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Biology

Détection et analyse automatisées de l’exocytose

Published: September 11, 2021 doi: 10.3791/62400
Automatic Translation
1, 1
1UNC Neuroscience Center, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Nous avons développé un logiciel de vision par ordinateur automatisé pour détecter les événements exocytaires marqués par des sondes fluorescentes sensibles au pH. Ici, nous démontrons l’utilisation d’une interface utilisateur graphique et de RStudio pour détecter les événements de fusion, analyser et afficher les paramètres spatio-temporels de la fusion et classer les événements en modes de fusion distincts.

Abstract

La microscopie TIRF timelapse de la GFP sensible au pH (pHluorin) attachée aux protéines SNARE des vésicules est une méthode efficace pour visualiser les événements exocytaires d’une seule vésicule en culture cellulaire. Pour effectuer une identification et une analyse impartiales et efficaces de ces événements, une approche basée sur la vision par ordinateur a été développée et mise en œuvre dans MATLAB. Le pipeline d’analyse se compose d’un algorithme de segmentation cellulaire et d’identification des événements exocytaires. L’approche de vision par ordinateur comprend des outils pour étudier de multiples paramètres d’événements uniques, y compris la demi-vie de la désintégration de fluorescence et le pic ΔF / F, ainsi que l’analyse des cellules entières de la fréquence de l’exocytose. Ces paramètres et d’autres de la fusion sont utilisés dans une approche de classification pour distinguer les modes de fusion distincts. Ici, une interface graphique nouvellement construite effectue le pipeline d’analyse du début à la fin. Une adaptation supplémentaire de la fonction K de Ripley dans R Studio est utilisée pour distinguer l’occurrence groupée, dispersée ou aléatoire d’événements de fusion dans l’espace et le temps.

Introduction

Les constructions VAMP-pHluorin ou récepteurs de la transferrine (TfR)-pHuji sont d’excellents marqueurs d’événements exocytaires, car ces fluorophores sensibles au pH sont trempés dans la lumière de la vésicule acide et fluorescent immédiatement après l’ouverture des pores de fusion entre la vésicule et la membraneplasmique 1. Après l’ouverture des pores de fusion, la fluorescence se désintègre de manière exponentielle, avec une certaine hétérogénéité qui révèle des informations sur l’événement de fusion. Ici, une application d’interface utilisateur graphique (GUI) est décrite qui détecte et analyse automatiquement les événements exocytaires. Cette application permet à l’utilisateur de détecter automatiquement les événements exocytaires révélés par les marqueurs sensibles au pH2 et de générer des caractéristiques de chaque événement qui peuvent être utilisées à des fins de classification3 (Figure 1A). En outre, l’analyse du regroupement d’événements exocytaires à l’aide de la fonction K de Ripley est décrite.

La classification automatisée des événements exocytaires en différents modes exocytaires a récemment été rapportée3. Deux modes d’exocytose, la fusion des vésicules complètes (FVF) et l’exocytose de la fusion kiss-and-run (KNR) ont déjà été décrits4,5,6,7. Pendant la FVF, le pore de fusion se dilate et la vésicule est incorporée dans la membrane plasmique. Pendant KNR, le pore de fusion s’ouvre transitoirement puis reseale4,5,8,9,10. Quatre modes d’exocytose ont été identifiés dans le développement des neurones, deux liés à la FVF et deux liés à KNR. Ces travaux démontrent que le FVF et le KNR peuvent être subdivisés en événements de fusion qui procèdent immédiatement à la désintégration de la fluorescence (FVFi et KNRi) après l’ouverture des pores de fusion ou en événements exocytaires qui présentent un délai après l’ouverture des pores de fusion avant le début de la désintégration de la fluorescence (FVFd et KNRd)(Figure 1B). Le classificateur identifie le mode d’exocytose pour chaque événement de fusion. Ici, cette analyse a été incorporée dans une interface graphique qui peut être installée dans MATLAB dans les systèmes d’exploitation Windows et Mac. Tous les fichiers d’analyse peuvent être consultés sur https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou
https://github.com/GuptonLab.

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Protocol

1. Choisissez les jeux de données et le répertoire

  1. Pour sélectionner des jeux de données à analyser, cliquez sur le bouton Rechercher des jeux de données ( Figure2A, encadré rouge 1) pour accéder au dossier dans lequel les données sont déposées (par exemple, le dossier RawData). Les fichiers de données rempliront automatiquement les fichiers de données sous forme de liste. Il peut y avoir plusieurs jeux de données dans le dossier.
  2. Cliquez sur le bouton Choisir un répertoire et sélectionnez le répertoire (par exemple, Test) où les fichiers analysés seront déposés (Figure 2A, encadré rouge 2). Un ensemble de dossiers et de fichiers d’analyse terminés ainsi que des images temporaires intermédiaires seront créés dans ce répertoire lorsque vous appuyez sur le bouton Analyse. Des erreurs seront produites si un répertoire n’est pas choisi.

2. Définissez la taille des pixels et la fréquence d’images

  1. Renseignez la fréquence d’images et la taille de pixels appropriées des images dans la zone « Framerate » ou « pixel size » appropriée (Figure 2A, boîte verte). Si aucune valeur n’est fournie (elles sont définies sur le « 0 » par défaut), le programme recherchera dans les métadonnées associées au fichier la fréquence d’images et la taille des pixels. Si ces valeurs sont introuvables, le programme utilisera par défaut par pixel pour la mesure et par image pour les points temporels.
    Remarque : Dans l’exemple fourni, la fréquence d’images est de 100 et la taille des pixels est de 0,08.

3. Choisissez ou fabriquez des masques

  1. Utilisez le bouton Créateur de masques pour créer automatiquement des masques de cellule pour les données de la liste des jeux de données de fichiers ( Figure2A, zone bleue). Lors de l’utilisation du bouton Mask Maker, un nouveau dossier dans le répertoire choisi sera créé appelé MaskFiles. L’indicateur « Run » jaunira pendant la course et reviendra au vert une fois terminé.
    Remarque : Un masque pour chaque fichier de la liste Fichiers de données sera créé à partir des 10 premières images du fichier image (ou de toutes les images si moins de 10 sont dans le fichier image) et déposé dans le dossier MaskFiles en utilisant le schéma de dénomination approprié (décrit ci-dessous).
  2. Assurez-vous que les fichiers de masque remplissent automatiquement la liste Fichiers de masque. L’utilisateur peut procéder directement à l’analyse.
    REMARQUE: Vérifiez toujours visuellement les fichiers de masque et confirmez qu’ils capturent toute la région d’intérêt. La première image du fichier de données et le fichier de masque sont affichés sur l’interface utilisateur lorsque cette option est sélectionnée. (Figure 2B). Le Mask Maker peut produire des erreurs dans le cas d’un faible rapport signal-bruit, il est donc essentiel de valider que les fichiers de masque sont appropriés pour le contrôle qualité.
  3. Au lieu d’utiliser Mask Maker, si le signal vers le bruit des images est insuffisant, créez des masques manuellement dans ImageJ.
    1. Tout d’abord, ouvrez le fichier image brut dans ImageJ (Figure 3A).
    2. Cliquez sur le bouton Sélection du polygone et cliquez pour dessiner un masque autour de la cellule. Une fois terminé, double-cliquez sur le dernier point pour terminer le polygone.
    3. Une fois terminé, accédez à Modifier | | de sélection Créer un masque (Figure 3B). Un nouveau masque inversé sera créé en fonction du dessin du polygone. Enregistrez les masques dans un dossier MaskFiles désigné dans le répertoire choisi. Le schéma de dénomination des fichiers de masque doit correspondre aux fichiers de données individuels correspondants, suivis de « _mask_file ». Par exemple, si un fichier de données est nommé « VAMP2_488_WT_1.tif », le fichier de masque correspondant doit être nommé « VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif ».
    4. Utilisez le bouton Rechercher des fichiers de masque pour accéder au dossier choisi des fichiers de masque personnalisés déposés. Les masques rempliront les fichiers de masque sous forme de liste.
      REMARQUE : Il est important d’avoir un masque pour chaque fichier de données avant d’exécuter l’analyse.

4. Analyse et extraction de caractéristiques

  1. Une fois le répertoire choisi et la liste Fichiers de données et la liste Fichiers de masque renseignées, cliquez sur le bouton Analyse (Figure 4A). Si la classification des événements exocytaires est requise, passez à l’étape 5.
    REMARQUE: Le bouton Analyse clique sur effectuera une série de tâches automatisées pour analyser les données. Il créera des dossiers individuels dans le répertoire choisi pour déposer les données analysées. Pendant l’exécution, l’indicateur de course passe du vert au jaune(Figure 4A,encadré rouge). Une fois l’analyse terminée, cela redevient vert.
  2. Recherchez un dossier DataFiles (Figure 4B) avec l’ensemble complet des fichiers d’analyse (ainsi que des fichiers d’extraction d’entités, à utiliser dans la classification ultérieure) nommés en fonction de chaque fichier de données (Figure 4C).
    REMARQUE : Une description de ces fichiers d’analyse est incluse ci-dessous dans la section Résultats représentatifs.

5. Classification des événements exocytaires

  1. Pour effectuer une classification simultanée des événements exocytaires avec détection automatisée, cochez la case Classification avant de cliquer sur le bouton Analyse. Pour chaque événement exocytaire, attribuez un score de probabilité compris entre 0 et 1 pour chaque classe. Un événement exocytaire est considéré comme l’une des quatre classes si le score de probabilité pour cette classe est > 0,5.
    REMARQUE : Une fois l’analyse terminée, un nouveau dossier de fichiers de données apparaîtra dans le répertoire choisi. Le dossier contiendra des fichiers d’analyse correspondant à chaque fichier image.

6. Analyse spatio-temporelle de l’exocytose à l’aide des valeurs K de Ripley

  1. Créez un fichier de masque « neurite » et « soma » séparé. Tout d’abord, segmentez le soma de la neurite. Il n’y a pas de méthode impartiale pour segmenter le soma des neurites, de sorte que l’utilisateur doit être aveuglé par l’expérience de conditionnement et utiliser le meilleur jugement; un ellipsoïde sans extensions de neurites évidentes est suggéré.
  2. Ouvrez ImageJ/Fidji.
  3. Faites glisser et déposez le fichier de masque ou utilisez fichier | Ouvrez, puis sélectionnez le fichier de masque.
  4. Utilisez l’outil de sélection de couleur et cliquez sur l’un des pixels noirs en arrière-plan du masque pour définir la couleur sur noir.
  5. Utilisez l’outil de sélection de polygones ou à main levée pour dessiner un contour autour du soma, en le séparant des neurites. Cela nécessite une prise de décision manuelle.
  6. Cliquez sur Modifier | | de sélection Faire un masque. Une nouvelle image s’ouvrira avec le soma encerclé segmenté du reste de l’image. Cela créera un fichier de masque soma.
  7. Sans déplacer la région dessinée, cliquez sur l’en-tête du fichier de masque d’origine.
  8. Cliquez sur Modifier | Remplissez pour remplir le soma encerclé afin que seules les neurites restent le masque.
  9. Une fois les fichiers de neurite et de masque séparés obtenus, enregistrez les deux fichiers de masque.
  10. Ouvrez « neurite_2D_network » dans Matlab.
  11. Dans MATLAB, accédez au répertoire avec toutes les données d’analyse.
  12. Remplacez le chemin « nom du masque » par le nom du masque de neurite, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif »
  13. Remplacez le « csv_file_name » par l’emplacement de fluorescent_traces.csv fichier, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv ».
  14. Cliquez sur Exécuter pour squelettiser le fichier de masque de neurite. Cela crée une version squelettée du fichier de masque de neurite et le dépose en tant que fichier CSV dans le dossier maskfiles.
  15. Ensuite, générez un fichier CSV pour le soma. Ouvrez « CSV_mask_creator.m » dans Matlab.
  16. Mettez dans le chemin d’accès pour le « nom du masque » au nom du masque soma, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
  17. Remplacez le « writematrix » par le nom de fichier csv à créer, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv »
  18. Cliquez sur Exécuter. Cela crée le nouveau fichier VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
  19. Répétez la section 6.14 pour chaque fichier de masque.

7. Configuration de RStudio

  1. Ouvrez Rstudio et ouvrez ripleys_k_analysis. Fichier R.
  2. Installez le paquet « spatstat » dans RStudio en allant dans Outils | Installez les packages et tapez « spatstat » puis cliquez sur Installer.
    REMARQUE: Cela ne doit être effectué qu’une seule fois par installation Rstudio.
  3. Exécutez le spatstat de la bibliothèque au début de chaque session.
  4. Faites attention à deux variables principales dans ce cas: « neuron_mask » et « neuron_datapoints ». Neuron Mask pointe vers l’ensemble des fichiers de masque à exécuter, c’est-à-dire les fichiers de masque soma.
    REMARQUE: Exécutez tous les fichiers de masque soma ensemble, séparément des fichiers de masque Neurite, et vice versa.
  5. Lisez dans le .csv des fichiers de masque pour chacun des neurones à analyser.
  6. Exécutez plusieurs fichiers à la fois en copiant des neuron_mask_n+1 supplémentaires. Cela permettra d’agréger l’analyse de Ripley ensemble, en utilisant le script décrit dans la section 8.
  7. Maintenant, vérifiez la deuxième variable, « neuron_datapoints ».
  8. Lisez dans le. » X_fluorescent_traces.csv » généré par le programme d’analyse (par caractéristiques de tous les fichiers extracted_R) avec les positions x,y,t des événements exocytaires, ainsi que le fichier spécifique aux neurites des positions x,y pour le réseau 2D. Cela va dans la position « neuron_datapoints ».
  9. Dans RStudio, sélectionnez le code | Exécuter la région | Exécuter tout. Cela génère plusieurs graphiques, y compris les valeurs K de Ripley regroupées ainsi que des diagrammes de densité.
  10. Enregistrez les tracés en allant dans Exporter | Enregistrer l’image sous | Sélectionnez le format d’image et le répertoire appropriés, puis entrez le nom de fichier approprié, puis cliquez sur Enregistrer.
    REMARQUE: La fonction de traçage pour les cartes thermiques est appelée dans le script en utilisant « plot(density(soma_data,0.4)) ». Le nombre « 0,4 » représente ici à quel point la fonction de densité doit être lissée. Il peut être modifié pour s’adapter aux données utilisateur de manière significative, mais si des comparaisons doivent être effectuées entre différentes cartes thermiques, le nombre doit être le même entre elles.
  11. Exporter ou enregistrer l’image à partir de Rstudio. Si une carte thermique nécessite d’autres modifications, choisissez un type de fichier approprié (SVG ou EPS).

8. Analyse de Ripley

REMARQUE: Le Ripleys_k_analysis. Le fichier R a également généré automatiquement les tracés de valeur k de Ripley. L’exécution du script entier exécutera automatiquement les fonctions mentionnées ci-dessous, mais il est inclus en détail si l’on souhaite exécuter chaque partie du script individuellement ou apporter des modifications à l’analyse.

  1. Tout d’abord, exécutez la fonction d’enveloppe pour chaque cellule. Cette fonction a simulé le hasard spatial complet (CSR) pour tester la valeur K de Ripley du modèle de point d’événement exocytaire par rapport à.
    Data_envelope_1 = enveloppe(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
    Data_envelope_2 = enveloppe(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
  2. Ensuite, regroupez ces enveloppes et créez une estimation de la RSE pour le groupe :
    Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
    Ensuite, exécutez la fonction K de Ripley pour tous les points de données.
    Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = VRAI)
    Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = VRAI)
  3. Une fois terminé, mettez en commun les valeurs K de Ripley et amorcez leurs intervalles de confiance avec la commande suivante :
    Pool de données = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
  4. Bootstrap avec la commande suivante :
    Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
  5. Tracez les données.
  6. Si une différence statistique dure est requise, le test de permutation studentisée est inclus dans le package spatstat pour tester une différence entre des groupes de modèles de points:
    Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).

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Representative Results

Ici, l’interface graphique(Figure 2A)a été utilisée pour analyser les événements exocytaires de trois neurones exprimant la VAMP2-pHluorine à 3 DIV en utilisant la microscopie TIRF (fluorescence par réflexion interne totale). Les neurones corticaux E15.5 ont été isolés, suivis d’une transfection avec VAMP2-pHluorin et d’un placage à l’aide des protocoles décrits dans Winkle et al., 2016 et Viesselmann et al., 201111,12. La méthodologie des paramètres d’imagerie est décrite dans Urbina et al., 20182. En bref, la microscopie TIRF a été utilisée pour imager la membrane plasmique basale des neurones toutes les 100 ms pendant 2 min. Figure 2, Figure 3, Figure 4 montrent un guide étape par étape pour analyser les événements exocytaires. Le dossier où se trouvent les images neuronales est sélectionné et un répertoire pour déposer les fichiers de données d’analyse finale est choisi (Figure 2A). À l’aide de la fonction MaskMaker, un masque est généré pour les neurones, qui est inspecté dans l’interface graphique (Figure 2B). Dans ce cas, le masque cellulaire est de bonne qualité et l’analyse peut se poursuivre. Si un masque est insuffisant, un masque peut être créé dans ImageJ (Figure 3). Après avoir utilisé la fonction MaskMaker ou créé un masque dans ImageJ et sélectionné le répertoire où se trouvent les fichiers de masque, l’analyse est effectuée (Figure 4A). Les résultats sont générés dans le dossier DataFiles lorsque l’analyse est terminée (l’indicateur jaune redevient vert) (Figure 4B).

Les fichiers de données sont générés automatiquement et nommés en fonction des fichiers de données brutes fournis.

En supposant que le fichier de données est nommé X :

X_tracking : Ce fichier comprend la position x, y et le numéro d’image de chaque événement ainsi que des cadres de sélection qui peuvent être utilisés pour dessiner des boîtes autour de chaque événement. L’âge indique le nombre d’images après la détection initiale où un événement est une puncta gaussienne distincte. Si la classification est vérifiée, les résultats de la classification apparaîtront dans ce fichier, ce qui indique la probabilité d’un événement exocytaire appartenant à l’une des quatre classes. Si la probabilité est supérieure à 0,5 et supérieure aux autres probabilités, alors une classe exocytaire a été choisie.

traces X_fluorescent : Ce fichier inclut la position x,y et le numéro d’image de chaque événement. En outre, il comprend des mesures d’intensité fluorescente dans une région d’intérêt autour de chaque événement 2 secondes avant et 10 secondes après le pic ΔF / F pour chaque événement (indiqué par les colonnes Timepoint).

X_cell_statistics : Ce fichier comprend la surface de la cellule, le temps total de l’image et la fréquence calculée automatiquement des événements exocytaires pour chaque cellule (en événements/mm2/minute).

Les fichiers d’extraction de fonctionnalités incluent :

X_contrast : Contraste. Mesure du contraste d’intensité entre un pixel et son voisin sur l’ensemble de l’image.

X_correlation : Corrélation. Mesure de la corrélation entre un pixel et son voisin sur l’ensemble de l’image.

X_energy Énergie totale. Défini comme la somme au carré de l’intensité des pixels.

X_homogeneity mesure la proximité de la distribution des éléments dans le ROI à la diagonale du ROI.

X_ring_fluorescence : la fluorescence moyenne des pixels de bordure.

X_SD : Écart type. Ceci est défini comme l’écart-type du retour sur investissement.

Des exemples de traces de fluorescence moyennes ± MEB de chaque classe exocytaire ont été tracés à partir d’X_fluorescent fichier de traces (Figure 5A). À l’aide du fichier Cell_statistics, la fréquence de l’exocytose pour chaque classe a été tracée pour chaque neurone(Figure 5B). Lorsque la case Classification est cochée, le programme affecte chaque événement exocytaire à une classe, tracée à la figure 5C. Après la classification, le code d’analyse K de Ripley a été utilisé pour déterminer si les événements exocytaires sont aléatoires, regroupés ou dispersés dans l’espace et le temps. Des cartes thermiques de densité de la localisation des événements exocytaires(Figure 5D)ont été générées. Ceux-ci révèlent des « points chauds » groupés attendus dans des régions distinctes du neurone. Ensuite, l’analyse K de Ripley a été effectuée pour le soma, la neurite et le clustering au fil du temps(Figure 5E). La valeur K de Ripley et la SEM (ligne noire et région ombrée bleue, respectivement) s’élèvent au-dessus de la ligne d’aléatoire spatial complet (ligne pointillée rouge), suggérant un regroupement statistiquement significatif.

Figure 1
Figure 1: Représentation de l’analyse exocytaire et de la classification. (A) Aperçu du pipeline d’analyse pour l’interface graphique. Les cellules sont segmentées à partir de l’arrière-plan avant que les événements exocytaires ne soient identifiés et suivis. Des paramètres tels que le pic ΔF/F et t1/2 sont calculés à partir de traces fluorescentes d’exocytose dans un retour sur investissement autour de l’événement avant et après la fusion. (B) illustration des quatre modes d’exocytose et exemples de montages d’images. Après la fusion, les événements peuvent passer instantanément à FVF ou KNR (FVFi et KNRi), ou un retard peut être présent avant le début du destin de fusion à FVF ou KNR (FVFd et KNRd). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Exemple d’analyse étape par étape. (A) Tout d’abord, les jeux de données sont choisis (1., boîte rouge), et un répertoire est choisi pour placer les fichiers d’analyse (2., boîte rouge). Ensuite, la fréquence d’images et la taille des pixels sont spécifiées (3., boîte verte). Ici, une taille de pixel de 0,08 μm et un framerate de 100 ms ont été utilisés. Le bouton de fonction MaskMaker est ensuite enfoncé (4., boîte bleue). Un dossier intitulé « MaskFiles » est automatiquement créé dans le répertoire choisi contenant un fichier de masque pour chaque fichier image du jeu de données. (B) Lorsque les jeux de données sont chargés, la sélection d’un fichier de données et/ou d’un fichier de masque affichera la première image des images pour faciliter la comparaison (boîte verte). Les fichiers de masque peuvent ne pas être complètement corrects ; ce fichier de masque peut être corrigé pour les erreurs, ou un nouveau fichier de masque peut être créé manuellement Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Création manuelle d’un fichier de masque dans ImageJ. (A) Ouvrez d’abord le fichier de création d’un masque. Le bouton « Sélections de polygones » est souligné en rouge. En cliquant autour du bord de la cellule, un contour de polygone est créé. (B) Comment créer un masque à partir du contour du polygone. En sélectionnant Modifier | | de sélection   Créer un masque, un masque noir et blanc sera créé à partir du polygone (image de droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Analyse des événements exocytaires. (A) Démonstration du bouton d’analyse (encadré orange) et d’une analyse en cours. Remarquez que l’indicateur d’exécution devient jaune pendant qu’une analyse est en cours. (B) Exemples de fichiers d’analyse créés dans le répertoire choisi lorsque l’analyse est terminée. Les DataFiles contiennent tous les fichiers d’analyse de l’événement exocytaire. (C) Fichiers d’analyse générés dans le dossier DataFiles. Les zones de couleur représentent les fichiers ouverts dans les images suivantes. (D) Trois fichiers ouverts, « X_fluorescent_traces.csv » (rouge) et « X_Cell_statistics » (vert), et « X_tracking » (bleu). Les traces fluorescentes contiennent la position x, y et le numéro d’image de chaque événement, ainsi que l’intensité fluorescente à chaque retour sur investissement. Cell_statistics contient des informations sommaires sur les statistiques exocytaires des cellules entières telles que la fréquence de l’exocytose. X_tracking contient des informations de position et de temps pour chaque événement exocytaire ainsi que la probabilité de chaque classe d’exocytose pour chaque événement, représentée par un nombre compris entre 0 et 1 (>0,5 indique qu’un événement appartient à une classe particulière). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Résultats représentatifs. (A) Traces de fluorescence moyennes +/- SEM de chaque classe exocytaire. (B) Fréquence des événements tracée pour trois neurones corticaux murins pour chaque classe exocytaire. Ces valeurs de données ont été tracées à partir de « X_Cell_statistics », en utilisant les classes attribuées dans « X_tracking ». (C) Distribution des classes d’exocytose pour les trois mêmes cellules utilisées dans A). Ici, le rapport de chaque mode est tracé. (D) Diagramme de densité de l’endroit où les événements exocytaires se produisent tels que générés dans la partie analyse K de Ripley du protocole. Cela peut être interprété comme une « carte thermique » de la probabilité spatiale de l’endroit où les événements se produisent. (E) Analyse K de Ripley de trois cellules utilisées pour A) et B). La ligne rouge indique la valeur d’une distribution complètement aléatoire spatialement des événements exocytaires. La ligne noire indique la valeur K de Ripley agrégée pour les trois cellules de cet exemple, et la région ombrée en bleu représente l’intervalle de confiance. Ici, la région ombrée se situe notamment en dehors de la ligne d’aléatoire spatial complet entre ~0,25-1 μm, ce qui suggère que les événements exocytaires sont regroupés à ces distances. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Lorsque vous utilisez le logiciel de détection et d’analyse exocytaire, veuillez noter que le programme n’accepte que la compression sans perte .tif fichiers en entrée. Les fichiers image .tif peuvent être des images en niveaux de gris (canal unique) 8 bits, 16 bits ou 32 bits. Les autres formats d’image doivent être convertis en l’un de ces types avant la saisie. À titre de référence, les exemples utilisés ici sont des images en niveaux de gris 16 bits.

Inhérents au processus de détection automatisé, les ensembles d’images timelapse sont traités pour la soustraction d’arrière-plan automatisée et la correction du photobleaching. Pour la soustraction d’arrière-plan, les pixels en dehors de la région masquée du fichier de masque sont moyennés sur le timelapse de l’image entière et la valeur moyenne est soustraite du jeu d’images. Pour la correction du photobleachage, un ajustement de désintégration mono-exponentielle est appliqué à la fluorescence moyenne des pixels dans le masque au cours de la vidéo, l’intensité corrigée étant ajustée comme suit:

Intensité corrigée = (Intensité au temps t) ÷ exp-k×t où k = constante de désintégration

Par conséquent, aucun prétraitement n’est nécessaire avant la saisie. Ces processus, cependant, s’appuient de manière critique sur le masque d’image pour séparer efficacement la cellule de l’arrière-plan, et donc un masque de cellule approprié est nécessaire pour de bons résultats.

Le créateur automatisé de masque de cellule nécessite un signal uniforme avec un rapport signal/bruit suffisant (idéalement, au moins 2 fois l’écart-type du signal de fond moyen) pour bien fonctionner. Empiriquement, la boîte CAAX marquée d’une protéine fluorescente, qui s’insère dans la membrane plasmique lors de la prénylation, fonctionne bien. Il n’est pas nécessaire que le signal puisse être maintenu tout au long de l’imagerie timelapse de l’exocytose, car un masque approprié peut être créé à partir d’un signal élevé dans les 10 premières images de la séquence. Cependant, si la morphologie cellulaire change de manière significative au cours du paradigme d’imagerie, des précautions doivent être prises.

Lorsque vous utilisez le logiciel de détection automatisé, incluez la fréquence d’images et la taille des pixels pour des sorties temporelles et spatiales précises. Si aucune fréquence d’images ou taille de pixel n’est déclarée, la sortie sera par pixel et par image. En règle générale, les diamètres des vésicules dans les neurones en développement sont à l’échelle d’environ 100 nm13, et donc la détection automatisée des événements peut fonctionner pour des vésicules de taille similaire. À l’heure actuelle, il n’y a pas de limite stricte à la taille des vésicules pouvant être détectées (par zone de pixels), car la détection automatisée repose sur une intensité de forme gaussienne sur une large gamme de largeurs gaussiennes. La fusion de vésicules inférieures à la largeur d’un pixel peut être détectée avec précision si l’intensité de l’événement répond aux critères signal-bruit de 2 fois l’écart-type du signal de fond moyen lorsque la diffraction de fluorescence s’étend sur plusieurs pixels.

Ce programme a été développé pour détecter les événements exocytaires dans les neurones en développement. Cependant, le logiciel a été exploité pour détecter avec succès des événements exocytaires dans d’autres lignées cellulaires2,ce qui indique que l’algorithme de détection est robuste. Bien que nous ayons utilisé le logiciel pour détecter des événements exocytaires dans des types de cellules non neuronales, les différences de mode d’événement exocytaire entre les types de cellules14 indiquent que l’algorithme de classification peut ne pas convenir à d’autres types de cellules. Les événements exocytaires dans les neurones en développement ont été initialement classés à l’aide de trois méthodes différentes: le clustering hiérarchique, le gauchissement temporel dynamique et l’analyse en composantes principales (PCA), révélant quatre classes différentes3. Ici, les trois classificateurs sont utilisés dans l’interface graphique pour catégoriser les événements exocytaires dans l’une de ces quatre classes établies. Pour chaque événement exocytaire, un score de probabilité compris entre 0 et 1 est attribué pour chacune des quatre classes possibles. Toute classe ayant un score de probabilité > 0,5 est considérée comme faisant partie de cette classe. Cette classification n’a été utilisée que dans le développement des neurones à ce jour. On ne sait pas si ces classes existent dans d’autres types de cellules ou à des moments de développement ultérieurs dans les neurones. Un grand nombre d’événements avec des scores de probabilité de <0,5 pour l’une ou l’autre des classes suggèrent que la procédure de classification pourrait ne pas être appropriée pour les événements exocytaires en cours d’évaluation. Si de faibles scores de probabilité sont attribués à des événements exocytaires de différents types de cellules, cela suggère que la classification de novo est nécessaire car de nouveaux modes d’exocytose ou d’autres modes d’exocytose peuvent exister. Les mêmes méthodes de classification utilisées ici devraient être appliquées aux événements exocytaires détectés automatiquement.

Pour explorer le regroupement spatial et temporel des événements exocytaires, l’analyse K15 de Ripley est exploitée. L’analyse du clustering pour les neurones implique trois analyses distinctes: une pour le soma, une pour les neurites et une pour le temps. La raison de la division du soma et des neurites est de tenir compte de l’extrême morphologie des neurites, qui sont souvent suffisamment minces pour pouvoir être traitées comme un réseau 2D et appliquer une variante 2D de l’analyse K de Ripley. Pour le temps, une analyse K de Ripley 1D est implémentée pour le clustering temporel. L’analyse K de Ripley est une méthode robuste pour détecter le regroupement de processus ponctuels et la colocalisation. Le graphique de K de Ripley peut être interprété comme tel : la valeur K de Ripley + l’intervalle de confiance a 5% de chances de tomber en dehors de la ligne d’aléatoire spatial complet en tout point, analogue à une valeur de p de 0,05. Lorsque la valeur se situe en dehors de la ligne du hasard spatial complet, les événements exocytaires sont regroupés (au-dessus de la RSE) ou sont séparés à intervalles réguliers (en dessous de la RSE) à ces distances (axe des x).

La création du fichier de masque repose sur un signal/bruit initial élevé de la cellule. Les marqueurs sensibles au pH peuvent ne pas toujours bien fonctionner pour éclairer une cellule, selon la protéine à laquelle la sonde est attachée. Une autre option pour créer des fichiers de masque si le signal au bruit du marqueur exocytaire ne met pas suffisamment en évidence la bordure de la cellule consiste à utiliser un deuxième canal fluorescent / image pour la création du masque. Si vous utilisez un marqueur de fluorescence différent (tagRFP-CAAX, par exemple) pour créer des masques, lors du choix d’un jeu de données, accédez d’abord au dossier contenant les images à partir desquels créer des masques (par exemple, un dossier contenant les images tagRFP-CAAX). Utilisez le bouton Mask Maker ici. Il est important de ne pas oublier de renommer les fichiers de masque pour qu’ils correspondent au fichier de données exocytaires à analyser avec le schéma de dénomination ci-dessus (en suivant l’exemple ci-dessus, les fichiers de masque nommés « CAAX_1_mask_file.tif » devront être renommés en « VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif » pour correspondre à l’ensemble d’images VAMP2 à analyser). Une fois que les fichiers de masque sont nommés de manière appropriée, revenez au bouton Choisir le jeu de données pour accéder aux fichiers de jeu de données exocytaires à analyser.

La détection de l’exocytose est remarquablement sensible, et les événements exocytaires ont été détectés avec précision à des rapports signal/bruit aussi bas qu’un ΔF/F de 0,01. La sensibilité de la détection dépend en partie de la variance de la fluorescence de fond, et les événements inférieurs à 4 écarts-types au-dessus du signal de fond ne seront pas détectés.

La détection des événements exocytaires dépend de leur nature transitoire. En tant que caractéristique de l’analyse des événements transitoires, notre code de détection explore une fenêtre de 20 secondes autour de l’événement exocytaire. Dans certains types de cellules, l’exocytose de baiser et de rester peut « rester » pendant une fenêtre temporelle beaucoup plus longue que dans les neurones en développement, et la détection automatisée peut ne pas capturer de manière robuste ces événements moins transitoires. Cette fonctionnalité est une variable facilement modifiable pour ceux qui sont à l’aise avec MATLAB. Semblable à la limitation du retour sur investissement de 20 secondes, les événements exocytaires qui apparaissent mais ne disparaissent pas avant la dernière période de la vidéo peuvent ne pas être comptés comme une véritable exocytose, ce qui peut influencer la fréquence, qui est calculée en fonction de la longueur totale de la série chronologique.

Le fabricant de masques inclus est automatisé par conception et fonctionne bien sur la segmentation de formes complexes à partir de l’arrière-plan; cependant, la conception entièrement automatisée limite la gamme de signal-bruit et de type de signal qui peut être utilisé pour générer automatiquement un masque. Si l’utilisateur ne peut pas inclure un marqueur de cellule fluorescent qui est uniforme et d’un rapport signal/bruit significatif, le masque de cellule devra être dessiné manuellement.

L’analyse de l’exocytose basée sur l’utilisateur est un processus long et sujet à un biais personnel, car les événements ne sont pas toujours clairement séparés des autres fluorescences. L’utilisation d’un programme d’analyse automatisé pour identifier et analyser correctement les événements exocytaires de manière impartiale augmente l’efficacité de l’analyse et améliore la reproductibilité et la rigueur.

Non seulement cette détection d’événements exocytaires fonctionne pour capturer avec précision la fluorescence sensible au pH dans les neurones en développement, mais aussi d’autres types de cellules (Urbina et al., 2018). La question de savoir si la classification fonctionne pour d’autres types de cellules nécessitera une détermination. Les applications futures de cette technique pourraient être utiles aux synapses, dans les types de cellules non neuronales, ou avec de nouveaux marqueurs de l’amarrage et de la fusion des vésicules exocytaires, tels que pHmScarlet16récemment décrit.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Dustin Revell et Reginald Edwards d’avoir testé le code et l’interface graphique. Le financement a été fourni par les National Institutes of Health pour soutenir cette recherche : Y compris R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) et F31NS103586 (FLU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R R Core Team https://www.r-project.org/
Rstudio Rstudio, PBC https://rstudio.com/

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References

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Biologie numéro 175
Détection et analyse automatisées de l’exocytose
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Urbina, F., Gupton, S. L. Automated… More

Urbina, F., Gupton, S. L. Automated Detection and Analysis of Exocytosis. J. Vis. Exp. (175), e62400, doi:10.3791/62400 (2021).

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