Мы разработали автоматизированное программное обеспечение для компьютерного зрения для обнаружения экзоцитарных событий, отмеченных pH-чувствительными флуоресцентными зондами. Здесь мы демонстрируем использование графического пользовательского интерфейса и RStudio для обнаружения событий слияния, анализа и отображения пространственно-временных параметров слияния и классификации событий в различные режимы слияния.
Замедленная TIRF-микроскопия pH-чувствительного GFP (pHluorin), прикрепленного к белкам SNARE везикул, является эффективным методом визуализации одиночных экзоцитарных событий в клеточной культуре. Для проведения непредвзятой, эффективной идентификации и анализа таких событий в MATLAB был разработан и внедрен подход, основанный на компьютерном зрении. Конвейер анализа состоит из алгоритма сегментации клеток и идентификации экзоцитарных событий. Подход компьютерного зрения включает в себя инструменты для исследования множественных параметров единичных событий, включая период полураспада флуоресценции и пик ΔF/F, а также общеклеточный анализ частоты экзоцитоза. Эти и другие параметры синтеза используются в классификационном подходе для различения различных режимов синтеза. Здесь недавно созданный графический интерфейс выполняет конвейер анализа от начала до конца. Дальнейшая адаптация K-функции Рипли в R Studio используется для различения кластеризованным, рассеянным или случайным возникновением событий слияния как в пространстве, так и во времени.
Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации3 (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.
Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена3. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.
При использовании программного обеспечения для обнаружения и анализа экзоцитов, пожалуйста, учитывайте, что программа принимает только сжатие без потерь .tif файлы в качестве входных данных. Файлы изображений .tif могут быть 8-битными, 16-битными или 32-битными изображениями в градациях сер?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Дастина Ревелла и Реджинальда Эдвардса за тестирование кода и графического интерфейса. Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения, поддержали это исследование: в том числе R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) и F31NS103586 (FLU).
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |