確認してください。
9. コンフォーカルイメージング用の全マウント免疫染色
注:全体のマウント免疫蛍光技術は、次のように分割3日かかります:最初の日は、異種移植片と一次抗体インキュベーションの透過性です。洗浄および二次抗体インキュベーションの2日目および3日目は、洗浄、異種移植片の固定および取り付け培地中の貯蔵のためである。
- 1日目
- 異種移植片を100%MetOHに保存した場合、一連のMetOH濃度の減少(75%、50%、25%MetOH希釈)によって再水和します。FAで固定されている場合は、PBS /0.1%トリトンで交換してください。
- PBS/0.1%トリトンで4倍の5分間洗浄します。
- H2Oで1倍5分間洗います。
注:特に明記されていない限り、チューブは常に固定、透過、洗浄のステップで水平に配置する必要があります。 - H2Oを氷冷アセトンに交換し、-20°Cで7分間インキュベートします。
注:アセトン付き50 mLチューブを-20°Cに置き、使用する準備が整います。マイクロ遠心チューブは、アセトンが漏れないようにラックの上 に垂直 に配置する必要があります。 - PBS/0.1%トリトンで2倍の10分間洗浄します。
- RTで1時間PBDX_GSブロッキング溶液をインキュベートする(PBDX_GSブロッキングバッファー:1x PBSの50 mL;0.5gのウシ血清アルブミン- BSA;0.5 mLのDMSO;250 μLの10%トリトン;750 μLのヤギ血清 - GS(15μL/1 mL)
- PBDX_GS取り除き、一次抗体希釈液の約40μLを加えます(一般的に1:100)。
注:一次抗体希釈量は、マイクロ遠心分離管内に存在する異種移植片の数によって異なります。すべての異種移植片が水没していることを確認します。 - RTで1時間インキュベートし、その後4°Cで一晩インキュベートします。チューブを縦に配置します。
- 2日目
- 一次抗体を取り除き、PBS/0.1%トリトンで2倍の10分間洗浄します。
- PBS/0.05%トゥイーンで30分間4倍洗います。
注:次の手順は、暗闇の中で実行する必要があります(光からチューブを保護するためにアルミ箔を使用してください)。 - PBS/0.05% Tweenを取り除き、PBDX_GSで希釈した2次抗体希釈液(一般的に1:200-1:400)+DAPI(50 μg/mL)を加えます。
- RTで1時間インキュベートし、その後4°Cで一晩インキュベートします。チューブを縦に配置し、光から保護します。
- 3日目(光からチューブを保護するためにアルミホイルを使用)
- 二次抗体希釈を除去し、PBS/0.05%Tweenで15分間4倍洗浄します。
- 4%FAで20分間室温で固定します。
- PBS/0.05%トゥイーンで1倍の5分間洗います。
- PBS/0.05% Tweenを取り外し、各マイクロ遠心チューブに水性取り付け媒体を1滴加えます。チューブを縦に配置します。
- 取り付けまで光から保護された4°Cで取付けまたは保管してください。チューブを縦に配置します。
10. 異種移植片の取り付け
注:マイクロ遠心チューブをプロセス全体にわたって光から保護します。ゼブラフィッシュ異種移植片は、2つのカバーリップ(24 x 60 mm #1.5)の間に取り付けられています。これにより、腫瘍の両側(上側および下面)がアクセス可能になるように、共焦点イメージング中に取り付けられた異種移植片を反転させることができます。取り付け媒体とプラスチックピペットを使用しないでください - 異種移植片は、ピペットに巻き込まれる可能性があります。次の手順の概略図については、 図 7 を参照してください。
- カバースリップYにラベルを付け、取り付け媒体の漏れを避けるために、カバースリップXの端を石油ゼリーまたはシリコーングリースで密封します。
- ガラスパスツールピペットで異種移植片をカバースリップXに移します。
- 慎重にヘアピンでそれらを整列し、余分な水性取り付けメディアを取り除きます。
- カバースリップ Y に水性取り付けメディアを追加します。
- カバースリップ X の上にカバースリップ Y を慎重に配置します。これは潜在的に異種移植片を混乱させる可能性がありますので、カバーリップを押しないでください。
- 組み立てたカバーリップを顕微鏡スライドの上に置き、透明な粘着テープで固定します。これにより、共焦点イメージングと保存を容易に操作できます。
11. 共焦点イメージング
注: 水補正を備えたアポクロマティック 25x 浸漬対物レンズは、単一細胞解像度の PVS 腫瘍のイメージングに最適です(例については、 図 8C-C" および 図 9A を参照してください)。
- 各スライス間の間隔を5μmのzスタック関数を使用してサンプルを取得します。3D再構成を目的とした画像、特に血管では、スライス間に1〜3μmの間隔を使用します(図8A)。
12. 分析と定量
- 共焦点画像処理および解析には、フィジー/ImageJソフトウェアまたは類似のソフトウェアを使用してください。
- フィジーソフトウェアで生データ(.czi、.lsmなど)を開きます。
- コンポジット モードですべてのチャネルまたは単一チャネルのみを選択するには、[ イメージ>カラー>チャネル ツール] をクリックします。
- 明るさとコントラストのレベルを調整するには、[ イメージ>>カラーバランスを調整する] をクリックします。
- 腫瘍サイズを定量化するには
- 腫瘍の代表的なスライスを、上、中央、下から、異種移植片ごとにzスタックごとに選択する(図8 A)。
注意:共焦点の決断は腫瘍の深さの60-70 μmを達成する。腫瘍が大きい場合、その総体積を画像化することができない場合がある。 - スプレッドシートを開いてデータにアナティを付ける。
- 選択した3つのスライス内の腫瘍細胞に対応するすべてのDAPI核を数える(図8 A、B)。これを行うには:
- 「プラグイン」をクリックして、フィジー/ImageJからセルカウンタープラグイン >開く>
- セル カウンタ ツールで、[ 初期化] をクリックし、カウンタ タイプを選択してイメージをクリックし、カウント モードを手動で開始します。カウンタは、クリックするたびに、カウントされるセルの数 (クリック数) を加算します。
- 1 つの完全なスライスをカウントした後、対応する Excel ドキュメントにセル番号を保存します。
- フィジーに戻り、同じカウンタが使用される場合は、[セルカウンタ]ウィンドウから[リセット]をクリックして情報を削除します。それ以外の場合は、情報を保持することができ、他のカウンターは、他のスライス (またはセル) で使用できます。
- 2 番目の代表スライスに移動し、前の手順を繰り返します。すべてのデータを収集します。
注: DAPI カウンタ化は、個々のセルの明確な定義のためにセル数をカウントするために一般的に使用されていますが、他のセル固有の染色を使用することができます。
- 腫瘍の細胞の総数を取得するには、次の式を使用します。
注:1.5補正数は、平均核径が10~12μmの細胞について推定されました。セルが大きくなったり小さくなったりする場合、この補正を行う必要があります。この方法の詳細については 、Dicussion を参照してください。
- 腫瘍の代表的なスライスを、上、中央、下から、異種移植片ごとにzスタックごとに選択する(図8 A)。
- 他のマーカー(免疫細胞、有糸数図、PPH3、活性化Caspase3、Ki67など)を定量化するには、同じプラグインを使用してすべてのスライスを定量化します(有糸分裂図の視覚化については 図8C-C'を 参照)。カウントされた細胞の総数を対応する腫瘍サイズで割り、100 を掛けてパーセンテージを求めます。
注: 一部のセルは 2 つのスライスの間に配置され、Z スタック内を行き来して、1 つのセルが 2 回カウントされないように注意してください。
Representative Results
抗がん療法を研究するためのツールとしてのゼブラフィッシュ異種移植片。
HCT116大腸癌細胞株をCM-DiIで標識し、受精後2日のPVS(dpf)胚に注射した。注射後、ゼノグラフトを34°Cでインキュベートし、ゼブラフィッシュの発生を損なうことなく腫瘍細胞の増殖を可能にする温度である。翌日、異種移植片をPVS内の腫瘍塊の有無に応じてスクリーニングした(適切に注入されなかったゼブラフィッシュは廃棄され、安楽死させた)(図6A-A')異種移植片は腫瘍サイズ(図6B-B')に従ってグループ化され、非治療コントロールおよびFOLFIRI化学療法(0.18 mMフォリニン酸、0.08 mMイリノチンカンおよび4.2 mMフルオロウラシル(5-FU)で無作為に分布した(6ウェルプレート:ウェルあたり12個の異種移植片)。
コントロールE3と薬物は毎日交換され、死んだゼブラフィッシュは廃棄された。4dpi、及び3日後の治療(dpt)と、プロトコルのステップ8.2のように生着を定量した。生着は、4dpiでPVSに腫瘍塊を提示する異種移植片の頻度と考えられる。例えば、実験の最後に40頭の生きた幼虫があり、40頭のうち35頭がPVSに腫瘍を存在させる場合、生着率は87.5%である。異種移植片は安楽死させ、免疫蛍光と共焦点顕微鏡による腫瘍サイズとアポトーシスを評価するために固定した。
免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ3抗体(Asp175)(ウサギ、1:100、#CST 9661)およびDAPI(50μg/mL)を用いて核に対抗する。図のスタック データセット (5um ごと) は、ステップ 12で説明したように、フィジー/ImageJ ソフトウェアを使用して実行される LSM710 共焦点顕微鏡とデータ解析で取得されました。有糸分裂指数の定量化、 アポトーシス(活性化カスパーゼ3の%)および腫瘍サイズは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少(マンホイットニー試験、P<0.0001)およびアポトーシスの有意な誘導(マンホイットニー試験、P<0.0001)を誘発することを明らかにした<腫瘍サイズの54%の減少を伴う(P0.001) 図(P0.001)図(8-9)
これらの特徴は、高スループット表現型薬物スクリーンにおいて有用であるとともに、短時間で複数の癌治療の細胞固有および生理学的効果をテストする。
ヒト特異的抗体によるヒトゼブラフィッシュ異種移植片の特徴
すべての異種移植片モデルと同様に、細胞を誤って同定する危険性がある。例えば、マクロファージはヒト癌細胞を食食細胞に食作用させ、親油性色素で標識し、ゼブラフィッシュ宿主体に沿って移動し、したがって、これらの細胞は腫瘍微小転移と間違えることができる。したがって、ヒトHLA、ki-67またはヒトミトコンドリア(hMITO)などの特定のヒト抗体を用いて異種移植片を標識することは、初期特性評価のために重要であり、また腫瘍細胞の形態を知るにも重要である(図9F-I)。
ゼブラフィッシュ異種移植細胞間相互作用を研究する。
ゼブラフィッシュ異種移植モデルのもう一つの大きな利点は、異なる腫瘍細胞の相互作用を研究し、各タイプの細胞が他の細胞の挙動にどのように影響するかを分析することができるということです。異なるヒト癌細胞(同じ腫瘍または異なる腫瘍からの異なるクローン)を共注射することができる。この例では、同じ患者に由来する2つのCRC細胞株を異なる親油性色素で標識し、注射に対して1:1の比率で混合した(図9J-K')。
同じ移植片上でヒト細胞株を混合する(ポリクローナル腫瘍を発生させる)場合、この結果としてDiO色素を使用して非特異的な二重染色を行うことを避ける(表2)。代わりに、例えば、CM-DiI(セルライン#1)を緑色のCMFDA(セルライン#2)、CM-DiI(セルライン#1)、深い赤(セルライン#2)(表2、 図9J-K')を使用して、実験の終わりに集団を容易に識別します。腫瘍内の各クローンの頻度を定量化するには、フィジーで2種類の異なるカウンタータイプを使用して各クローンを識別し、その後、全細胞数(全クローンの合計)で除算し、各クローンの相対分率(%)を得る。
図 1.ゼブラフィッシュ異種移植プロトコルのフローチャート概要この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ゼブラフィッシュ胚注射用材料:A. ホウケイ酸針 B. 2%アガロースプレート。 C ヘアピンループ D. ヘアピンループを作る手順 :1.ガラス毛管の中に1本の毛を置き、チューブの外に約1センチメートルの毛を残します。 2-3. 長さ0.5mmのループを形成するガラスキャピラリーチューブに鉗子の助けを借りて髪の外側の先端をカールします。 4.マニキュアの滴で毛細管の端をシールします。 5-6.キャピラリーの周りに電気テープを貼り付け、破損から保護します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.受精後48時間(48hpf):A-A'におけるゼブラフィッシュ胚の代表的な実体顕微鏡画像。開発の48 hpfでゼブラフィッシュ胚の正常形態, マイクロインジェクションB-B'の準備ができて.48 hpfでマイクロインジェクションの十分な発達段階を達成しておらず、すでにある程度の心臓浮腫(黒矢印)と膨らんだ黄身を呈するゼブラフィッシュ胚の形態。A'とB'はそれぞれAとBの倍率です。スケールバーは500 μmを表します。
図 4.ゼブラフィッシュマイクロインジェクションプレートの概略表現:A. 3%寒天/2%アガロースプレートにおける麻酔化胚の整列。 B. 受精後2日間のゼブラフィッシュ胚のグラフィック表現は、ペリビテリン空間(PVS)を示す黒矢印を有する。 C および D. 癌細胞は、48時間の受精後胚のペリビテリン空間(PVS)に注入されたPVSに異なる角度で注入することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.転移アッセイ。1時間の注射後(1hpi)注射胚は、循環中の腫瘍細胞の不在(NO_circ)または存在(CIRC)に従ってソートされる。注射後4日で、微小転移を呈する両群の異種移植片の数を定量化する。(A)NO_circ群の細胞は、微小転移を形成するためにすべての転移ステップを受けなければならなかったが、CIRCグループ(B)の細胞は転移カスケードの最後のステップのみを受ける。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.注射後1日および注射後4日間における異種移植片の代表的な蛍光顕微鏡画像。蛍光タンパク質TdTomatoを発現するヒト癌細胞(赤色)を、2dpfゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションした。1dpiでは、注入された胚をスクリーニングし、ひどく注入されたものまたは腫を浮腫で捨てる(A-A')腫瘍サイズに応じてよく注入された胚を並べ替える(B-B')。C. SW620異種移植片において1dpiで異なる腫瘍サイズカテゴリーに存在する細胞の総数の定量を代表する。各ドットは、4 dpi 12.At セクションで説明されているように定量化された異種移植片を表し、幼虫をスクリーニングし、異なるクラスを定量化する:腫瘍なし(D);PVS(E)の腫瘍と、CHTの微小転移を有する(F)スケールバーは500 μmを表します。
図 7.共焦点イメージング用の異種移植片の取り付けの概略表現カバースリップYのラベリングの例、カバースリップXの水色のラインは、取り付け媒体の漏れを防ぐために石油ゼリー/シリコーングリースが適用される周囲を表します。2.共焦点イメージング用カバースリップX上の異種移植片のアライメントの例。3.水性取り付け媒体(青い矢印)はカバースリップX.4の上にカバースリップYを結合するために使用されます。適切にマウントされたカバーリップの例。5.カバーリップは、ガラススライドの上に置かれ、透明なテープで固定されます。6.共焦点イメージングの準備ができて取り付けられた異種移植片。BioRender.com で作成されたこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.腫瘍サイズの共焦点顕微鏡画像定量の視覚的表現4日後注射AにおけるHCT116異種移植片の共焦点像。5 μm間隔で取得したDAPIチャネルの一連のzスタックスライス。赤い破線は、セルカウントに使用される 3 つの代表的なスライスを囲みます。B.ImageJ/フィジーソフトウェアのセルカウンタープラグインを使用したDAPI核定量の図。C-E.DAPIで、またはホスホヒストンH3抗体(緑色)を用いて、有糸分裂体の数値を可視化/定量することができる腫瘍内の単一細胞分解能の例。DとEはCの倍率である。スケールバーは50 μmを表します。
図 9.代表結果。A-E.HCT116大腸癌細胞株をヴィブラントCM-DiIで標識し、受精後2日間のPVS(dpf)胚に注射した。注射後、異種移植片を34°Cでインキュベートした。 1dpiでは、異種移植片をスクリーニングし、非治療コントロールおよびFOLFIRIで無作為に分配し、3日間連続して治療し、4dpiで固定した。A.免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ3抗体および核対抗にDAPIを用いて行った。有糸分裂指数Cの定量化、アポトーシス(活性化カスパーゼ3の%)D、および腫瘍サイズEは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少(マン・ホイットニー検査、P<0.0001)およびアポトーシスの有意な誘導を誘発することを明らかにした(マン・ホイットニー検査、P<0.0001)は腫瘍<の54%の縮小を伴う。分析される異種移植片の数は図に示され、各ドットは1つの異種移植片を表す。F-H.PVSおよびCHT Iにおける緑色のヒト特異的マーカー(ヒトHLA、ki67およびhMITO)で標識された4日後の注射後の大腸癌異種移植片の代表的な画像。J-J'.親油性染色CellTrackerディープレッド(Cy5 - white)、CellTracker Green CMFDA(488 - 緑色)およびDAPIカウンターステインで標識された2つの異なるヒト大腸癌細胞株を注入したポリクローナル異種移植片の共焦点画像。K-K'.親油性染色セルトラッカーディープレッド(Cy5 - 白)、ヴィブラントCM DiI(594 - 赤)およびDAPIカウンターステインで標識された2つの異なるヒト大腸癌細胞株の共焦点画像。スケールバーは50 μmを表します。
| セルライン | 組織 | 種 | 形態学 | 成長モード | 注射のための理想的な合流点 | 注射用解離剤 | 解離時間 | ラベリングプロトコル | 注射媒体 | 細胞の総数を除算(注射に理想的な濃度を達成するため) | |||||||
| SW480 | 大腸腺癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5分 | フラスコ | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | 大腸腺癌(転移) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5分 | フラスコ | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | 大腸癌(原発)、クラス変異体 | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5分 | フラスコ | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | 大腸癌、クラスWT | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5分 | フラスコ | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | 大腸腺癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5分 | フラスコ | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | 大腸腺癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | 乳房腺癌(転移) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 60% FBS + 40% コンプリートメディア | 0,5 | |||||||
| Hs578T | 乳房癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 60% FBS + 40% コンプリートメディア | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | 乳房腺癌(転移) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 60% FBS + 40% コンプリートメディア | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | 乳房腺癌(転移) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,5 | |||||||
| RT112 | 膀胱移行細胞癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 85% - 90% | トリプル | 6分+セルスクレーパー | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | 膀胱移行細胞癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 75% - 85% | トリプル | 10分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 80% 完全な媒体 + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | 膀胱移行細胞癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 85% - 90% | トリプル | 10分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,5 | |||||||
| RT4 | 膀胱移行細胞癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 85% - 90% | トリプル | 6分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,5 | |||||||
| ミア・パカ-2 | 膵上皮上皮癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 80% - 90% | トリプル | 3分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 60% FBS + 40% コンプリートメディア | 0,5 | |||||||
| パンチ-1 | 膵上皮上皮癌(原発) | 人間 | 上皮 | 弟子 | 80% | トリプル | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | PBS/EDTA 2mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | 肺線維芽細胞、BRCA2突然変異体、HR欠乏症 | チャイニーズハムスター | 上皮 | 弟子 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | 肺線維芽細胞、ヒトBRCA2、BRCA2 -/−HR欠損症 | チャイニーズハムスター | 上皮 | 弟子 | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5分 | 1.5 mLマイクロ遠心チューブ | 完全な媒体 | 0,25 | |||||||
表1:複数の細胞株の注入に最適なインビトロ合流
| 細胞染料 | カタログ番号 | 蛍光スペクトル(Exc. - Em.) | ストック希釈 | フラスコに汚れる働き希釈 | 1.5 mLマイクロ遠心分離機に染色する働き希釈 | インキュベーション時間 | 観測 | ||||||
| ヴィブラント CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | 既に希釈済み | PBS 1x で 4:1000 | PBS 1x で 4:1000 | 15 分 @ 37 ºC + 4 分 @ 4 ºC | |||||||
| ヴィブラント・ディオ | V22886 | 484 nm - 501 nm | 既に希釈済み | PBS 1x で 5:1000 | PBS 1x で 5:1000 | 15 分 @ 37 ºC + 4 分 @ 4 ºC | 4日後の注入の共焦点のイメージ投射で良い決断ではない | ||||||
| セルトラッカー ディープレッド | C34565 | 630 nm - 660 nm | DMSO で 1 mM | 0.5 - 2.5 μM PBS 1x | 0.5 - 2.5 μM PBS 1x | 15分 @ 37 ºC | |||||||
| セルトラッカー グリーン CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | DMSO で 10 mM | 0.5 - 2.5 μM PBS 1x | 0.5 - 2.5 μM PBS 1x | 15分 @ 37 ºC | 製品は、注射後48時間後に腹腔に漏れるが、共注入研究に最適 | ||||||
表2:染料と条件
| 大きさ | 幼虫の# | E3 1x メディアボリューム |
| 100 mm x 15 mm (標準) | 50まで | 20-25 mL |
| 60 mm x 15 mm | 20まで | 10 mL |
| 6ウェルプレート | 井戸あたり最大15 | ウェルあたり3〜4 mL |
表 3: ペトリ皿オプション
| E3中50x - 在庫 | 滅菌水の10リットルの場合: |
| 146.9 g の NaCl | |
| 6.3 g の KCl | |
| 24.3 g の CaCl2·2H2O | |
| MgSO 4 ·7H2Oの40.7g | |
| E3メディア1x - 使用する準備ができて | E3培地50xの400 mL |
| 0.01%メチレンブルー溶液60 mL | |
| 最大20リットルの魚系水を満たす | |
| トリケーヌ25x - 在庫と安楽死 | トリケーヌパウダー 2g |
| 逆浸透水500mL | |
| 1Mトリス10mL(pH 9) | |
| pH 7 に調整 | |
| トリケーヌ1x - 麻酔 | トリケーヌ25xの20 mL |
| 最大500mLのシステム水を満たす | |
| 60 mg/mL プロナーゼ - ストック 100x | プロナーゼ 1 g |
| 16.7 mL滅菌水 | |
| 0.6 mg/mL プロナーゼ – 1x 使用できる状態 | 100 μL プロナーゼ 100x |
| 9.9 mL の E3 培地 1x |
表 4: ソリューションの構成
Discussion
がんの開発と薬物スクリーニングのモデルとしてゼブラフィッシュの重要性が高まっているため、多数の出版物3、4、7、13、14、16、18、19、20、21。しかし、ゼブラフィッシュ胚におけるがん細胞の注入は、研究者にとって困難な高い器用さを必要とする技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚異種移植片の設定の初期課題を克服するのに役立つ実用的な情報とヒントを提供することを目指しています。
細胞処理前注入
細胞株を有するゼブラフィッシュ異種移植片の生成のためのこの最適化されたプロトコルは、異なる形態を有する様々なタイプの(癌)細胞に適合させることができる。ゼブラフィッシュ異種移植片に使用されるすべての細胞株はマイコプラズマフリーであることをお勧めします。他の細菌汚染とは異なり、細胞培養中のマイコプラズマの存在は、顕微鏡22の下で容易に検出できる変化を生じない。マイコプラズマ汚染は、細胞株の生着ポテンシャル、薬物に対する感受性、ゼブラフィッシュ胚の生存率に影響を及ぼす可能性がある。
細胞は長期間増殖し続けるが、その表現型や遺伝子型は変化しやすい。培養における細胞株の形態と挙動に精通することが重要です。再現性のある結果を得るために、3-12の間で解凍した後、細胞の通路の数を維持することをお勧めします。したがって、定期的なマイコプラズマ検査を行う必要があります。
細胞は、合流度に達する前に、その対数相(指数成長期〜70%)にする必要があります注射の日に。これは、腫瘍の特徴的な特徴の適切な生着と適切な開発を可能にする。異種移植片内の細胞の表現型の変動を防ぐためには、実験の間に注入のための合流を一定に保つ事が重要です。注入された細胞の数は、ゼブラフィッシュ胚で繁栄するためにより高い濃度の注射を必要とする可能性があるため、各細胞株の特性に適応することができる。
セル・ラベリングに関する考慮事項
注射および将来の分析のためにヒト腫瘍細胞をよりよく視覚化するために、腫瘍細胞は蛍光色素で標識することができる。細胞サイズの違いにより、接着培養における細胞/cm2 の総数は細胞株によって異なる。これは、染色プロトコルの有効性だけでなく、注射のために収穫された細胞の数に影響を与えます.フラスコ当たりの数が少ない(すなわち、Hs578T)またはクラスターで増殖する大細胞(すなわち、BFTC905)は、単一の実験のためにいくつかのフラスコのプーリングを必要とする。この場合、過剰な量の色素(高コスト)の使用を引き起こすので、細胞の染色はフラスコ内で直接行うべきではありません。一方、遠心分離の過剰なサイクルに対して高感度である細胞とフラスコ(すなわち、HCT116)あたり高い数を生み出す細胞は、フラスコに直接染色し、次いでEDTA/細胞スクレーパーで剥離することができる(詳細については 表1参照)。
可能な限り、酵素的アプローチを使用する代わりに、EDTAを使用して注入の日に細胞を取り外し、細胞がより迅速に細胞と細胞の接合を回復し、より少ない遠心分離ステップを受ける。それにもかかわらず、細胞がEDTAに敏感である場合、非常に付着性またはクラスター内で成長する - 酵素的方法を適用することができます。注射用の理想的な濃度の最適化と注入媒体は、各細胞株の特性に依存するため、調整が必要になる場合があります(表1)。
マイクロインジェクションキャリブレーション
ゼブラフィッシュ胚へのオリゴヌクレオチドまたは薬物の送達とは対照的に、異種移植片の細胞株を用いるとき、経緯線は針を較正するために使用されない。注射中にしばらくすると、細胞が詰まり始め、直径を大きくしたり、針を完全に変更するために針の先端を切断する必要があります。この手順は、経緯線の校正を妨げる。
この問題に対処するために、分配される細胞の数は、1〜3パルス以内の胚眼と同様の大きさに達するために必要な排出圧力と時間によって調節される。次いで、腫瘍サイズをさらに制御し、1dpiで、異種移植片が図6B-Bに示すように腫瘍サイズに従ってソートされる。図6Cの例に示すように、このソート方法は腫瘍サイズの変動を減らすのに効率的です:それらをすべて一緒にプールすると(+,++,++)STEVは++クラスの2倍(〜906細胞から〜422細胞)であり、係数変動は++クラスの14,5%と比較して約31.9%です。注入の基準は体積であるため、細胞の総数は細胞タイプによって大きく異なり、細胞のサイズと形状に依存する。例えば、巨細胞は乳癌Hs578Tのような細胞質が多く、はるかに小さい腫瘍(〜600細胞)を産生する。また、各セル行には異なるセル数が必要です。例えば、HT29 CRCおよびRT112尿膀胱癌細胞株は、注入される細胞の数が多いほどゼブラフィッシュの死亡率が高いことを示している。したがって、細胞株が胚に毒性効果を有するか、または注射のより高い/低密度を必要とするかのテストには、異種移植片の開発中に最適化期間が必要です。
注射部位
ゼブラフィッシュ胚異種移植片を生成する際の最も一般的な不一致の1つは、注射部位である。黄身は、通常、その容易なアクセシビリティのために注射のための選択の場所です。しかし、黄身に注入された細胞は死ぬ傾向が高いことが分かりました。技術的に難しいが、我々はPVSに、心臓から可能な限りまで注入することをお勧めします。PVS内では、細胞は、転移特性8,11を示す場合、細胞が凝集し、血管および免疫細胞をリクルートし、移動し、血管内に増殖し、血管内に増殖し、微生物転移を形成し、転移特性を示す場合である。
生着効率
4 dpi での細胞株間の生着効率と腫瘍サイズの違いは、それらの顕著な程度の基底細胞死/生存/増殖が原因で予想されるが、また各細胞株が9を表示する可能性のある自然免疫原性による。
転移
転移は、2つの任意のステージに分割できるイベントの複数のステップカスケードを含みます。第1段階では、腫瘍細胞は原発部位から切り離し、隣接する組織を移動して侵入し、その後血流中に浸潤する必要があります。第2段階では、腫瘍細胞は循環して生き残り、血液またはリンパ管から精腸を起用し、最終的に二次部位23にコロニー形成する。これらの初期事象と後期事象を区別し、これらのステップを実行するために異なる腫瘍細胞の潜在的/熟練度に対処するために、我々は簡単なアッセイを設計した。
一般に、PVSに注入すると、腫瘍細胞は直接循環に入り、尾部造血組織(CHT)(尾部)に物理的に閉じ込められる。しかし、各腫瘍細胞の特性によれば、いくつかの腫瘍細胞がCHT 4 dpiに残り、他の腫瘍細胞が消失する間に微小転移を形成することができることを見てきた(CHTに巻き込まれた後にクリア)。
したがって、細胞が直接循環に入れられたときに微小転移効率(4dpiで)を比較することによって、CIRC(細胞は転移の後期ステップを通過するだけでいい)対しない場合- NO CIRC(細胞は微小転移を形成するために早期および後期のステップを通過する必要がある)を比較することによって、早期または後期転移電位を評価することができる。我々は、CHTにおいて効率的に微小転移を形成し得る腫瘍細胞を観察した(CIRCおよびNO CIRC)、これらの細胞は転移カスケード(例えばSW480およびMDA-MB-468)8,11の全ステップを受ける能力を有することを示唆している。対照的に、他の腫瘍細胞は、両方の群において非常に低い転移電位を有し、微小転移を起こしにくい、循環に注入された場合でさえ(すなわち、24hpiでCHTに見えるが、4dpiでは、それらはもはや存在しない、例えばHs578T)8。しかし、循環に注入されたときにのみ微小転移を形成できる別のグループ(CIRC群の微小転移しか観察できない)を明らかに発見しました。これは、これらの細胞が転移カスケードの最初のステップを実行する効率が低いが、一方で循環して生き残り、外回し、遠くの部位を植民地化できることを示唆している。
免疫染色とイメージング
固定する前に、この注入プロトコルは、ライブ差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡、回転ディスク顕微鏡、高解像度ライブ共焦点イメージング、ライトシート顕微鏡などの他のライブイメージングアプローチに使用できます。
死んだ細胞および細胞破片は、蛍光体顕微鏡を通して観察されると明るく見え、特に研究の目的が細胞株の転移電位を評価することである場合、生細胞と間違えられる可能性がある。我々は、腫瘍および微小転移の生存状態を評価するために、特異的生存マーカーおよびDAPIを用いて共焦点イメージングを行うことの重要性を強調したい。また、抗ヒトミトコンドリアや抗ヒトHLAなどのヒト細胞を検出するために、特定のヒト抗体を使用することが基本です。プロトコルを実装する際、実験者は、実体顕微鏡における染色を共焦点画像と比較して目を向ける。しばらくすると、実験者は蛍光体顕微鏡で生細胞から破片を明確に区別することができます。
蛍光領域全体等の腫瘍の負担を定量化する他の方法は広く用いられているが、より正確な方法として、全体のマウント免疫染色及び共焦点イメージングを行うことを推奨する。親油性色素染色の効率は非常に変動する(すなわち、一部の細胞は非常によく染色されているのに対し、膜の脂質含有量が原因ではない細胞もある)だけでなく、脂肪性染料が凝集体を形成する回数が多く、死んだ細胞が明るい傾向があり、生細胞と間違えられるいくつかのアーティファクトを生じる。
細胞は、蛍光タンパク質を用いて、追跡を助け、細胞標識をスキップすることができます。しかし、トランスデューセと非トランスデューセの細胞がゼブラフィッシュ異種移植片で同じ結果を生じることを確認してください。
さらに、マクロファージは、これらの蛍光細胞デブリが蛍光標識されて移行し、偽陽性の転移細胞を生成する食細胞を食細胞化することができる。したがって、一連の分析ツールを推奨しますが、これはもちろん、腫瘍の挙動をより正確に解釈するために他の多くの読み出しに拡張することができます。
- 増殖 - DAPIまたは抗pHH3Ser10 抗体(メルクミリポア猫#06-570)を使用した有糸分裂体の定量化、
- アポトーシスによる細胞死-抗体Caspase3Asp175( 細胞シグナル技術cat.#9661)またはそれに相当する、
- 腫瘍サイズ - DAPIカウント- ヒト腫瘍細胞は非常に明確なクロマチン組織を示すので、ゼブラフィッシュ細胞と容易に区別され、常に色素で再確認することが可能です(眼を訓練しているとき)
- 転移研究では、ヒト細胞を明確に検出する-抗ヒトHLA(Abcam EP1395Y Cat. #ab52922)、抗ヒトミトコンドリア(メルクミリポア猫#MAB1273クローン113-1)。
コントロール癌細胞HCT116のZスタック間の5μm間隔の共焦点獲得(直径10~12μmの平均核サイズ)を用いて、細胞の約50%が連続した2つのスライス間で共有されているのが観察されました。したがって、すべてのスライスがカウントされる場合、同じセルを2回カウントするリスクが高くなります。スライス間を行き来して定量化の問題を回避すると、時間がかかり、エラーが発生しやすいテクニックが生じます。細胞の総数の定量化を容易にし、研究者間のより再現性を可能にするために、我々は、このプロトコル8で前述した腫瘍サイズ式を作成した。
スライス間で共有される約50%のセルを考慮して、補正番号(1.5)を含めます。研究者間の腫瘍全体の手動カウントの平均誤差は20%であることがわかりました。この式を使用する2人の研究者は2%の誤差を持っていました。この式の使用は93%の正確さおよび98%の再現率を有する。自動化メソッドもテストしましたが、しきい値設定によって 50% を超えるエラーが発生しました。
アポトーシス細胞の特性により、活性化Caspase3細胞の定量化がより困難である。間違いの数と結果の変動を減らすために、コントロールと実験サンプルを同じ研究者が数えることをお勧めします。さらに、この技術を学ぶとき、新しい研究者は、結果を比較し、訓練するために、より経験豊富な研究者によって既に定量化された画像を数える必要があります。
アッセイの長さは必要に応じて延長することができる。しかし、ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後〜7日(注射後5日)から生餌を必要とすることを考慮することが重要です。さらに、動物福祉ガイドラインおよび適用される規則は、受精後6日以上の幼虫に適用される。
このプロトコルは、1人の研究者が1時間あたり約〜200〜300匹のゼブラフィッシュ幼虫を注入することを可能にする有用なツールを提供します。分析と統計的解釈を含む完全なアッセイの結果は、3週間で得られる。このプロトコルが、研究者がゼブラフィッシュ異種移植片を生成する専門家になることを願っています。それは簡単ではありません。練習する必要があるが、そこに着く。がんばって！
Disclosures
何一つ
Acknowledgments
シャンパリモー財団、コンジェント(LISBOA-01-0145-FEDER-022170、FCT/Lisboa2020の共同出資)に資金を提供し、資金に感謝します。VP(SFRH/BD/118252/2016)、MML(PD/BD/138203/2018)のためのFCTフェローシップ。重要な議論のためのFiorの研究室のすべてのメンバー;データ共有のためのB.コスタとC.レベロ・デ・アルメイダ;そして、私たちの研究室のメンバーC.レベロ・デ・アルメイダ、M.バローゾとL.レイテは、ビデオへの参加のために。CFフィッシュファシリティ(C.セルタル、J.モンテイロら)とシャンパリモー・コミュニケーション、イベント、アウトリーチチーム、特にアレクサンドル・アジンヘイラの素晴らしい映画製作とカタリーナ・ラモスとテレサ・フェルナンデスの助けに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
| anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
| anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
| Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
| Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
| Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
| Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
| Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
| Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
| Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |
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