Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

体外 E3泛素连接酶功能分析

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

本研究为分析E3泛素连接酶催化活性提供了详细的 体外 泛素化测定方案。重组蛋白使用原核系统（如 大肠 杆菌培养物）表达。

Abstract

泛素（Ub）与底物蛋白的内部赖氨酸残基的共价附着，这一过程称为泛素化，代表了真核生物中最重要的翻译后修饰之一。泛素化由三种酶类的顺序级联介导，包括泛素激活酶（E1酶），泛素偶联酶（E2酶）和泛素连接酶（E3酶），有时还有泛素链伸长因子（E4酶）。在这里，提供了用于泛素化测定 的体外 方案，允许评估E3泛素连接酶活性，E2-E3对之间的合作以及底物选择。可以通过监测游离多泛素链的产生和/或E3连接酶的自动泛素化来筛选合作的E2-E3对。底物泛素化通过E3连接酶的选择性结合来定义，并且可以通过 体外 反应的蛋白质印迹来检测。此外，还描述了E2~Ub放电测定法，这是直接评估功能E2-E3合作的有用工具。在这里，泛素的E3依赖性转移从相应的E2酶跟随到游离赖氨酸氨基酸（模仿底物泛素化）或E3连接酶本身的内部赖氨酸（自泛素化）。总之，提供了三种不同的 体外 方案，这些方案快速且易于执行，以解决E3连接酶催化功能。

Introduction

泛素化是Ub与底物蛋白1共价连接的过程。Ub修饰由连续的酶促反应催化，涉及三种不同酶类的作用，即Ub激活酶（E1s），Ub偶联酶（E2s），Ub连接酶（E3s）和可能的Ub链伸长因子（E4s）2，3，4，5。在三磷酸腺苷（ATP）和镁（Mg2+）依赖性Ub被E1激活后，E1的活性位点半胱氨酸攻击Ub的C端甘氨酸，形成硫酯复合物（Ub~E1）。从ATP水解中汲取的能量使Ub达到高能量过渡状态，该状态在随后的酶级联中保持。接下来，E2酶将活化的Ub转移到其内部催化半胱氨酸中，从而形成瞬态Ub~E2硫酯键。随后，Ub被转移到底物蛋白上。

这可以通过两种方式完成。E3连接酶可以首先与E2结合，或者E3连接酶可以直接结合Ub。后一种方式导致E3~Ub中间体的形成。在任何一种情况下，Ub通过在Ub的C端羧基和底物6的赖氨酸Ɛ-氨基之间形成同肽键与底物蛋白连接。人类基因组编码两个E1，大约40个E2和600多个推定的泛素连接酶7。基于E3的Ub转移机制，将Ub连接酶分为三类，涉及E6AP C-Terminus（HECT）型同源，真正有趣的新基因（RING）/U-box型，以及RING（RBR）型连接酶8之间的RING。在这项研究中，含有连接酶的U盒，HSC70相互作用蛋白（CHIP）的羧基终点，被用作代表性的E3酶。与形成Ub~E3硫代酯的HECT型E3酶相反，CHIP的U-box结构域结合E2~Ub并促进随后的Ub/底物直接从E2酶8，9转移。基于U型箱对酶促功能的重要性，使用非活性的芯片U型箱突变体CHIP（H260Q）作为对照。CHIP（H260Q）无法与其同源E2s结合，从而失去其E3连接酶活性10。

蛋白质泛素化在调节真核细胞中的多种细胞事件中起着至关重要的作用。Ub分子与底物蛋白的可逆附着促进的细胞结果的多样性可归因于Ub的分子特性。由于Ub本身含有七个赖氨酸（K）残基，用于进一步泛素化，因此存在丰富多样的具有不同尺寸和/或拓扑结构的Ub链类型11。例如，底物可以被单个Ub分子在一个（单泛素化）或多个赖氨酸（多单泛素化）修饰，甚至通过Ub链（多泛素化）11。Ub链通过相同或不同的Ub赖氨酸残基形成同型或异型，这甚至可能导致支链Ub链9。因此，蛋白质泛素化导致Ub分子的多种排列，提供特异性信息，例如，用于偶联蛋白的降解，活化或定位12，13。这些不同的Ub信号能够快速重编程细胞信号通路，这是细胞响应不断变化的环境需求能力的重要要求。

泛素化的一个核心方面与蛋白质质量控制有关。错误折叠或不可逆受损的蛋白质必须被降解并被新合成的蛋白质取代，以维持蛋白质稳态或蛋白质稳态14。质量控制E3连接酶，CHIP，与分子伴侣合作，在受损蛋白9，15，16，17的Ub依赖性降解中合作。除此之外，CHIP调节肌球素导向的伴侣UNC-45B（Unc-45同源物B）的稳定性，其与肌肉功能紧密协调，偏离最佳水平导致人肌病18，19，20，21。26S蛋白酶体对UNC-45B的降解是由K48连接的聚Ub链9的附着介导的。在没有底物蛋白的情况下，CHIP进行自泛素化10，22，23，这是RING/ U-box E3泛素连接酶24，25的特征，并被认为调节连接酶活性26。本文中描述的体外泛素化测定方法的应用有助于系统地鉴定与CHIP合作促进游离聚Ub链形成和/或CHIP的自动泛素化的E2酶（方案部分2）。此外，观察到UNC-45B的CHIP依赖性泛素化，这是E3连接酶18，19的已知底物（方案部分3）。最终，监测了来自Ub~E2硫酯的活化Ub的CHIP依赖性转移（协议第4节）。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 缓冲液和试剂的制备

注：下面列出了在实验室中手动制备的缓冲液和试剂。实验方案中使用的所有其他缓冲液和试剂均从不同来源购买，并根据制造商的说明使用。

  1. 准备10x磷酸盐缓冲盐水（10x PBS）。为此，将1.37 M氯化钠（NaCl），27 mM氯化钾（KCl），80mM磷酸氢二钠二水合物（Na2HPO4 .2H2O）和20 mM磷酸二氢钾（KH2PO4）混合在1升双蒸馏H2O（ddH2O）中。高压灭菌10x PBS，并在ddH2O中制备1x PBS溶液。
    1. 在121°C和98.9 kPa下进行高压灭菌15分钟。
      注：在这些条件下对所有缓冲液和溶液进行高压灭菌。如果没有另有说明，溶液在室温（RT）下储存。
  2. 通过将0.1%吐温加入1升1x PBS来制备1升PBS-Tween（PBS-T）溶液。
  3. 通过将L-赖氨酸溶解在ddH2O中来制备10mL L-赖氨酸储备溶液，并在1mL份中等分L L-赖氨酸，并将其储存在-20°C直至进一步使用。
    注意：L-赖氨酸可以反复冷冻和解冻。
  4. 通过将EDTA溶解在200 mL的ddH 2 O中来制备0.25 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
    1. 用氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至8.0。
    2. 将音量调节至 250 mL，ddH2O。
    3. 高压灭菌解决方案。
  5. 通过将BSA溶解在ddH 2 O中来制备10mL20mg/ mL牛血清白蛋白（BSA）溶液。
    注意：BSA可以反复冷冻和解冻。
  6. 通过将50 mM MES，50 mM Tris碱，3.47 mM十二烷基硫酸钠（SDS）和1.03 mM EDTA溶解在0.9 L ddH2O中，制备1 L 2-（N-吗啉）乙烷磺酸（MES）电泳缓冲液。充分混合后，将音量调节至1L。
    1. 1x缓冲液的pH值为7.6。不要用酸或碱调节pH值。
  7. 通过将10克奶粉溶解在1x PBS-T中来制备200 mL封闭溶液（5%牛奶）。将封闭溶液在4°C下储存长达一周。
  8. 根据制造商的说明准备1L转印缓冲液（见 材料表）。
  9. 通过将125mM Tris碱，4%SDS，4%甘油，0.03%溴酚蓝和50μL / mL β巯基乙醇溶解在50 mL ddH 2 O.等分试样中，制备2xSDS样品缓冲液，并在-20°C下储存直至使用。

2. 体外 自泛素化测定

  1. 检测制备和执行
    1. 根据蛋白质的给定摩尔浓度和蛋白质溶液的蛋白质浓度，计算每次反应所需的每种试剂的体积。根据自动泛素化反应，使用100 nM E1，1μM E2，1μM E3和50μM Ub。用ddH 2 O调节反应的体积至20μL。
      注：ATP溶液和泛素化缓冲液作为10x储备溶液购买，并以1x使用。
    2. 为所有反应准备移液方案。测试九种不同的E2酶在单个泛素化反应中（I）与CHIP，（II）与催化无活性CHIP（H260Q）突变体和（III）无CHIP的功能。
    3. 为避免移液错误，请在冰上制备预混液，其中包含所有反应所需的体积以及一次额外的反应。计算每次反应所需的预混液量。
      注：预混液组分是每个反应同样需要的试剂， 即E1、E3、Ub、ATP和泛素化缓冲液。
    4. 将ddH2O和预混液加入聚合酶链反应（PCR）管中。将管子放在冰上。
    5. 在通过加入E2酶开始泛素化反应之前，按照以下程序设置PCR热循环仪：2小时，37°C，然后4°C，无限。
    6. 在相应的试管中加入1μM的E2酶，并将样品在PCR热循环仪中孵育指定的时间段。
    7. 2小时后，在每次反应中加入SDS样品缓冲液，并通过上下移液几次进行混合。
      注：样品缓冲液所需的体积取决于样品缓冲液的储液浓度。在这里，将20μL的2x SDS样品缓冲液加入到每个反应中。
    8. 立即将样品在95°C下煮沸5分钟，然后继续进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。将变性的蛋白质储存在-20°C。
  2. 凝胶电泳和蛋白质印迹
    1. 解冻后，向下旋转样品约10秒并上样SDS-PAGE凝胶。使用蛋白质分子量标准品作为尺寸参考。
      注意：这里使用4-12%双-三梯度凝胶和3μL蛋白质分子量标准品。将样品体积分开，并使用每个样品的20μL等量上样两个凝胶。
    2. 将凝胶在160-200 V下运行约30-45分钟，以使样品前端到达凝胶的底部。
    3. 将每个凝胶转移到装有半干转印缓冲液的塑料容器中，并在室温下孵育2-5分钟。
    4. 每粒SDS凝胶准备两张凝胶大小的转印纸和一块凝胶大小的硝酸纤维素膜，并预浸泡在半干转印缓冲液中。按以下顺序在WB室中从下到上组装蛋白质印迹（WB）三明治：印迹纸，硝酸纤维素膜，SDS-PAGE凝胶，印迹纸。
    5. 去除可能被困在三明治层之间的气泡。为此，请使用滚筒小心地在三明治上滚动几次。
    6. 关闭腔室，让多余的转印缓冲液排出。
    7. 将腔室置于相应的转印装置中，并使用以下程序进行半干转印：25 V，1.0 A，30分钟。
    8. 将印迹的膜转移到充满封闭溶液的塑料容器中，并在室温下孵育30分钟。
    9. 通过将抗体加入含有封闭试剂的10 mLPBS-T中来制备一抗溶液（见 材料表）。
      注意：抗体的工作浓度是抗体特异性的。在这种情况下，以1：5，000的稀释度使用单克隆小鼠抗泛素抗体。对于第二种凝胶，在PBS-T/封闭试剂中以1：5，000使用单克隆兔抗CHIP抗体。
    10. 用一抗溶液代替封闭溶液，并在摇臂上在4°C下孵育过夜。
    11. 用PBS-T洗涤膜三次10分钟。
    12. 通过将相应的抗体加入10 mL PBS-T来制备二抗溶液。
      注意：在这里，山羊抗小鼠抗体和小鼠抗兔抗体以1：10，000的稀释度使用。
    13. 将膜与二抗在摇臂上RT孵育1小时。
    14. 用PBS-T洗涤膜三次，持续5分钟。
  3. 数据分析
    1. 根据制造商的说明，将辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体的蛋白质印迹检测试剂添加到洗涤膜上，并使用X射线胶片或电荷耦合设备相机捕获HRP信号（图1）。

3. 体外 底物泛素化测定

  1. 检测制备和执行
    1. 根据蛋白质的给定摩尔浓度和蛋白质溶液的蛋白质浓度，计算每个反应所需的每种试剂的体积。每个底物泛素化反应，使用100 nM E1，1μM E2，1μM E3，1μM底物和50μM Ub。使用10x ATP溶液和10x泛素化缓冲液1x。用ddH 2 O调节底物泛素化反应的体积至20μL。
    2. 为所有反应准备移液方案。包括适当的对照反应，验证底物泛素化是E3特异性的。使用蛋白质UNC-45B作为CHIP的代表性底物和催化非活性CHIP突变体（H260Q）作为对照。制备以下反应：E1，E2，Ub混合物（包括Ub，ATP，泛素化缓冲液）;E1， E2， Ub 混合， UNC-45B;E1， E2， Ub mix， CHIP（H260Q）， UNC-45B;和E1，E2，Ub混合，芯片，UNC-45B。
    3. 为避免移液错误，请在冰上制备预混液，其中包含所有反应所需的体积以及一次额外的反应。计算每次反应所需的预混液的体积。
      注意：本测定的预混成分包括E1，E2，Ub，ATP和泛素化缓冲液。
    4. 按以下顺序加入反应组分：ddH2O，底物，E3连接酶。
    5. 在通过加入预混液开始泛素化反应之前，按照以下程序设置PCR热循环仪：2小时，37°C，然后4°C，无限。
    6. 将预混液加入每个试管中，并将样品在PCR热循环仪中孵育指定的时间段。
    7. 2小时后，向每个反应中加入2x SDS样品缓冲液，并通过上下移液几次进行混合。
    8. 运行后，立即将样品在95°C下煮沸5分钟，然后继续使用PAGE。或者，将变性的蛋白质储存在-20°C。
  2. 凝胶电泳和蛋白质印迹
    1. 按照第2.2节所述进行凝胶电泳和蛋白质印迹。分别使用特异性抗体检测底物和E3连接酶。
      注意：在这里，UNC-45B与来自 c-myc 基因产物的多肽蛋白标签融合，允许使用单克隆小鼠抗MYC抗体。抗MYC在1：10，000使用。
  3. 数据分析
    1. 按照第 2.3 节（图 2）中所述执行数据分析。

4. 赖氨酸放电测定

  1. 检测制备和执行
    1. 通过 E1 用 Ub 对 E2 酶进行充电
      1. 根据蛋白质的给定摩尔浓度和蛋白质溶液的蛋白质浓度，计算每次反应所需的每种试剂的体积。每次充电反应，使用2μM E1，4μM E2和4μM无赖氨酸泛素（Ub K0）。在 1x 上使用 10x ATP 和 10x 泛素化缓冲液。将装料反应的体积调节至20μL，ddH20。
        注意：不含赖氨酸的Ub K0突变体用于强制单泛素化E2的独家生产。也可以使用野生型Ub;然而，这可能导致不同的E2~Ub修饰（例如，E2的多泛素化），这更难以分析。对于首次使用或使用新的E2酶时，请确定E1可以达到的E2上的Ub充电水平。要确定充电的产量，请通过考马斯染色可视化未充电与充电 E2。在这里，当使用UBE2D2和Ub K0的等摩尔比时，大约一半的Ub K0被可靠地转换为UBE2D2~Ub（补充图S2A）。
      2. 为装料反应准备移液方案。根据随后选择的放电反应调整装药反应的体积， 例如，在单个放电反应中使用CHIP和CHIP（H260Q）。因此，制备体积加倍的一次装药反应。
        注意：首次使用时，测试所选E3连接酶的不同浓度，以监测最佳放电条件，并通过蛋白质印迹分析它们。在理想状态下，E2中Ub的放电会随着时间的推移而增加，直到相应的E2~Ub蛋白条带消失。
      3. 在37°C下孵育装料反应15分钟。
    2. 终止充电反应
      1. 通过加入终浓度为1.8 U / mL的吡喃酶来停止充电反应。在室温下用烧热酶孵育5分钟，然后以30mM的终浓度加入EDTA。将装料反应的体积调节至30μL，ddH2O。
        注意：吡咯烷酶用于将ATP分子转化为ADP（二磷酸腺苷）分子。由于E1酶的活性是ATP依赖性的，E1不能再对E2充电。EDTA还用于通过淬灭Mg 2 +离子来确保E1受到抑制，Mg2 +离子是E1的必要辅助因子。停止反应所需的吡喃酶的体积可能因测定条件而异。虽然单独使用吡喃酶已经淬灭了可用的ATP分子，但吡喃酶和EDTA的组合在阻止E1-UBE2D2对的充电反应方面更有效。由于停止反应是测定重现性的关键因素，因此应针对新的E1-E2对进行有效停止测试。为此，设置一个充电反应，停止它，并在特定的时间点收集样品，例如，在2，5，10和15分钟后。E2〜Ub水平不变表明反应已经停止，并且硫酯在该时间段内稳定（补充图S2B）。
    3. E3放电E2~Ub
      1. 准备四个对应于不同时间点的管子（t0，t 1，t 2，t 3）;向每个试管中加入非还原性样品缓冲液（6.7μL 4x十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液）。
        注意：请勿在样品缓冲液中使用还原剂。
      2. 从停止的充电反应中除去6 μL t0，并用ddH 2 O调节体积至20μL。
      3. 将t0 样品在70°C下孵育10分钟。
        注意：不要通过延长孵育时间来煮沸样品，因为硫代酯在较高温度下不稳定。
      4. 计算每次放电反应所需的每种试剂的体积。使用剩余的24μL带电的E2，并加入10mM L-赖氨酸，1mg / ml BSA和500nM的E3连接酶。使用1x的泛素化缓冲液，并将体积调节至80μL，ddH2O。
      5. 为所有放电反应准备移液方案，除CHIP（WT）外，还使用CHIP（H260Q）作为对照。
      6. 通过按以下顺序添加所需组分在冰上设置放电反应：ddH2O，泛素化缓冲液，BSA，赖氨酸，E3连接酶和带电的E2以开始反应。
      7. 在室温下孵育放电反应。
      8. 通过将20μL放电反应转移到相应的样品管中，在5，30和60分钟后取样。
        注意：允许正确监测放电的合适时间点可能因E2-E3对而异。
      9. 立即涡旋样品，并在70°C下孵育10分钟。
      10. 直接继续使用 PAGE。
        注意：E2~Ub硫代酯即使在样品缓冲液中变性后也可能不稳定。因此，凝胶电泳应在测定执行后直接进行。
  2. 凝胶电泳和蛋白质印迹
    1. 执行凝胶电泳和蛋白质印迹，如第2.2节所述。使用Ub特异性抗体，如果可用，还使用在不同物种中培养的E3特异性抗体，允许同时检测Ub和E3连接酶信号。
  3. 数据分析
    1. 执行数据分析，如第 2.3 节（图 3）所述。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

为了鉴定与泛素连接酶CHIP合作的E2酶，在单个 体外 泛素化反应中测试了一组E2候选酶。通过E3依赖性泛素化产物的形成来监测配合的E2-E3对， 即E3连接酶的自泛素化和游离Ub聚合物的形成。通过蛋白质印迹法分析泛素化产物。数据解释基于所得蛋白质条带与分子量标记物的大小比较。蛋白质泛素化导致特定能带模式的形成，其特征在于出现双条带或多个迭代带，其大小差分别为8.6 kDa（单个Ub分子的大小）。

这里，在野生型芯片（图1A）、非活性U盒突变芯片（H260Q）（图1B）或无芯片（补充图S1）的情况下，测试了9个E2s促进泛素化产物形成的能力。E3非依赖性的泛素产物是在存在无活性CHIP和没有CHIP的情况下形成的（图1B 和 补充图S1）。非活性芯片不是自泛素化的（图1B）。相比之下，野生型芯片分别与UBE2D家族（D1-D3）和UBE2E家族（E1，E3）的成员结合时被自动泛素化（图1A，车道3，4和5）。虽然游离的poly-Ub链是与UBE2D1-3合作生产的，但分别没有在UBE2E1或UBE2E3中检测到（图1A，通道6和7）。

UBE2D家族促进游离Ub聚合物的形成和CHIP的自泛素化的能力归因于E227，28背面存在非共价泛素结合位点。类似地，UBE2N/V1（图1A，泳道9）对游离Ub链的排他性形成归因于Ub由特定的UBE2V1亚基（Uev亚基）结合，指导K63连接的Ub链29的形成。在UBE2C1和UBE2H存在下没有形成泛素化产物（图1A，通道2和8）。总之，CHIP可以在体外与几种E2酶合作;然而，它的自泛素化是E2酶特异性的。

接下来，UBE2D2-CHIP对用于研究肌球蛋白导向伴侣UNC-45B通过CHIP连接酶活性的泛素化（图2）。通过蛋白质印迹分析底物泛素化。非泛素化的UNC-45B的分子量为103 kDa（图2，泳道4）。CHIP的非活性U型盒突变体既不执行UNC-45B的泛素化，也不执行自动泛素化（图2，通道3）。相反，在与野生型芯片孵育时检测到UNC-45B的泛素化和CHIP的自泛化（图2，通道6）。因此，CHIP可以在 体外泛素化UNC-45B，这表明UNC-45B是CHIP18的保守底物。

最终，在没有任何底物蛋白的情况下分析了CHIP的催化活性。为此，进行了赖氨酸放电测定，其中游离赖氨酸氨基酸可以在没有E3底物的情况下作为Ub受体（图3，补充图S2C）。放电测定包括一个充电步骤，其中Ub通过E1加载到E2上，一个停止步骤以防止Ub进一步加载到E2上，以及一个放电步骤，其中Ub从瞬态Ub~E2硫酯转移到游离赖氨酸氨基酸和/或E3连接酶的赖氨酸残基上。进行蛋白质印迹分析以可视化Ub修饰蛋白和E3连接酶CHIP。不带电的UBE2D2酶的分子量为17 kDa（补充图S2C）。

当用单个Ub分子充电时 - 通过使用无赖氨酸Ub（Ub K0）确保 - UBE2D2〜Ub的分子量向上移动至约26 kDa。时间点零（t0）表示带电E2的总产量（图3）。在存在非活性芯片（35 kDa）的情况下，检测到UBE2D230，31的微弱E3连接酶非依赖性放电，但没有检测到CHIP的自泛化。相反，在野生型CHIP（35 kDa）存在下，检测到UBE2D2的更快放电，在60分钟内产生完全放电。同时，观察到CHIP的自泛素化，表明CHIP促进了Ub在其自身赖氨酸残基上的转移。

Figure 1
图1：用于E2-E3酶协作的蛋白质印迹分析。使用不同的人E2酶（从左到右：空，UBE2-D1，-D2，-D3，-E1，-E3，-E3，-H和-N / V1）进行体外自动泛素化反应，如使用（A）野生型芯片或（B）无活性芯片U盒突变体CHIP（H260Q）作为E3泛素连接酶。将样品平分，在单独的聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用抗CHIP和抗Ub抗体进行免疫印迹以可视化反应产物。缩写： Ub = 泛素;CHIP = HSC70相互作用蛋白的羧基末端;ATP = 三磷酸腺苷。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：蛋白质印迹分析监测底物泛素化。按照指示进行体外底物泛素化反应，以检测CHIP野生型或无活性CHIP U型突变体CHIP（H260Q）对人UNC-45B的泛素化。人UBE2D2被用作E2酶。缩写：WT = 野生型;Ub = 泛素;CHIP = HSC70相互作用蛋白的羧基末端。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：蛋白质印迹分析监测从UBE2D2~Ub硫酯转移的芯片依赖性Ub转移。 如前所述，通过无赖氨酸Ub（Ub K0）对人UBE2D2进行充电，停止充电反应，并放电UBE2D2〜Ub。对于放电反应，使用野生型CHIP或非活性CHIP U盒突变体CHIP（H260Q）作为泛素连接酶，并提供10 mM L-赖氨酸作为潜在的Ub受体。在指定时间段后收集样品，在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用抗Ub /抗CHIP抗体混合物免疫印迹。缩写： Ub = 泛素;CHIP = HSC70相互作用蛋白的羧基末端;ATP = 三磷酸腺苷。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图S1：在没有E3的情况下监测E2酶活性的代表性蛋白质印迹。在没有E3连接酶以筛选E3非依赖性反应产物的情况下，使用不同的人E2酶（从左到右：空，UBE2-D1，-D2，-D3，-E1，-E3，-H和-N / V1）进行 体外 泛素化反应。样品在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用抗Ub免疫印迹。缩写： Ub = 泛素;ATP = 三磷酸腺苷。 请点击此处下载此文件。

补充图S2：UBE2D2~Ub K0硫酯的充电率和稳定性分析。（A）在各种条件下测试了E1实现的UBE2D2充电的产量。第一次充电反应（I）由5 μM E1，5 μM E2和50 μM Ub K0组成。第二次充电反应（II）由2 μM E1，4 μM E2和4 μM Ub K0组成。在37°C下按所述进行30分钟的装料反应。 在15和30分钟后收集样品。通过加入4x LDS样品缓冲液停止反应，并在凝胶电泳和考马斯染色之前在70°C下孵育10分钟。未充电的UBE2D2被用作控制。大约一半的UBE2D2被转换为UBE2D2~Ub。15分钟后未检测到额外充电。此外，E1的增加和游离泛素的增加都没有改变UBE2D2~Ub的充电率。因此，随后使用2μM E1，4μM E2和4μM Ub K0在37°C下进行充电15分钟。（B）装药后，加入1.8 U/mL烧焦酶和30mM EDTA停止反应，并在室温下孵育，2、5、8、10和15 min（泳道2-6）后收集样品，未带电的UBE2D2作为对照（泳道1）。加入4x LDS样品缓冲液，并在凝胶电泳和考马斯染色之前将样品在70°C下孵育10分钟。通过UBE2D2~Ub蛋白的恒定条带强度测量，停止是有效的，也表明硫酯在指定时间段内是稳定的。（C）通过无赖氨酸Ub（Ub K0）对人UBE2D2进行充电，停止充电反应，并放电UBE2D2〜Ub，如前所述。对于放电反应，使用野生型CHIP或非活性CHIPU盒突变体，CHIP（H260Q）作为泛素连接酶，提供10 mM L-赖氨酸作为潜在的Ub受体。在指定的时间段后收集样品，在单独的聚丙烯酰胺凝胶上运行，并进行考马斯染色。请点击这里下载此文件。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

本文介绍了用于分析E3连接酶功能的基本 体外 泛素化方法。在进行 体外 泛素化测定时，应考虑一些E2酶可以进行自泛素化，因为它们的活性半胱氨酸攻击其自身的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基位于活性位点30附近。为了规避这个问题，建议使用E2突变体，其中将相应的赖氨酸残基交换为精氨酸，这导致催化活性E2酶对自身泛素化32具有抗性。当通过赖氨酸放电测定法监测Ub转移以确保测定的可重复性时，这一点尤其重要。另一个关键因素是E2~Ub硫酯键的瞬态性质。如果硫酯稳定性限制了 可能的体外 应用，则可以将E2的活性半胱氨酸残基交换为丝氨酸以产生更稳定的E2〜Ub氧酯33。对于首次使用或使用新的E2酶时，请确定E1可以达到的E2上的Ub充电水平。充电效率可能受到多种因素的影响，包括E1的物种来源，充电反应的温度以及Ub与E2的摩尔比。要确定充电的产量，请可视化未充电 与。通过考马斯染色充电E2。

总而言之，这些潜在的限制强调了 体外 测定条件的经验优化的重要性，例如E2-E3对，E2充电和放电动力学，重组蛋白的摩尔浓度和活性，特别是对于赖氨酸放电测定，以获得可重复的结果。鉴于Ub与底物蛋白共价附着的细胞功能多种多样，蛋白质泛素化分析是一个受欢迎的研究领域。但是，泛素化事件的分析可能很困难，尤其是在 体内。这种困难源于多种因素，包括E3-底物相互作用34的瞬态性，许多E3连接酶的冗余，以及E3连接酶对几个底物的混溶性35。此外， 体内 特定泛素化事件的表征受到其他因素的存在的阻碍，例如泛素链伸长因子和调节泛素链拓扑结构的去泛素化酶36。这些限制强调了强大的 体外 技术的重要性，这些技术有助于表征定义的重组系统中E3泛素连接酶的酶活性。

除了所描述的应用外，体外泛素化测定还可用于通过使用连锁型特异性抗体来检测Ub-linkage类型。作为另一种更详细的方法，可以从聚丙烯酰胺凝胶中提取Ub修饰底物的相应蛋白质条带，并通过质谱分析。连锁类型的鉴定支持对E3-底物相互作用的生理作用的理解，这对于表征疾病相关的底物降解途径37，38特别重要。类似地，赖氨酸放电测定可用作揭示E3泛素连接酶或E3连接酶家族30之间的催化差异的有效工具。总之，本文所述的体外泛素化方法是分析E3连接酶功能不同方面的有效工具。除了所描述的方法的相对简单的执行之外，一个主要优点是普遍适用性，因为来自所有真核来源的蛋白质可以在体外重组表达和研究，而无需特殊设备。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢实验室成员对手稿的批判性讨论和有益的建议。由于大小限制，我们很抱歉没有引用有价值的贡献。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）的支持 - SFB 1218 - Projektnumber 269925409和卓越集群EXC 229 / CECAD到TH。这项工作由德国卓越战略（EXC 2030 - 390661388和SFB 1218 - Projektnumber 269925409到T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft（DFG）资助，用于德国卓越战略 - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer：269925409 an T.H. gefördert。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Tags

生物学，第171期，
<em>体外</em> E3泛素连接酶功能分析
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter