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Biology

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

Abstract

A ligação covalente da ubiquitina (Ub) com resíduos de lisemina interna de uma proteína substrato, um processo denominado ubiquidade, representa uma das modificações pós-translacionais mais importantes em organismos eucarióticos. A ubiquização é mediada por uma cascata sequencial de três classes enzimes, incluindo enzimas ativadoras de ubiquitina (enzimas E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (enzimas E2) e ligaduras de ubiquitina (enzimas E3), e às vezes, fatores de alongamento da cadeia de ubiquitina (enzimas E4). Aqui, são fornecidos protocolos in vitro para ensaios de ubiquização, que permitem a avaliação da atividade ligase de ubiquitina E3, a cooperação entre pares E2-E3 e seleção de substratos. Os pares E2-E3 cooperantes podem ser rastreados monitorando a geração de cadeias gratuitas de poli-ubiquínea e/ou auto-ubiquização da ligase E3. A ubiquização do substrato é definida por ligação seletiva da liga ligase E3 e pode ser detectada por manchas ocidentais da reação in vitro. Além disso, é descrito um ensaio de descarga E2~Ub, que é uma ferramenta útil para a avaliação direta da cooperação funcional do E2-E3. Aqui, a transferência de ubiqutina dependente do E3 é seguida da enzima E2 correspondente para aminoácidos de lisina livre (imitando ubiquidades substratos) ou lisinas internas da própria Ligase E3 (auto-ubiquização). Em conclusão, são fornecidos três protocolos in vitro diferentes que são rápidos e fáceis de executar para abordar a funcionalidade catalítica do E3 ligase.

Introduction

A ubiquização é o processo pelo qual a Ub está covalentemente ligada a uma proteína substrato1. A modificação da Ub é catalisada por sucessivas reações enzimáticas envolvendo a ação de três classes enzimáticas diferentes, ou seja,e ., enzimas ativantes de Ub (E1s), enzimas ub-conjugadoras (E2s), ligaduras ub (E3s) e possivelmente fatores de alongamento da cadeia Ub (E4s)2,3,4,5. Após a adenosina triphosfato (ATP)- e a ativação dependente de magnésio (Mg2+)-dependent da Ub by E1, o local ativo cisteína do E1 ataca a glicecina terminal C da Ub, formando um complexo de tioéster (Ub~E1). A energia extraída da hidrólise ATP faz com que o Ub atinja um estado de transição de alta energia, que é mantido em toda a seguinte cascata enzimávia. Em seguida, a enzima E2 transfere a Ub ativada para sua cisteína catalítica interna, formando assim um vínculo de tiaester Ub~E2 transitório. Posteriormente, Ub é transferido para a proteína do substrato.

Isso pode ser feito de duas maneiras. Ou a ligadura E3 pode primeiro ligar-se ao E2, ou a liga ligase E3 pode ligar diretamente ub. Esta última forma resulta na formação de um intermediário E3~Ub. Em ambos os casos, a Ub está ligada à proteína do substrato por formação de vínculo isopeptida entre o grupo carboxíl terminal C da Ub e o grupo lysine Ɛ-amino do substrato6. O genoma humano codifica dois E1s, aproximadamente 40 E2s, e mais de 600 ligaduras putativas de ubiquitina7. Com base no mecanismo de transferência ub do E3, as ligases Ub são divididas em três categorias envolvendo ligaduras homologous para E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type, e RING entre ligases tipo RING (RBR)8. Neste estudo, a caixa U contendo ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), é usada como enzima E3 representativa. Em contraste com as enzimas E3 do tipo HECT que formam thioesters Ub~E3, o domínio da caixa U do CHIP liga E2~Ub e promove a transferência subsequente de Ub/substrato diretamente da enzima E28,9. Com base na importância da caixa U para a função enzimática, um mutante de caixa U inativo, CHIP(H260Q), é utilizado como um controle. CHIP(H260Q) não se liga aos seus E2s cognatos, perdendo assim sua atividade de ligadura E310.

A ubiquidade proteica desempenha um papel crucial na regulação de uma infinidade de eventos celulares em células eucarióticas. A diversidade de desfechos celulares que são promovidos pelo apego reversível das moléculas ub às proteínas substratos pode ser atribuída às características moleculares da Ub. Como a própria Ub contém sete resíduos de liseina (K) para posterior ubiquização, há uma rica variedade de tipos de cadeia Ub com diferentes tamanhos e/ou topologias11. Por exemplo, substratos podem ser modificados por uma única molécula Ub em uma (mono-ubiquização) ou lises múltiplas (multi-ubiquidade), e até mesmo por cadeias ub (poli-ubiquização)11. As cadeias ub são formadas homo ou heterotipicamente através dos mesmos ou diferentes resíduos de ub, o que poderia até resultar em cadeias ub ramificadas9. Assim, a ubiquização proteica leva a diversos arranjos de moléculas ub que fornecem informações específicas, por exemplo,para degradação, ativação ou localização de proteínas conjugadas12,13. Esses diferentes sinais ub permitem a reprogramação rápida de vias de sinalização celular, o que é um requisito importante para a capacidade da célula de responder às mudanças nas necessidades ambientais.

Um aspecto central da ubiquização está relacionado ao controle da qualidade da proteína. Proteínas mal dobradas ou irreversivelmente danificadas devem ser degradadas e substituídas por proteínas recém-sintetizadas para manter a homeostase proteica ou proteostase14. O controle de qualidade E3 ligase, CHIP, colabora com acompanhantes moleculares na degradação dependente de Ub de proteínas danificadas9,15,16,17. Além disso, o CHIP regula a estabilidade do acompanhante dirigido por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que é fortemente coordenado com função muscular e desvios dos níveis ideais levam à miopatia humana18,19,20,21. A degradação do UNC-45B pelo proteasome 26S é mediada pelo apego de uma cadeia de9poly-Ub ligada a K48 . Na ausência de proteínas de substrato, o CHIP realiza a auto-ubiquização10,22,23, que é característica das ligaduras de ubiquitina RING/U E324,25 e considerada para regular a atividade ligadura26. A aplicação dos métodos de ensaio de onipresença in vitro descritos neste artigo ajudou a identificar sistematicamente enzimas E2 que se unem ao CHIP para promover a formação de cadeias poli-ub gratuitas e/ou auto-ubiquização do CHIP (seção de protocolo 2). Além disso, observou-se a ubiquização dependente do CHIP da UNC-45B, que é um substrato conhecido da ligadura E318,19 (seção de protocolo 3). Em última análise, a transferência dependente de CHIP de Ub ativado do tioester Ub~E2 foi monitorada (seção de protocolo 4).

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Protocol

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Buffers e reagentes que foram preparados manualmente no laboratório estão listados abaixo. Todos os outros buffers e reagentes utilizados nos protocolos foram comprados de diferentes fontes e utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

  1. Prepare 10x salina tamponada com fosfato (10x PBS). Para isso, misturar 1,37 M de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio de 27 mM (KCl), 80 mM de dihidrato de dissódio-hidrogênio-fosfato (Na2HPO4.2 H2O), e 20 mM de fosfato de potássio-dihidrogênio (KH2PO4) em 1 L de H2O destilado duplo (ddH2O). Autoclave o PBS 10x, e prepare uma solução PBS 1x em ddH2O.
    1. A autoclavagem é realizada por 15 min a 121 °C e 98,9 kPa.
      NOTA: A autoclavagem é realizada nessas condições para todos os buffers e soluções. Se não for indicado de outra forma, as soluções são armazenadas à temperatura ambiente (RT).
  2. Prepare 1 L de solução PBS-Tween (PBS-T) adicionando 0,1% Tween a 1 L de 1x PBS.
  3. Prepare 10 mL de uma solução de estoque de L-lysine de 0,5 M L dissolvendo L-lysine em ddH2O. Aliquot L-lysine em porções de 1 mL, e armazene-as a -20 °C até uso adicional.
    NOTA: A l-lysina pode ser congelada e descongelada repetidamente.
  4. Prepare uma solução de 0,25 M de diamina de diamina tetra actic (EDTA) dissolvendo EDTA em 200 mL de ddH2O.
    1. Ajuste o pH para 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH).
    2. Ajuste o volume para 250 mL com ddH2O.
    3. Autoclave a solução.
  5. Prepare 10 mL de uma solução de albumina de soro bovino de 20 mg/mL (BSA) dissolvendo bsa em ddH2O. Armazene a -20 °C em 200 alíquotas μL.
    NOTA: A BSA pode ser congelada e descongelada repetidamente.
  6. Prepare 1 L de 2-(N-morpholino)ácido sulfônico de etano (MES) dissolvendo 50 mM MES, 50 mM Base Tris, 3,47 mM sulfato de dodecyl de sódio (SDS) e 1,03 mM EDTA em 0,9 L de ddH2O. Depois de misturar corretamente, ajuste o volume para 1 L.
    1. O pH do buffer 1x é 7.6. Não ajuste o pH com ácido ou base.
  7. Prepare 200 mL de solução de bloqueio (5% de leite) dissolvendo 10 g de leite em pó em 1x PBS-T. Armazene a solução de bloqueio a 4 °C por até uma semana.
  8. Prepare 1 L de tampão de transferência (ver a Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante.
  9. Prepare o buffer de amostra SDS 2x dissolvendo a base tris de 125 mM, 4% SDS, 4% glicerol, 0,03% azul bromofenol e 50 μL/mL de β-mercaptoethanol em 50 mL ddH2O. Aliquot em porções de 1 mL, e armazenar a -20 °C até usar.

2. Ensaio de auto-ubiquização in vitro

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de auto-ubiquização, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 e 50 μM Ub. Ajuste o volume da reação para 20 μL com ddH2O.
      NOTA: A solução ATP e o buffer de ubiquização foram comprados como soluções de estoque 10x e usados em 1x.
    2. Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Teste nove enzimas E2 diferentes para sua capacidade de funcionar (I) com CHIP, (II) com um mutante CHIP (H260Q) catalíticomente inativo, e (III) sem CHIP em reações individuais de ubiquização.
    3. Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule a quantidade de mistura mestre necessária por reação.
      NOTA: Os componentes do mix mestre são reagentes igualmente necessários para cada reação, ou seja,., E1, E3, Ub, ATP e tampão de ubiquização.
    4. Adicione ddH2O e misture mestremente aos tubos de reação de corrente de polimerase (PCR). Mantenha os tubos no gelo.
    5. Antes de iniciar as reações de ubiquização adicionando as enzimas E2, configure um ciclo de calor PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.
    6. Adicione 1 μM das enzimas E2 nos respectivos tubos e incubar as amostras no ciclo térmico PCR pelo período de tempo indicado.
    7. Depois de 2h, adicione o buffer de amostra SDS a cada reação e misture por pipetação para cima e para baixo várias vezes.
      NOTA: O volume necessário do buffer amostral depende da concentração de estoque do buffer amostral. Aqui, 20 μL de tampão amostra de SDS 2x foram adicionados a cada reação.
    8. Ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 min, e continue com eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE). Armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Após o descongelamento, gire as amostras por aproximadamente 10 s e carregue o gel SDS-PAGE. Use uma escada de proteína como referência de tamanho.
      NOTA: Aqui, foram utilizados 4-12% géis gradientes Bis-Tris e 3 μL de escada proteica. Divida os volumes amostrais e carregue dois géis igualmente usando 20 μL de cada amostra.
    2. Execute o gel em 160-200 V por aproximadamente 30-45 min para que a frente da amostra atinja a parte inferior do gel.
    3. Transfira cada gel para um recipiente plástico cheio de tampão de manchas semidry e incuba-o por 2-5 min na RT. Remova o gel de empilhamento.
    4. Prepare duas peças de papel de mancha do tamanho de gel e uma membrana de nitrocelulose do tamanho de gel por gel SDS e pré-mergulhe em tampão de manchas semidry. Monte o sanduíche de mancha ocidental (WB) em uma câmara WB de baixo para cima na seguinte ordem: papel manchador, membrana nitrocelulose, gel SDS-PAGE, papel de mancha.
    5. Remova bolhas de ar que podem ter ficado presas entre as camadas do sanduíche. Para isso, use um rolo para rolar cuidadosamente o sanduíche algumas vezes.
    6. Feche a câmara e deixe o excesso de tampão de manchas drenar.
    7. Coloque a câmara no respectivo dispositivo de manchas e utilize o seguinte programa para manchas semidórias: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Transfira a membrana manchada para um recipiente plástico cheio de solução de bloqueio e incuba por 30 minutos na RT.
    9. Prepare a solução de anticorpos primário adicionando o anticorpo a 10 mL de PBS-T contendo um reagente de bloqueio (ver a Tabela de Materiais).
      NOTA: A concentração de trabalho do anticorpo é específica de anticorpos. Neste caso, um anticorpo anti-ubiquitina de camundongo monoclonal foi usado em uma diluição de 1:5.000. Para o segundo gel, um anticorpo anti-CHIP de coelho monoclonal foi usado em 1:5.000 em PBS-T/reagente de bloqueio.
    10. Substitua a solução de bloqueio pela solução de anticorpos primários e incuba durante a noite a 4 °C em um roqueiro.
    11. Lave a membrana três vezes por 10 minutos com PBS-T.
    12. Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando o respectivo anticorpo a 10 mL de PBS-T.
      NOTA: Aqui, anticorpos anti-rato e camundongos são usados em uma diluição de 1:10.000.
    13. Incubar a membrana com o anticorpo secundário por 1 h no RT em um roqueiro.
    14. Lave a membrana três vezes por 5 minutos com PBS-T.
  3. Análise de dados
    1. Adicione reagentes de detecção de manchas ocidentais para anticorpos conjugados por rabanete (HRP) à membrana lavada de acordo com as instruções do fabricante e capture o sinal HRP usando películas de raios-X ou uma câmera de dispositivo acoplada a carga(Figura 1).

3. Ensaio de ubiquização de substrato in vitro

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação, com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de ubiquização substrato, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrato e 50 μM Ub. Use solução ATP 10x e tampão de ubiquização de 10x em 1x. Ajuste o volume da reação de ubiquização do substrato para 20 μL com ddH2O.
    2. Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Inclua reações de controle adequadas verificando se a ubiquização do substrato é específica do E3. Use a proteína UNC-45B como um substrato representativo do CHIP e um mutante CHIP cataticamente inativo (H260Q) como controle. Preparar as seguintes reações: E1, E2, Ub mix (incluindo Ub, ATP, tampão de ubiquidade); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; e E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule o volume da mistura mestre que é necessária por reação.
      NOTA: Os componentes de mixagem mestre para este ensaio incluem E1, E2, Ub, ATP e tampão de ubiquidade.
    4. Adicione componentes de reação na seguinte ordem: ddH2O, substrato, ligadura E3.
    5. Antes de iniciar a reação de ubiquização por adição do mix mestre, configure um cicloviário térmico PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.
    6. Adicione a mistura mestre a cada tubo e incuba as amostras no ciclo-de-tempo térmico PCR pelo período de tempo indicado.
    7. Depois de 2 h, adicione 2x tampão de amostra SDS a cada reação, e misture por pipetar para cima e para baixo várias vezes.
    8. Após a corrida, ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 minutos e continue com PAGE. Alternativamente, armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Realize eletroforese de gel e mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Utilize anticorpos específicos para a detecção do substrato e da ligadura E3, respectivamente.
      NOTA: Aqui, o UNC-45B é fundido a uma etiqueta de proteína de polipeptídeo derivada do produto genético c-myc que permite o uso de um anticorpo anti-MYC de camundongo monoclonal. O Anti-MYC é usado em 1:10.000.
  3. Análise de dados
    1. Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 2).

4. Ensaio de descarga de lysina

  1. Preparação e execução de ensaios
    1. Carregamento da enzima E2 com Ub by E1
      1. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de carregamento, use 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM sem ubiquitina (Ub K0). Use 10x ATP e 10x ubiquitylation buffer em 1x. Ajuste o volume da reação de carregamento para 20 μL com ddH20.
        NOTA: O mutante Ub K0 semlise semlise é usado para impor a produção exclusiva do E2 mono-ubinciítulado. Ub tipo selvagem também pode ser usado; no entanto, isso pode levar a diversas modificações de E2~Ub (por exemplo,poli-ubiquidade do E2), que são mais difíceis de analisar. Para uso pela primeira vez ou ao usar uma nova enzima E2, determine o nível de carregamento ub no E2 que pode ser alcançado pelo E1. Para determinar o rendimento do carregamento, visualize o E2 não carregado via coloração Coomassie. Aqui, aproximadamente metade do Ub K0 foi convertido de forma confiável para UBE2D2~Ub ao usar relações equimolar de UBE2D2 e Ub K0(Figura Suplementar S2A).
      2. Prepare um esquema de pipetação para a reação de carregamento. Ajuste o volume da reação de carregamento às reações de descarga subsequentes de escolha, por exemplo,use CHIP e CHIP(H260Q) em reações individuais de descarga. Assim, prepare o dobro do volume de uma reação de carregamento.
        NOTA: Para uso pela primeira vez, teste diferentes concentrações da ligadura E3 de escolha para monitorar as condições ideais de descarga e analise-as por manchas ocidentais. Em uma condição ideal, a descarga de Ub a partir de E2 aumentará com o tempo até que a respectiva banda de proteína E2~Ub desapareça.
      3. Incubar a reação de carregamento por 15 min a 37 °C.
    2. Término da reação de cobrança
      1. Pare a reação de carregamento por adição de apyrase em uma concentração final de 1,8 U/mL. Realizar a incubação com apiráse por 5 min na RT, seguido pela adição de EDTA em uma concentração final de 30 mM. Ajuste o volume da reação de carregamento para 30 μL com ddH2O.
        NOTA: A apyrase é usado para converter moléculas DE ATP em moléculas de ADP (difosfato de adenosina). Como a atividade da enzima E1 é dependente de ATP, o E1 não pode mais carregar o E2. O EDTA é adicionalmente usado para garantir que o E1 seja inibido pela extinção de íons Mg2+ que são cofatores necessários para o E1. O volume de apirase necessário para parar a reação pode variar entre as condições de ensaio. Embora a apyrase por si só já sacia as moléculas atp disponíveis, uma combinação de apyrase e EDTA foi mais eficaz em parar a reação de carregamento para o par E1-UBE2D2. Como parar a reação é um fator crítico para a reprodutibilidade do ensaio, uma parada eficiente deve ser testada para novos pares E1-E2. Para isso, configure uma reação de carregamento, pare-a e colete amostras em pontos de tempo específicos, por exemplo,depois de 2, 5, 10 e 15 minutos. Os níveis não alterados de E2~Ub indicam que a reação parou, e que o tioester ficou estável durante esse período de tempo(Figura Suplementar S2B).
    3. Descarregamento de E2~Ub por E3
      1. Prepare quatro tubos correspondentes aos diferentes pontos de tempo (t0, t1, t2, t3); adicionar tampão amostral não redutor (6,7 μL de tampão de sulfato de dodecyl de lítio 4x (LDS) a cada tubo.
        NOTA: Não utilize agente redutor no buffer de amostra.
      2. Remova 6 μL da reação de carregamento parado para t0e ajuste o volume para 20 μL com ddH2O.
      3. Incubar a amostra t0 por 10 min a 70 °C.
        NOTA: Não ferva a amostra estendendo o tempo de incubação, pois os tioestres são labile a temperaturas mais altas.
      4. Calcule o volume de cada reagente necessário por reação de descarga. Utilize os 24 μL restantes do E2 carregado e adicione 10 mM L-lysine, 1 mg/ml BSA e 500 nM da liga ligase E3. Use o tampão de ubiquização em 1x e ajuste o volume para 80 μL com ddH2O.
      5. Prepare um esquema de pipetagem para todas as reações de descarga e use CHIP(H260Q) como controle, além de CHIP(WT).
      6. Configure as reações de descarga no gelo adicionando os componentes necessários na seguinte ordem: ddH2O, tampão de ubiquidade, BSA, lise, ligadura E3 e o E2 carregado para iniciar a reação.
      7. Incubar a reação de descarga na RT.
      8. Pegue amostras após 5, 30 e 60 min transferindo 20 μL da reação de descarga para os respectivos tubos de amostra.
        NOTA: Os pontos de tempo adequados que permitem o monitoramento adequado da descarga podem variar entre os pares E2-E3.
      9. Vórtice a amostra imediatamente, e incuba-la a 70 °C por 10 min.
      10. Prossiga diretamente com page.
        NOTA: Os tiostontes E2~Ub podem ser labile mesmo após a desnaturação no buffer de amostra. Assim, a eletroforese gel deve ser realizada diretamente após a execução do ensaio.
  2. Eletroforese de gel e mancha ocidental
    1. Realize a eletroforese do gel e a mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Use um anticorpo específico ub e, se disponível, também use um anticorpo específico do E3 que foi criado em uma espécie diferente, permitindo a detecção simultânea do sinal ligase Ub e E3.
  3. Análise de dados
    1. Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 3).

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Representative Results

Para identificar enzimas E2 que cooperam com o CHIP ligase ubiquitin, um conjunto de candidatos E2 foi testado em reações individuais de ubiquização in vitro. Os pares E2-E3 cooperantes foram monitorados pela formação de produtos de ubiquização dependentes do E3, ou seja,auto-ubiquidade da ligadura E3 e formação de polímeros Ub livres. Os produtos de ubiquização foram analisados por manchas ocidentais. A interpretação dos dados baseia-se na comparação de tamanho das faixas proteicas resultantes com marcadores de peso molecular. A ubiquização proteica leva à formação de padrões específicos de banda caracterizados pelo aparecimento de bandas duplas ou múltiplas bandas iterativas com uma respectiva diferença de tamanho de 8,6 kDa (tamanho de uma única molécula Ub).

Aqui, a capacidade de nove E2s para promover a formação de produtos de ubiquização foi testada na presença de CHIP tipo selvagem(Figura 1A),o mutante u-box inativo CHIP (H260Q) (Figura 1B), ou sem CHIP(Figura Suplementar S1). Os produtos de ubiquitina independentes da E3 foram formados na presença de CHIP inativo e na ausência de CHIP (Figura 1B e Figura Suplementar S1). CHIP inativo não foi auto-ubiquado(Figura 1B). Em contraste, o CHIP do tipo selvagem foi auto-ubinciílico quando combinado com membros da família UBE2D (D1-D3) e membros da família UBE2E (E1, E3),respectivamente (Figura 1A, faixas 3, 4 e 5). Considerando que as cadeias poli-ub gratuitas foram produzidas em cooperação com ube2D1-3, isso não foi detectado para UBE2E1 ou UBE2E3,respectivamente (Figura 1A, faixas 6 e 7).

A capacidade da família UBE2D de promover tanto a formação de polímeros ub livres quanto a auto-ubiquidade do CHIP foi atribuída à presença de um local de ligação de ubiquitina não covalente na parte traseira do E227,28. Da mesma forma, a formação exclusiva de cadeias ub gratuitas pela UBE2N/V1 (Figura 1A, faixa 9) foi atribuída à vinculação da Ub por uma subunidade UBE2V1 específica (subunidade Uev), direcionando a formação das cadeias ub ligadas a K6329. Nenhum produto de ubiquização foi formado na presença de UBE2C1 e UBE2H (Figura 1A, faixas 2 e 8). Em conclusão, o CHIP pode colaborar com várias enzimas E2 in vitro; no entanto, sua auto-ubiquização é específica da enzima E2.

Em seguida, o par UBE2D2-CHIP foi usado para investigar a ubiquização do acompanhante dirigido por minosina, UNC-45B, por atividade de ligase CHIP(Figura 2). A ubiquização do substrato foi analisada via mancha ocidental. Unc-45B não ubiquativada tem um peso molecular de 103 kDa(Figura 2, pista 4). O mutante inativo u-box do CHIP não realizou ubiquização de UNC-45B nem auto-ubiquidade(Figura 2, pista 3). Em contrapartida, a ubiquização da UNC-45B e a auto-ubiquização do CHIP foram detectadas após a incubação com CHIP tipo selvagem(Figura 2, faixa 6). Assim, o CHIP pode ubiquamento UNC-45B in vitro,sugerindo que o UNC-45B é um substrato conservado de CHIP18.

Em última análise, a atividade catalítica do CHIP foi analisada na ausência de qualquer proteína substrato. Para isso, foi realizado um ensaio de descarga de lisina no qual aminoácidos de lisina livre podem servir como aceitador ub na ausência de substratos E3(Figura 3, Figura Suplementar S2C). O ensaio de descarga consiste em uma etapa de carregamento na qual o Ub é carregado no E2 por E1, um passo de parada para evitar um carregamento adicional de Ub para E2, e uma etapa de descarga onde ub é transferido do tioester Ub~E2 transitório para aminoácidos de lisina livre e/ou para resíduos de lisina da ligase E3. A análise da mancha ocidental foi realizada para visualizar tanto as proteínas Ub-modificadas quanto o CHIP ligase E3. A enzima UBE2D2 não carregada tem um peso molecular de 17 kDa(Figura Suplementar S2C).

Quando carregado com uma única molécula Ub assegurada pelo uso de Ub livre delise (Ub K0)- o peso molecular de UBE2D2~Ub muda para cima para aproximadamente 26 kDa. O ponto de tempo zero (t0) representa o rendimento total do E2 cobrado (Figura 3). Na presença de CHIP inativo (35 kDa), foi detectada uma descarga leve e3 ligase independente de UBE2D230,31, mas nenhuma auto-ubiquização de CHIP. Em contraste, na presença de CHIP tipo selvagem (35 kDa), foi detectada uma descarga mais rápida de UBE2D2, gerando uma descarga completa dentro de 60 min. Simultaneamente, observou-se a auto-ubiquização do CHIP, indicando que o CHIP promoveu a transferência de Ub para seus próprios resíduos de lisesina.

Figure 1
Figura 1: Análise de manchas ocidentais para colaboração enzimada E2-E3 in vitro. Reações in vitro de auto-ubinciamento com diferentes enzimas Humanas E2 (da esquerda para a direita: vazias, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H e -N/V1) foram realizadas como indicado usando(A) chip tipo selvagem ou(B) o mutante de caixa U inativo CHIP, CHIP(H260Q), como E3 ubiquitina. As amostras foram divididas igualmente, executadas em géis de poliacrilamida separados, e imunoblottadas com anticorpos anti-CHIP e anti-Ub para visualizar produtos de reação. Abreviaturas: Ub = ubiquitina; CHIP = carboxíl terminus de proteína de interação HSC70; ATP = triphosfato de adenosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise de manchas ocidentais monitorando a ubiquização do substrato. As reações de ubiquização do substrato in vitro foram realizadas como indicadas para detectar a ubiquização do UNC-45B humano por chip selvagem ou o mutante de caixa U do CHIP inativo, CHIP(H260Q). UBE2D2 humano foi usado como enzima E2. Abreviaturas: WT = tipo selvagem; Ub = ubiquitina; CHIP = carboxíl terminus de proteína de interação HSC70. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise de manchas ocidentais monitorando a transferência de Ub dependente de CHIP do thioester UBE2D2~Ub. O carregamento do UBE2D2 humano por Ub Ub (Ub K0), parada da reação de carregamento e descarregamento de UBE2D2~Ub foi realizado conforme descrito. Para as reações de descarga, chip tipo selvagem ou o mutante inativo chip u-box, CHIP(H260Q), foram usados como ligaduras de ubiquitina e 10 mM L-lysine foi fornecido como o potencial aceitador ub. As amostras foram coletadas após os períodos de tempo indicados, executadas em gel de poliacrilamida e imunoblottadas com uma mistura de anticorpos anti-Ub/anti-CHIP. Abreviaturas: Ub = ubiquitina; CHIP = carboxíl terminus de proteína de interação HSC70; ATP = triphosfato de adenosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Representante ocidental monitorando as atividades enzimadas E2 na ausência de E3. Reações in vitro de ubiquização com diferentes enzimas Humanas E2 (da esquerda para a direita: vazias, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H e -N/V1) foram realizadas como indicado na ausência de um E3 ligase para tela de produtos de reação independentes do E3. As amostras foram executadas em um gel de poliacrilamida e imunoblotted com anti-Ub. Abreviaturas: Ub = ubiquitina; ATP = triphosfato de adenosina. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S2: Análise do rendimento de carregamento e estabilidade do thioester UBE2D2~Ub K0. (A) O rendimento da carga UBE2D2 alcançada pelo E1 foi testado em várias condições. A primeira reação de carregamento (I) consistiu em 5 μM E1, 5 μM E2 e 50 μM Ub K0. A segunda reação de carregamento (II) consistiu em 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM Ub K0. As reações de carregamento foram realizadas conforme descrito por 30 min a 37 °C. As amostras foram coletadas após 15 e 30 min. As reações foram interrompidas pela adição de tampão de amostra 4x LDS e incubadas a 70 °C por 10 minutos antes da eletroforese de gel e coloração coomassie. UBE2D2 não cobrado foi usado como controle. Aproximadamente metade do UBE2D2 foi convertido para UBE2D2~Ub. Nenhuma carga adicional foi detectada após 15 minutos. Além disso, nem o aumento do E1 nem o aumento da ubiquitina livre alteraram o rendimento de carregamento do UBE2D2~Ub. Assim, o carregamento foi posteriormente realizado por 15 min a 37 °C usando 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM Ub K0. (B) Após o carregamento, a reação foi interrompida pela adição de apirase U/mL de 1,8 U/mL e 30 mM EDTA e incubadas na RT. As amostras foram coletadas após 2, 5, 8, 10 e 15 min (pistas 2-6), e uBE2D2 não carregada foi usada como controle (pista 1). Foi adicionado tampão amostral 4x LDS, e as amostras foram incubadas a 70 °C por 10 minutos antes da eletroforese de gel e coloração de Coomassie. A parada foi eficiente medida pela intensidade constante da banda da proteína UBE2D2~Ub, indicando também que o tioester estava estável durante o período de tempo indicado. (C) O carregamento do UBE2D2 humano por Ub isento delise (Ub K0), parando a reação de carregamento e descarregando UBE2D2~Ub foi realizado conforme descrito. Para as reações de descarga, chip tipo selvagem ou o mutante de caixa U inativo CHIP, CHIP(H260Q) foram usados como ligaduras de ubiquitina, e 10 mM L-lysine foi fornecido como o potencial aceitador ub. As amostras foram coletadas após os períodos de tempo indicados, executadas em géis de poliacrilamida separados e corrompidas de Coomassie. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Este artigo descreve métodos básicos de ubiquização in vitro para a análise da função ligase E3. Ao realizar ensaios de onipresençação in vitro, deve-se considerar que algumas enzimas E2 podem realizar auto-ubiquidade devido ao ataque de sua cisteína ativa em seus próprios resíduos de lisesina que estão localizados nas proximidades do local ativo30. Para contornar esse problema, recomenda-se o uso de um mutante E2 no qual o respectivo resíduo de lise é trocado por arginina, o que resulta em uma enzima E2 catalicamente ativa que é resistente à auto-ubiquização32. Isso é de particular importância ao monitorar a transferência de Ub via ensaios de descarga de liseina para garantir a reprodutibilidade do ensaio. Outro fator crítico é a natureza transitória do vínculo thioester E2~Ub. Caso a estabilidade do thioester limite possíveis aplicações in vitro, o resíduo ativo de cisteína do E2 poderia ser trocado por uma serina para gerar um oxisador E2~Ub mais estável33. Para uso pela primeira vez ou ao usar uma nova enzima E2, determine o nível de carregamento ub no E2 que pode ser alcançado pelo E1. A eficiência de carregamento pode ser afetada por vários fatores, incluindo a origem da espécie de E1, a temperatura da reação de carregamento e a razão molar de Ub para E2. Para determinar o rendimento do carregamento, visualize uncharged vs. E2 carregado via coloração Coomassie.

Ao todo, essas possíveis restrições destacam a importância da otimização empírica de condições de ensaio in vitro, como par E2-E3, cinética de carregamento e descarga E2, molaridade e atividade das proteínas recombinantes, especialmente para o ensaio de descarga de lisesina, para obter resultados reprodutíveis. Dadas as diversas funções celulares do apego covalente da Ub às proteínas substratos, a análise da ubiquidade proteica é um campo de pesquisa popular. No entanto, a análise de eventos de ubiquização pode ser difícil, especialmente in vivo. Essa dificuldade decorre de múltiplos fatores, incluindo a natureza transitória da interação substrato E334,redundância de muitas ligases E3, bem como promiscuidade de ligaduras E3 para vários substratos35. Além disso, a caracterização de eventos específicos de onipresençação in vivo é dificultada pela existência de fatores contribuintes adicionais, como fatores de alongamento da cadeia de ubiquidade e enzimas de desumunização que modulam a topologia da cadeia de ubiquína36. Essas restrições ressaltam a importância de técnicas in vitro robustas que ajudam a caracterizar atividades enzimáticas de ligaduras de ubiquitina E3 em um sistema recombinante definido.

Além das aplicações descritas, ensaios de onipresença in vitro também podem ser usados para detectar o tipo Ub-linkage usando anticorpos específicos do tipo linkage. Como uma abordagem adicional mais detalhada, a respectiva faixa proteica do substrato Ub-modificado pode ser extraída do gel de poliacrilamida e analisada através de espectrometria de massa. A identificação do tipo de ligação sustenta a compreensão do papel fisiológico da interação substrato E3, que é de particular importância para a caracterização das vias de degradação do substrato associadas à doença37,38. Da mesma forma, o ensaio de descarga de liseina pode ser usado como uma ferramenta eficaz para desvendar diferenças catalíticas entre ligaduras de ubiquitina E3 ou famílias ligase E330. Em conclusão, os métodos in vitro de ubiquização descritos aqui são ferramentas eficazes para analisar diferentes aspectos da função ligase E3. Além da execução relativamente simples dos métodos descritos, uma grande vantagem é a aplicabilidade geral, pois proteínas de todas as fontes eucarióticas poderiam ser recombinantemente expressas e estudadas in vitro sem a necessidade de equipamentos especiais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros do nosso laboratório por discussão crítica e conselhos úteis sobre o manuscrito. Pedimos desculpas por não ter citado contribuições valiosas devido à limitação de tamanho. Este trabalho é apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2030 - 390661388 e - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 à T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 um T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

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Biologia Edição 171
<em>In vitro</em> Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin
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Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

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