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Biology

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌 培養などの原核生物系を用いて発現した。

Abstract

ユビキチン(Ub)の共有結合は、基質タンパク質の内部リジン残基(複数可)に、ユビキテリメンテーションと呼ばく、真核生物における翻訳後の最も重要な修飾の1つを表す。ユビキチン活性化酵素(E1酵素)、ユビキチン結合酵素(E2酵素)、ユビキチンリガス(E3酵素)、時にはユビキチン鎖伸長因子(E4酵素)を含む3つの酵素クラスの順次カスケードによって媒介される。ここでは、ユビキチンリガーゼ活性の評価、E2-E3対の連携、および基板選択を可能にする、ユビキタス化アッセイのための インビトロ プロトコルが提供される。協力E2-E3ペアは、E3リガーゼのフリーポリユビキチン鎖および/または自動ユビキトリメンテーションの生成を監視することによってスクリーニングすることができます。基質のユビキタス化は、E3リガーゼの選択的結合によって定義され、 インビトロ 反応のウェスタンブロッティングによって検出することができる。さらに、E2〜Ub排出アッセイが記載されており、機能性E2-E3連携の直接評価に有用なツールである。ここで、ユビキチンのE3依存性転写は、対応するE2酵素からフリーリジンアミノ酸(模倣基質のユビキタス化)またはE3リガーゼ自体の内部リジン(自動ユビキトリメンテーション)に続く。結論として、E3リガーゼ触媒機能に対処するために高速かつ簡単に実行できる3つの異なる in vitro プロトコルが提供されています。

Introduction

Ubiquitylationは、Ubが基質タンパク質1に共有結合するプロセスです。Ub修飾は、3つの異なる酵素クラス、すなわちUb活性化酵素(E1s)、Ub共役酵素(E2s)、Ubリガシュ(E3s)、およびおそらくUb鎖伸長因子(E4s)2、3、4、5の作用を伴う連続した酵素反応によって触媒される。アデノシン三リン酸(ATP)−マグネシウム(Mg2+)依存性E1によるUbの活性化後、E1の活性部位システインはUbのC末端グリシンを攻撃し、チオエステル複合体(Ub〜E1)を形成する。ATP加水分解から引き出されたエネルギーは、Ubが高エネルギー過渡状態を達成し、次の酵素カスケード全体にわたって維持される。次に、E2酵素は活性化されたUbをその内部触媒システインに転移させ、それによって一過性のUb〜E2チオエステル結合を形成する。続いて、Ubは基質タンパク質に移される。

これは 2 つの方法で実行できます。E3リガーゼは、最初にE2に結合するか、またはE3リガーゼが直接Ubを結合することができる。後者の方法は、E3〜Ub中間体の形成をもたらす。いずれの場合も、Ubは、UbのC末端カルボキシル基と基質のリジンƐ-アミノ基の間にイソペプチド結合を形成することにより基質タンパク質に連結される。ヒトゲノムは、2つのE1、約40 E2、および600以上の推定ユビキチンリガーゼ7をコードする。E3のUb転送機構に基づいて、Ubリガーゼは相同からE6APC末語(HECT)型、本当に興味深い新遺伝子(RING)/Uボックス型、およびリング間のリング(RBR)型リガス8を含む3つのカテゴリに分かれています。本研究では、HSC70相互作用タンパク質のリガーゼ、カルボキシル末テルミナス(CHIP)を含むUボックスを、代表的なE3酵素として用いる。UB〜E3チオエステルを形成するHECT型E3型酵素とは対照的に、CHIPのUボックスドメインはE2〜Ubに結合し、E2酵素8,9から直接Ub/基質転移を促進する。酵素機能のUボックスの重要性に基づいて、非アクティブなCHIP Uボックス変異体CHIP(H260Q)をコントロールとして利用します。CHIP(H260Q) は、その同質E2sに結合できないため、E3リガーゼ活動10を失う。

タンパク質のユビキタス化は、真核細胞の細胞イベントの多数を調節する上で重要な役割を果たしています。Ub分子の基質タンパク質への可逆的な結合によって促進される細胞の結果の多様性は、Ubの分子特性に起因する可能性がある。Ub自体は、さらにユビキタス化のための7つのリジン(K)残基を含むので、異なるサイズおよび/またはトポロジー11を有するUbチェーンタイプの豊富な多様性がある。例えば、基質は、1つのUb分子(モノユビキタンション)または複数のリジン(マルチモノユビキタン化)、さらにはUb鎖(ポリユビキティメンテーション)11で修飾することができる。Ub鎖は、Ubの同じまたは異なるリジン残基を介してホモまたはヘテロタイプのいずれかであり、分岐されたUb鎖9を生じる可能性さえある。したがって、タンパク質のユビキタス化は、特定の情報を提供するUb分子の多様な配置、例えば、共役タンパク質12、13の分解、活性化、または局在化に対して導く。これらの異なるUb信号は、変化する環境ニーズに対応する細胞の能力のための重要な要件である細胞シグナル伝達経路の迅速な再プログラミングを可能にします。

ユビキタス化の中心的な側面は、タンパク質の品質管理に関連しています。誤って折り畳まれたか、または不可逆的に損傷を受けたタンパク質は、タンパク質ホメオスタシスまたはプロテオスタシス14を維持するために、新たに合成されたタンパク質に分解して置き換える必要があります。品質管理E3リガーゼ、CHIPは、損傷したタンパク質9、15、16、17のUb依存分解における分子シャペロンと協力する。それとは別に、CHIPは、筋肉機能と最適レベルからの逸脱がヒトミオパシー18、19、20、21につながるミオシン指向シャペロン、UNC-45B(Unc-45ホモログB)の安定性を調節する。26SプロテアソームによるUNC-45Bの分解は、K48結合ポリユーバ鎖9の付着によって媒介される。基質タンパク質の存在しない場合、CHIPは、リング/UボックスE3ユビキチンリガス24、25の特徴であるオートユビキトリエーション10、22、23を行い、リガーゼ活性26を調節すると考えられる。本論文に記載されたインビトロのユビキタス化アッセイ法の適用は、CHIPと提携するE2酵素を体系的に同定し、CHIPの自由なポリユーブ鎖および/またはオートユビキトリスの形成を促進するのに役立った(プロトコルセクション2)。さらに、チップ依存性UNC-45Bのユビキタス化が認められ、これはE3リガーゼ18、19(プロトコルセクション3)の既知の基質である。最終的に、Ub〜E2チオスターからの活性化されたUbのCHIP依存的な転送を監視した(プロトコルセクション4)。

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Protocol

1. バッファーおよび試薬の調製

注:実験室で手動で調製したバッファーと試薬は以下のとおりです。プロトコルで使用される他のすべてのバッファーおよび試薬は、異なるソースから購入し、メーカーの指示に従って使用されました。

  1. 10倍のリン酸緩衝生理食塩分(10x PBS)を準備します。この目的のために、1.37 M塩化ナトリウム(NaCl)、27 mM塩化カリウム(KCl)、80mMの二ナトリウム-リン酸二水和物(Na2HPO4.2H2O)、20mMのリン酸カリウム二水素(KH2PO4)を1Lに2倍蒸留したH2O(dH2 O)を混合します。10x PBSをオートクレーブし、ddH2Oで1x PBS溶液を調製した。
    1. オートクレーブ処理は121°Cおよび98.9 kPaで15分間行われる。
      注:オートクレーブ処理は、すべてのバッファとソリューションに対してこれらの条件下で行われます。特に指示しない場合、溶液は室温(RT)で保存されます。
  2. 1X PBSの1 Lに0.1%ツイーンを加えて、PBS-Tween(PBS-T)溶液を1 L調製する。
  3. 0.5 M L-リジンストック溶液の10 mLを、DdH2O. アリコート L-リジン中に溶解して 1 mL の部分で調製し、さらに使用するまで -20 °C で保管します。
    注:L-リジンは凍結し、繰り返し解凍することができます。
  4. EDTAを200mLのddH2Oで溶解して0.25Mエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液を調製します。
    1. 水酸化ナトリウム (NaOH) で pH を 8.0 に調整します。
    2. ddH 2 Oで音量を250mLに調整します。
    3. ソリューションをオートクレーブします。
  5. 200 μL アリコートで-20 °Cで BSA を ddH2O. ストアに溶解して、20 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) 溶液の 10 mL を調製します。
    注:BSAは凍結し、繰り返し解凍することができます。
  6. 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の1 Lを溶解して、50 mM MES、50 mM Trisベース、3.47 mMナトリウムドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および1.03 mM EDTAを0.9 LのddH2Oで調製します。正しく混合した後、音量を1Lに調整します。
    1. 1x バッファの pH は 7.6 です。pHを酸や塩基で調整しないでください。
  7. 10gの粉ミルクを1x PBS-Tに溶解させて、200mLのブロッキング溶液(5%ミルク)を調製します。ブロッキング溶液を4°Cで最長1週間保存してください。
  8. メーカーの指示に従って、転送バッファの1 Lを準備します( 材料表を参照)。
  9. 2x SDSサンプルバッファーを溶解して、125 mM Trisベース、4%SDS、4%グリセロール、0.03%ブロモフェノールブルー、50 μL/mLのβメルカプトエタノールを50 mL ddH2O. アリコートで1 mLで溶解し、使用するまで-20°Cで保存します。

2. インビトロ オートユビエキセイアッセイ

  1. アッセイの準備と実行
    1. タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。オートユビキタンス反応に従って、100 nM E1、1 μM E2、1 μM E3、および50 μM Ubを使用してください。反応の体積をddH2Oで20μLに調整します。
      注:ATPソリューションとユビキタスバッファーは10xストックソリューションとして購入され、1xで使用されました。
    2. すべての反応のためのピペットスキームを準備します。CHIP、(II)を触媒的に不活性CHIP(H260Q)変異体、(III)個々のユビキタス反応でCHIPを使用せずに機能する能力について、9種類のE2酵素をテストします。
    3. ピペットのエラーを避けるために、すべての反応に必要なボリュームと1つの余分な反応を含む氷の上にマスターミックスを準備します。反応ごとに必要なマスターミックスの量を計算します。
      注:マスターミックス成分は、各反応に等しく必要とされる試薬、 すなわち、E1、E3、Ub、ATP、およびユビキタス化バッファーです。
    4. ddH2Oとマスターミックスをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに加えます。チューブを氷の上に置いておきなさい。
    5. E2酵素を添加してユビキタス化反応を開始する前に、PCRサーマルサイクラーを設定し、次のプログラムを使用します: 2 h, 37 °C, 無限に 4 °C.
    6. 各チューブにE2酵素1μMを加え、サンプルをPCRサーマルサイクラーにインキュベートします。
    7. 2時間後、各反応にSDSサンプルバッファーを加え、上下に数回ピペットして混合します。
      注: サンプル バッファーの必要なボリュームは、サンプル バッファーのストックの濃度によって異なります。ここでは、2倍のSDSサンプルバッファーの20μLを各反応に添加した。
    8. サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を続けます。変性タンパク質を-20°Cで保存します。
  2. ゲル電気泳動とウェスタンブロット
    1. 解凍後、サンプルを約10 s回転させ、SDS-PAGEゲルをロードします。サイズ参照としてタンパク質ラダーを使用します。
      注:ここでは、4-12%のビストリス勾配ゲルと3μLのタンパク質ラダーが使用されました。サンプルの体積を分け、各サンプルの20 μLを使用して2つのゲルを均等にロードします。
    2. サンプルの前面がゲルの底部に到達するように、ゲルを約30〜45分間、160-200 Vでゲルを実行します。
    3. 各ゲルをセミドリーブロッティングバッファーで満たされたプラスチック容器に移し、RTで2〜5分間インキュベートします。
    4. SDSゲルあたり2枚のゲルサイズのブロッティングペーパーとゲルサイズのニトロセルロース膜を準備し、セミドリーブロッティングバッファーにプレソーキングします。ウェスタンブロット(WB)サンドイッチを下から上にWBチャンバーに組み立てます:ブロッティングペーパー、ニトロセルロース膜、SDS-PAGEゲル、ブロッティングペーパー。
    5. サンドイッチ層の間に閉じ込められた可能性のある気泡を取り除く。この目的のために、慎重にサンドイッチを数回ロールオーバーするローラーを使用しています。
    6. チャンバーを閉じ、余分なブロットバッファーを排出します。
    7. チャンバーをそれぞれのブロッティング装置に入れ、セミドライブロッティング用に次のプログラムを使用します:25 V、1.0 A、30分。
    8. ブロット膜をブロッキング溶液で満たされたプラスチック容器に移し、RTで30分間インキュベートします。
    9. ブロッキング試薬を含むPBS-Tの10mLに抗体を添加して一次抗体溶液を調製する( 材料表参照)。
      注:抗体の働き濃度は抗体特異的です。この場合、モノクローナルマウス抗ユビキチン抗体を1:5,000の希釈で使用した。第2のゲルについては、PBS-T/ブロッキング試薬においてモノクローナルウサギ抗CHIP抗体を1:5,000に使用した。
    10. ブロッキング溶液を一次抗体溶液に交換し、ロッカー上で4°Cで一晩インキュベートします。
    11. PBS-Tで10分間、膜を3回洗浄します。
    12. 各抗体をPBS-Tの10mLに添加して二次抗体溶液を調製した。
      注:ここでは、ヤギの抗マウスおよびマウス抗ウサギ抗体は、1:10,000の希釈で使用されます。
    13. ロッカーのRTで1時間二次抗体で膜をインキュベートします。
    14. 膜をPBS-Tで5分間3回洗浄します。
  3. データ分析
    1. 西洋のブロト検出試薬を、製造者の指示に従って洗浄膜に対して、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役抗体用の試薬を加え、X線フィルムまたは電荷結合デバイスカメラを用いてHRP信号を捕捉する(図1)。

3. インビトロ 基板のユビキタス化アッセイ

  1. アッセイの準備と実行
    1. タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。基板のユビキタス化反応ごとに、100 nM E1、1 μM E2、1 μM E3、1 μM基材、および50 μM Ubを使用します。1xで10x ATP溶液と10xユビキタスバッファーを使用してください。基板のユビキタス化反応の体積をddH2Oで20 μLに調整します。
    2. すべての反応のためのピペットスキームを準備します。基質のユビキタス性がE3特異的であることを検証する適切な制御反応を含む。タンパク質UNC-45BをCHIPの代表基質として用い、触媒的に不活性なCHIP変異体(H260Q)をコントロールとして使用する。以下の反応を準備する:E1、E2、Ubミックス(Ub、ATP、ユビキタスバッファーを含む)。E1、E2、Ubミックス、UNC-45B;E1、E2、Ubミックス、チップ(H260Q)、UNC-45B;およびE1、E2、Ubミックス、チップ、UNC-45B。
    3. ピペットのエラーを避けるために、すべての反応に必要なボリュームと1つの余分な反応を含む氷の上にマスターミックスを準備します。反応ごとに必要なマスターミックスの体積を計算します。
      注:このアッセイのマスターミックスコンポーネントには、E1、E2、Ub、ATP、およびユビキタスバッファーが含まれます。
    4. 反応成分を次の順序で加える:ddH2O、基質、E3リガーゼ。
    5. マスターミックスを添加してユビキタス化反応を開始する前に、PCRサーマルサイクラーを設定し、次のプログラムを使用して:2時間、37°C、続いて4°C、無限に。
    6. 各チューブにマスターミックスを加え、サンプルをPCRサーマルサイクラーに指定された期間インキュベートします。
    7. 2時間後、各反応に2倍のSDSサンプルバッファーを加え、上下に数回ピペットして混合します。
    8. 実行後、サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、PAGEを続けます。あるいは、変性タンパク質を-20°Cで保存する。
  2. ゲル電気泳動とウェスタンブロット
    1. セクション2.2に記載されているようにゲル電気泳動およびウェスタンブロットを行う。基質およびE3リガーゼの検出に特異的な抗体をそれぞれ使用する。
      注:ここでは 、C-myc 遺伝子産物由来のポリペプチドタンパク質タグにUNC-45Bが融合し、モノクローナルマウス抗MYC抗体の使用を可能にする。抗MYCは1:10,000で使用されます。
  3. データ分析
    1. セクション 2.3 (図 2) の説明に従ってデータ分析を実行します。

4. リジン放電アッセイ

  1. アッセイの準備と実行
    1. E1によるUbによるE2酵素の充電
      1. タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。1回の充電反応で、2 μM E1、4 μM E2、4 μM リジンフリーユビキチン(Ub K0)を使用してください。1x で 10x ATP および 10x ユビキタス バッファーを使用します。充電反応の音量をddH20で20μLに調整します。
        注:リジンフリーUb K0変異体は、モノユビキティレートE2の排他的な生産を強制するために使用されます。野生型Ubも使用できます。しかし、これは、分析が難しい多様なE2〜Ub修飾(例えば、E2のポリユビティメンテーション)につながる可能性があります。初めて使用する場合、または新しいE2酵素を使用する場合は、E1で達成できるE2上のUb充電のレベルを決定します。充電の歩留まりを決定するには、クーマシー染色を介して充電されていないE2と充電されていないE2を視覚化します。ここでは、UBE2D2とUb K0の等モル比を使用する場合、Ub K0の約半分を確実にUBE2D2〜Ubに変換した(補足図S2A)。
      2. 充電反応のためのピペット処理スキームを準備します。充填反応の体積を、その後選択した放電反応に合わせて調整します( 例えば、個々の放電反応でCHIPとCHIP(H260Q)を使用します。これにより、1回の充電反応の2倍の体積を調製する。
        注:初めての使用のために、最適な排出条件を監視するために選択したE3リガーゼの異なる濃度をテストし、ウェスタンブロッティングでそれらを分析します。理想的な条件では、E2からのUbの放電は、それぞれのE2〜Ubタンパク質バンドが消失するまで時間の経過とともに増加します。
      3. 37°Cで15分間の充電反応をインキュベートします。
    2. 充電反応の終了
      1. 最終濃度1.8 U/mLでアピローゼを添加して充電反応を停止します。RTで5分間アピラーゼでインキュベーションを行い、その後、30mMの最終濃度でEDTAを添加します。充電反応の音量をddH2Oで30μLに調整します。
        注:アピラーゼは、ATP分子をADP(アデノシン二リン酸)分子に変換するために使用されます。E1酵素の活性はATP依存性であるため、E1はもはやE2を充電できない。EDTAは、E1に必要な共因子であるMg2+イオンをクエンチすることによってE1が阻害されることを確実にするためにさらに使用されます。反応を停止するために必要なアピラーゼの体積は、アッセイ条件によって異なる場合があります。アピローゼだけでも既に利用可能なATP分子を消光しているが、アピローゼとEDTAの組み合わせは、E1-UBE2D2対の充電反応を止めるのにより効果的であった。反応を停止することは、アッセイ再現性の重要な因子であるため、効率的な停止は、新しいE1-E2ペアのためにテストする必要があります。この目的のために、充電反応を設定し、それを停止し、特定の時点でサンプルを収集します(例えば、2、5、10、15分後)。E2〜Ubの不変レベルは、反応が停止し、その期間中にチオエステルが安定したことを示す(補足図S2B)。
    3. E2~Ub の E3 による放電
      1. 異なる時間ポイント(t0、t 1、t 2、t 3)に対応する4つのチューブを準備します。 非還元サンプルバッファー(4xリチウムドデシル硫酸(LDS)バッファーの 6.7 μL)を各チューブに加えます。
        注: サンプル バッファーでリミッシング 剤を使用しないでください。
      2. t0の停止した充電反応から6μLを取り出し、ddH2Oで20μLに調整します。
      3. t0 サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。
        注意:チオエステルがより高い温度で不安定であるようにインキュベーション時間を延長することによってサンプルを沸騰させないでください。
      4. 放電反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。充電したE2の残りの24 μLを使用し、10 mM L-リジン、1 mg/ml BSA、およびE3リガーゼの500 nMを加えます。1xでユビキタスバッファーを使用し、ddH2Oで80 μLに音量を調整します。
      5. すべての放電反応のためのピペッティングスキームを準備し、CHIP(WT)に加えて制御としてCHIP(H260Q)を使用します。
      6. ddH2 O、ユビキタスバッファー、BSA、リジン、E3リガーゼ、および荷電E2を次の順序で添加して氷上で放電反応を設定し、反応を開始します。
      7. RTで放電反応をインキュベートする。
      8. 20 μLの排出反応を各サンプルチューブに移して、5、30、60分後にサンプルを採取します。
        注:放電の適切な監視を可能にする適切なタイムポイントは、E2-E3ペア間で異なる場合があります。
      9. すぐに試料をボルテックスし、70°Cで10分間インキュベートする。
      10. 直接 PAGE を続行します。
        注:E2〜Ubチオエステルは、サンプルバッファーで変性した後でも不安定なことができます。したがって、ゲル電気泳動は、アッセイ実行後に直接行われるべきである。
  2. ゲル電気泳動とウェスタンブロット
    1. ゲル電気泳動とウェスタンブロッティングをセクション2.2に記載されているように行います。Ub特異的抗体を使用し、可能であれば、別の種で育てられたE3特異的抗体も使用し、UbとE3リガーゼシグナルを同時に検出できるようにします。
  3. データ分析
    1. セクション 2.3 (図 3) で説明したデータ分析を実行します。

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Representative Results

ユビキチンリガーゼCHIPと連携するE2酵素を同定するために、一連のE2候補を個々の インビトロ ユビキトリス反応で試験した。E2-E3ペアの協力は、E3依存性のユビキタス化製品、 すなわちE3リガーゼの自動ユビキタス化および自由なUbポリマーの形成によって監視された。ユビキタス製品は、ウェスタンブロッティングによって分析された。データ解釈は、得られたタンパク質バンドと分子量マーカーのサイズ比較に基づいています。タンパク質のユビキタス化は、ダブルバンドまたは複数の反復バンドの出現を特徴とする特定のバンドパターンの形成につながり、それぞれサイズ差が8.6kDa(単一Ub分子の大きさ)を有する。

ここでは、9つのE2sがユビキタス製品の形成を促進する能力を、野生型CHIP(図1A)、非アクティブなUボックス変異型CHIP(H260Q)(図1B)、またはCHIPなし(補足図S1)の存在下で試験した。E3非依存性ユビキチン製品は、非アクティブCHIPの存在下で、かつCHIPが存在しない状態で形成された(図1B および 補足図S1)。非アクティブな CHIP は、自動ユビティキテレートされていません (図 1B)。これに対し、野生型CHIPは、UBE2Dファミリー(D1-D3)のメンバーとUBE2Eファミリー(E1、E3)のメンバーと組み合わせるとオートユビティ化した(図1A、レーン3、4、5)。UBE2D1-3と協力してフリーポリ-Ubチェーンを製造したのに対し、UBE2E1またはUBE2E3では、それぞれ検出されなかった(図1A、レーン6、7)。

UBE2Dファミリーが、遊離型Ubポリマーの形成とCHIPの自動ユビキタス性の両方を促進する能力は、E227,28の裏側に非共有ユビキチン結合部位が存在することに起因している。同様に、UBE2N/V1による遊離型Ub鎖の排他的な形成(図1A、レーン9)は、特定のUBE2V1サブユニット(Uevサブユニット)によるUbの結合に起因し、K63連結型Ub鎖29の形成を指示している。UBE2C1およびUBE2H(図1A、レーン2および8)の存在下では、ユビキタス製品は形成されなかった。結論として、CHIPはインビトロのいくつかのE2酵素と協力することができます。しかし、その自己ユビキタス化はE2酵素特異的である。

次に、UBE2D2-CHIPペアを使用して、チップリガーゼ活性によるミオシン指向シャペロンUNC-45Bのユビキタス化を調査した(図2)。基板のユビキタス化は、ウェスタンブロッティングを介して分析した。非ユビキュニティ化UNC-45Bは、分子量が103kDa(図2、レーン4)である。CHIPの非アクティブなUボックス変異体は、UNC-45Bのユビキタス化もオートユビキティ化も行っていません(図2、レーン3)。対照的に、野生型CHIP(図2、レーン6)を用いたインキュベーション時に、UNC-45Bのユビキタス化とCHIPの自動ユビキタス化が検出された。したがって、CHIPは 、インビトロでUNC-45Bを普遍化することができ、UNC-45BがCHIP18の保存基板であることを示唆している。

最終的に、CHIPの触媒活性を、基質タンパク質の存在しない状態で分析した。この目的のために、E3基質の存在しない場合に遊離リジンアミノ酸がUbアクセプターとして機能するリジン排出アッセイを行った(図3、補足図S2C)。排出アッセイは、E1によってUbがE2にロードされる充電ステップ、UbのE2へのさらなるローディングを防ぐ停止ステップ、および一過性のUb〜E2チオエステルからE3リガーゼのフリーリジンアミノ酸および/または上のリジン残基にUbが移る排出ステップで構成されています。ウェスタンブロット分析を行い、Ub修飾タンパク質とE3リガーゼCHIPの両方を可視化した。この電荷のないUBE2D2酵素は、分子量17kDa(補足図S2C)を有する。

リジンフリーUb(Ub K0)-UBE2D2〜Ubの分子量を使用して保証された単一のUb分子で荷電すると、約26kDaに上方にシフトします。タイム ポイント 0 (t0)は、充電 E2 の全体的な歩留まりを表します (図 3)。非アクティブCHIP(35 kDa)の存在下で、UBE2D230,31の微弱なE3リガーゼ非依存放電が検出されたが、チップの自動ユビキタス化は検出されなかった。これに対し、野生型CHIP(35kDa)の存在下で、UBE2D2のより速い放電が検出され、60分以内に完全な放電が生じる。同時に、CHIPの自動ユビキタス化が観察され、CHIPがUbを自身のリジン残基に移すことを促進したことを示す。

Figure 1
図1:E2-E3酵素の協調性に対するウェスタンブロット解析異なるヒトE2酵素(左から右へ:空、UBE2-D1、-D2、-D3、-E1、-E3、-H、-N/V1)を使用して、野生型CHIPまたは(B)非アクティブCHIP Uボックス変異体、CHIP(H260Q))を使用して、異なるヒトE2酵素を用いたインビトロオートユビキタンション反応を行った。サンプルを均等に分割し、別々のポリアクリルアミドゲルで実行し、抗CHIPおよび抗Ub抗体を免疫ブロットして反応生成物を可視化した。略語: Ub = ユビキチン;CHIP = HSC70相互作用タンパク質のカルボキシル末分;ATP = アデノシン三リン酸.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ウェスタンブロット分析モニタリング基板のユビキタス化IN Vitro 基質のユビキタス化反応は、CHIP野生型または非アクティブCHIP Uボックス変異体CHIP(H260Q)によるヒトUNC-45Bのユビキタス化を検出するために示されたとおりに行われた。ヒトUBE2D2をE2酵素として使用した。略語: WT = 野生型;Ub = ユビキチン;CHIP =HSC70相互作用タンパク質のカルボキシル末分 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:UBE2D2~Ubチオエステルからのチップ依存性Ub転送をモニタリングするウェスタンブロット分析 リジンフリーUb(Ub K0)によるヒトUBE2D2の充電は、充電反応の停止、及びUBE2D2〜Ubの放電を記載した通りに行った。放電反応については、野生型CHIPまたは非アクティブCHIP Uボックス変異体CHIP(H260Q)をユビキチンリガシュとして使用し、10mM L-リジンを潜在的なUbアクセプターとして供給した。サンプルは、示された期間の後に収集し、ポリアクリルアミドゲル上で実行し、抗Ub/抗CHIP抗体混合物で免疫ブロットを行った。略語: Ub = ユビキチン;CHIP = HSC70相互作用タンパク質のカルボキシル末分;ATP = アデノシン三リン酸. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:E3がない場合のE2酵素活性をモニタリングする代表的なウェスタンブロット。異なるヒトE2酵素(左から空、UBE2-D1、-D2、-D3、-E1、-E3、-H、-N/V1)を用いた インビトロ 普遍性反応を、E3非依存反応生成物をスクリーニングするE3リガーゼの不在中に示されるように行った。サンプルはポリアクリルアミドゲルで実行し、抗Ubで免疫ブロッティングした。略語: Ub = ユビキチン;ATP = アデノシン三リン酸. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:UBE2D2〜Ub K0チオスターの充電収率と安定性の分析。(A)E1により達成されたUBE2D2充電の収量を様々な条件下で試験した。最初の充電反応(I)は、5 μM E1、5 μM E2、および 50 μM Ub K0 で構成されていました。2回目の充電反応(II)は、2 μM E1、4 μM E2、および4 μM Ub K0で構成されています。この充電反応は、37°Cで30分間記載した通りに行った。 サンプルを15分後および30分後に採取した。反応を4x LDSサンプルバッファーの添加により停止し、ゲル電気泳動およびクマシー染色の前に10分間70°Cでインキュベートした。未充電の UBE2D2 が制御として使用されました。UBE2D2の約半分がUBE2D2〜Ubに変換されました。15 分後に追加の充電は検出されませんでした。また、E1の増加も遊離ユビキチンの増加も、UBE2D2〜Ubの充電収率を変化させられなかった。これにより、2 μM E1、4 μM E2、および4 μM Ub K0を使用して、37 °Cで15分間充電を行いました。(B)充電後、1.8 U/mLアピラと30mMEDTAを添加して反応を停止し、RTでインキュベートしたサンプルを2、5、8、10、15分後(レーン2~6)で回収し、未充電のUBE2D2を制御(レーン1)として使用した。4x LDSサンプルバッファーを加え、70°Cで試料をインキュベートし、ゲル電気泳動およびクマシー染色の前に10分間培養した。停止は、UBE2D2〜Ubタンパク質の一定バンド強度によって測定した場合に効率的であり、また、示された期間中にチオエステルが安定したことを示す。(C)リジンフリーUb(Ub K0)によるヒトUBE2D2の充電、充電反応の停止、及びUBE2D2〜Ubの放電を記載した通りに行った。放電反応では、野生型CHIPまたは非アクティブCHIP Uボックス変異体、CHIP(H260Q)をユビキチンリガーゼとして使用し、10 mM L-リジンを潜在的なUbアクセプターとして供給した。サンプルは、示された期間後に収集し、別個のポリアクリルアミドゲルで実行し、そしてクマシー染色した。このファイルをダウンロードするこちらをクリックしてください。

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Discussion

本論文では、E3リガーゼ機能の解析に関するイン ビトロ のユビキタス化法の基礎について述べている。 インビトロ のユビキタス化アッセイを行う場合、一部のE2酵素は、活性部位30に近接して位置する自身のリジン残基に対する活性システインの攻撃に起因して、自己ユビキタス化を行うことができるものもあると考えるべきである。この問題を回避するために、E2変異体の使用は、それぞれのリジン残基がアルギニンと交換される、オートユビキトリメンテーション32に耐性のある触媒活性E2酵素をもたらすことを推奨する。これは、リジン放電アッセイを介してUb転送を監視し、アッセイの再現性を確保する際に特に重要です。もう一つの重要な要因は、E2〜Ubチオスター結合の一過性の性質である。チオスター安定性が インビトロ 用途で可能な限り限界を有する場合、E2の活性システイン残基をセリンと交換して、より安定なE2〜Ubオキシエステル33を生成することができる。初めて使用する場合、または新しいE2酵素を使用する場合は、E1で達成できるE2上のUb充電のレベルを決定します。充電効率は、E1の種起源、充電反応の温度、およびUb対E2のモル比を含むいくつかの要因によって影響を受ける可能性があります。充電の歩留まりを確認するには、充電されていない vsを視覚化します。クマシー染色を介して充電E2。

全体として、これらの潜在的な制限は、E2-E3対、E2の充電および放出性の運動、組換えタンパク質のモルラリティおよび活性、特にリジン排出アッセイの実験的最適化の重要性を強調し、再現可能な結果を得る。 Ubの基質タンパク質への共有結合の多様な細胞機能を考えると、タンパク質のユビキタス化の分析は一般的な研究分野です。しかし、ユビキタス化イベントの分析は、特にvivoでは困難な場合があります。この難しさは、E3基板相互作用34の過渡的性質、多くのE3リガスの冗長性、ならびにいくつかの基質35に対するE3リガスの無差別性を含む複数の要因から生じる。さらに、インビボにおける特定のユビキトリエーションイベントの特性評価は、ユビキチン鎖トポロジ36を調節するユビキチン鎖伸び因子およびデュビエキテレン化酵素などの付加的な寄与因子の存在によって妨げられる。これらの制約は、定義された組換え系におけるE3ユビキチンリガスの酵素活動を特徴付ける堅牢なインビトロ技術の重要性を強調している。

記載の用途とは別に、インビトロのユビキタス化アッセイは、リンケージ型特異的抗体を用いてUb-リンケージ型を検出するためにも使用できる。さらに詳細なアプローチとして、Ub修飾基質のそれぞれのタンパク質バンドをポリアクリルアミドゲルから抽出し、質量分析を介して分析することができます。リンケージ型の同定は、E3-基質相互作用の生理学的役割の理解をサポートし、疾患関連の基質分解経路37,38の特性化にとって特に重要である。同様に、リジン放電アッセイは、E3ユビキチンリガーゼまたはE3リガーゼファミリー30との間の触媒的な違いを解明するための有効なツールとして使用することができる。結論として、本明細書に記載のインビトロユビキタス化法は、E3リガーゼ機能の異なる側面を分析するための効果的なツールである。記載された方法の比較的単純な実行に加えて、すべての真核生物源からのタンパク質が組み換え発現され、特別な装置を必要とせずにインビトロで研究することができるので、一般的な適用可能性が大きな利点である。

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Disclosures

著者には利益相反はありません。

Acknowledgments

私たちは、重要な議論と原稿に関する有益なアドバイスのために私たちの研究室のメンバーに感謝します。サイズ制限により貴重な貢献を挙げたもので、お詫び申し上げます。この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)-SFB 1218 - プロジェクトン番号269925409とクラスター・オブ・エクセレンスEXC 229/ CECADからTHに支援されています。この作品は、ドイツの卓越性戦略の下でドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました - EXC 2030 - 390661388と - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H. ディース・アルベート・ヴルデ・フォン・デア・ドイセン・フォルシュンスゲマイインシャフト (DFG) イム・ラーメン・デア・ドイメン・エキゼレンツラティー - EXC 2030 - 390661388ウント - SFB 1218 - プロジェクトヌマー: 269925409 T.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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生物学,171号
<em>イン・ヴィトロ</em> E3ユビキチンリガーゼ関数の解析
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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