Summary
طورنا برامج رؤية الكمبيوتر الآلي للكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي تتميز مسابير الفلورسنت الحساسة لhH. هنا، ونحن نثبت استخدام واجهة المستخدم الرسومية وRStudio للكشف عن أحداث الانصهار، وتحليل وعرض المعلمات الصدغية من الانصهار، وتصنيف الأحداث إلى وسائط الانصهار متميزة.
Abstract
الوقت TIRF المجهر من GFP الحساسة لhh (pHluorin) تعلق على البروتينات SNARE الحوييل هو وسيلة فعالة لتصور الأحداث وحيدة في زراعة الخلايا. وللاضطلاع بتحديد وتحليل غير متحيزين وفعالين لهذه الأحداث، تم تطوير وتنفيذ نهج قائم على رؤية الحاسوب في MATLAB. يتكون خط أنابيب التحليل من خوارزمية تعريف تقسيم الخلايا والحدث الإكسوسيتيكي. يتضمن نهج الرؤية الحاسوبية أدوات للتحقيق في معلمات متعددة للأحداث الفردية ، بما في ذلك نصف عمر تسوس الفلورسين وذروة ΔF / F ، بالإضافة إلى تحليل كامل للخلايا لتواتر الإفراز. وتستخدم هذه المعلمات وغيرها من معايير الانصهار في نهج التصنيف للتمييز بين وسائط الانصهار متميزة. هنا واجهة المستخدم الرسومية بنيت حديثا ينفذ خط أنابيب التحليل من البداية إلى النهاية. يتم استخدام المزيد من التكيف مع وظيفة ريبلي K في R Studio للتمييز بين الحدوث المجمع أو المشتت أو العشوائي لأحداث الاندماج في كل من المكان والزمان.
Introduction
يبني VAMP-pHluorin أو مستقبلات نقل (TfR) - pHuji البنى هي علامات ممتازة للأحداث exocytic، كما يتم إخماد هذه الفلوروفورس الحساسة ل درجة الحموضة داخل التجويف الحويكل الحمضي والفلوريس مباشرة عند فتح المسام الانصهار بين الحويكل وغشاء البلازما1. بعد فتح المسام الانصهار، تتحلل الفلورية أضعافا مضاعفة، مع بعض التغاير الذي يكشف عن معلومات حول الحدث الانصهار. هنا، يتم وصف تطبيق واجهة مستخدم رسومية (GUI) الذي يقوم تلقائيا بالكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية وتحليلها. يسمح هذا التطبيق للمستخدم بالكشف تلقائيا عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي كشفت عنها علامات حساسة الرقمالحموضة 2 وتوليد ميزات من كل حدث التي يمكن استخدامها لأغراض التصنيف3 (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تحليل تجمع الأحداث exocytic باستخدام دالة K ريبلي.
التصنيف الآلي للأحداث exocytic في وسائط خارجية مختلفة أفيد مؤخرا3. وقد وصفت من قبل وضعين من exocytosis ، الانصهار الكامل الحويكل (FVF) وقبلة وتشغيل الانصهار (KNR) exocytosis4،5،6،7. خلال FVF ، يتوسع مسام الانصهار ، ويتم دمج الحويكل في غشاء البلازما. خلال KNR ، يفتح المسام الانصهار بشكل عابر ثم يعيد ختم4،5،8،9،10. تم تحديد أربعة أنماط من الإصابة بالخلايا العصبية في تطوير، اثنان تتعلق FVF واثنين تتعلق KNR. هذا العمل يدل على أن كلا من FVF و KNR يمكن تقسيمها إلى مزيد من الأحداث الانصهار التي تنتقل على الفور إلى تسوس مضان (FVFi و KNRi) بعد فتح المسام الانصهار أو الأحداث الخارجية التي تظهر تأخير بعد فتح المسام الانصهار قبل أن يبدأ الاضمحلال الفلوري (FVFd وKNRd) (الشكل 1B). يحدد المصنف وضع التقشير لكل حدث اندماجي. هنا تم دمج هذا التحليل في واجهة المستخدم الرسومية التي يمكن تثبيتها في MATLAB في أنظمة التشغيل ويندوز وماك القائمة. يمكن العثور على جميع ملفات التحليل في https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing أو
https://github.com/GuptonLab
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اختيار مجموعات البيانات والدليل
- لتحديد مجموعات البيانات للتحليل، انقر فوق الزر بحث عن مجموعات البيانات ( الشكل2A، المربع الأحمر 1) للانتقال إلى المجلد الذي يتم إيداع البيانات فيه (على سبيل المثال، مجلد RawData). ملفات البيانات تلقائيا بملء ملفات البيانات كقائمة. يمكن أن يكون هناك أكثر من مجموعة بيانات واحدة في المجلد.
- انقر على زر اختيار الدليل وحدد الدليل (على سبيل المثال، اختبار) حيث سيتم إيداع الملفات المحللة (الشكل 2A، المربع الأحمر 2) . سيتم إنشاء مجموعة من المجلدات وملفات التحليل النهائية بالإضافة إلى الصور المؤقتة المتوسطة في هذا الدليل عند الضغط على زر التحليل. سيتم إنتاج أخطاء إذا لم يتم اختيار دليل.
2. تعيين حجم بكسل ومعدل الإطارات
- ملء معدل الإطار المناسب وحجم بكسل من الصور في المناسبة "Framerate" أو "حجم بكسل" مربع (الشكل 2A، مربع أخضر). إذا لم يتم توفير أية قيم (يتم تعيينها إلى الافتراضي "0")، ثم سيقوم البرنامج بالبحث في بيانات التعريف المقترنة بالملف لحجم معدل الإطارات والبكسل. إذا تعذر العثور على هذه القيم، فسيتخلف البرنامج عن كل بكسل للقياس وفي كل إطار للنقاط الزمنية.
ملاحظة: في المثال المتوفر، معدل الإطارات هو 100، وحجم بكسل هو 0.08.
3. اختيار أو جعل أقنعة
- استخدم الزر Maker قناع لإنشاء أقنعة الخلية تلقائيا للبيانات في قائمة مجموعة بيانات الملف (الشكل 2A، المربع الأزرق). عند استخدام الزر Maker قناع سيتم إنشاء مجلد جديد في الدليل المختار يسمى MaskFiles. يتحول "مؤشر التشغيل" إلى اللون الأصفر أثناء التشغيل ويعود إلى اللون الأخضر عند اكتماله.
ملاحظة: سيتم إنشاء قناع لكل ملف في قائمة ملفات البيانات من الإطارات 10 الأولى من ملف الصورة (أو من كافة الإطارات إذا كان أقل من 10 في ملف الصورة) وإيداعها في المجلد MaskFiles باستخدام نظام التسمية المناسبة (الموضحة أدناه). - تأكد من أن ملفات القناع تلقائيا بملء قائمة "ملفات قناع". يمكن للمستخدم المتابعة مباشرة إلى التحليل.
ملاحظة: تحقق من ملفات القناع بشكل مرئي دائما وتأكد من التقاطها لمنطقة الاهتمام بأكملها. يتم عرض الإطار الأول من ملف البيانات وملف القناع على واجهة المستخدم عند تحديدها. (الشكل2ب). قد ينتج "صانع القناع" أخطاء في حالة انخفاض الإشارة إلى الضوضاء، لذا فإن التحقق من صحة أن ملفات القناع مناسبة أمر بالغ الأهمية لمراقبة الجودة. - كبديل لاستخدام Mask Maker، إذا كانت الإشارة إلى ضجيج الصور غير كافية، قم بإنشاء أقنعة يدويا في ImageJ.
- أولا، افتح ملف الصورة الخام في ImageJ (الشكل 3A).
- انقر فوق الزر تحديد المضلع وانقر فوق لرسم قناع حول الخلية. بمجرد الانتهاء، انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة الأخيرة لإكمال المضلع.
- بمجرد الانتهاء، انتقل إلى تحرير | | التحديد إنشاء قناع (الشكل 3B). سيتم إنشاء قناع مقلوب جديد استنادا إلى الرسم المضلع. حفظ أقنعة في مجلد MaskFiles المعينة في الدليل المختار. يجب أن يطابق نظام تسمية ملف القناع ملفات البيانات الفردية المطابقة متبوعا ب "_mask_file". على سبيل المثال، إذا كان ملف بيانات يسمى "VAMP2_488_WT_1.tif"، يجب أن يكون اسم ملف القناع المطابق "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- استخدم الزر بحث عن Maskfiles للانتقال إلى المجلد المختار من ملفات القناع المخصص المودعة. سوف الأقنعة ملء "ملفات قناع" كقائمة.
ملاحظة: من المهم أن يكون قناع لكل ملف بيانات قبل تشغيل التحليل.
4. تحليل واستخراج ميزة
- بعد اختيار الدليل وملء قائمة ملفات البيانات وقائمة ملفات القناع، انقر فوق الزر تحليل (الشكل 4A). إذا كان تصنيف الأحداث exocytic مطلوبا، انتقل إلى الخطوة 5.
ملاحظة: سيؤدي النقر فوق الزر تحليل سلسلة من المهام التلقائية لتحليل البيانات. فإنه سيتم إنشاء مجلدات فردية في الدليل المختار لإيداع البيانات التي تم تحليلها. أثناء التشغيل، سيتغير "مؤشر التشغيل" من الأخضر إلى الأصفر (الشكل 4A، المربع الأحمر). بعد الانتهاء من التحليل، سيتغير هذا مرة أخرى إلى اللون الأخضر. - العثور على مجلد DataFiles (الشكل 4B) مع مجموعة كاملة من ملفات التحليل (وكذلك ملفات استخراج ميزة، لاستخدامها في التصنيف لاحقا) اسمه وفقا لكل ملف البيانات (الشكل 4C).
ملاحظة: يتم تضمين وصف ملفات التحليل هذه أدناه في المقطع نتائج الممثل.
5. تصنيف الأحداث الإكستية
- لإجراء تصنيف متزامن للأحداث الإكسوسيتيكية مع الكشف التلقائي، تحقق من خانة الاختيار تصنيف قبل النقر على زر التحليل. لكل حدث exocytic تعيين درجة احتمال بين 0-1 لكل فئة. يعتبر الحدث exocytic مصنفا كواحد من الفئات الأربع إذا كانت درجة الاحتمال لتلك الفئة > 0.5.
ملاحظة: بمجرد اكتمال التحليل، سيظهر مجلد ملف بيانات جديد ضمن الدليل المختار. سيحتوي المجلد على ملفات تحليل مطابقة لكل ملف صورة.
6. تحليل سباتيوتمبورالي للنصرة باستخدام قيم ريبلي K
- إنشاء ملف قناع "neurite" و "soma" منفصل. أولا، قطع سوما من النيوريت. لا توجد طريقة غير متحيزة لتقسيم سوما من neurites ، لذلك يجب أن يكون المستخدم أعمى عن تجربة التكييف واستخدام أفضل حكم . ويقترح بيضاوي مع عدم وجود ملحقات neurite واضحة.
- فتح ImageJ / فيجي.
- اسحب ملف القناع وأسقطه أو استخدم ملف | افتح ثم حدد ملف القناع.
- استخدام أداة منتقي الألوان وانقر على أي من بكسل أسود في خلفية القناع لتعيين اللون إلى الأسود.
- استخدم أداة تحديد المضلع أو حر لرسم مخطط تفصيلي حول سوما، وفصله عن neurites. وهذا يتطلب اتخاذ قرارات يدوية.
- انقر على تحرير | | التحديد جعل قناع. سيتم فتح صورة جديدة مع سوما دائرة مجزأة من بقية الصورة. سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف قناع سوما.
- دون تحريك المنطقة المرسومة، انقر فوق رأس ملف القناع الأصلي.
- انقر على تحرير | ملء لملء سوما دائرة بحيث تبقى فقط neurites القناع.
- بمجرد الحصول على ملفات neurite وقناع منفصلة حفظ كل من ملفات القناع.
- فتح "neurite_2D_network" في ماتلاب.
- في MATLAB، انتقل إلى الدليل مع كافة بيانات التحليل.
- تغيير المسار "اسم القناع" إلى اسم قناع neurite، أي"MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- تغيير "csv_file_name" إلى حيث يوجد ملف fluorescent_traces.csv، أي"MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- انقر فوق تشغيل لهياكل عظمية ملف قناع neurite. يؤدي هذا إلى إنشاء إصدار skeletonized من ملف قناع neurite و إيداعه كملف CSV ضمن المجلد maskfiles.
- بعد ذلك، إنشاء ملف CSV ل soma. فتح "CSV_mask_creator.m" في ماتلاب.
- وضع في المسار ل "اسم قناع" إلى اسم قناع سوما، أي، "MaskFiles / VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- تغيير "writematrix" إلى اسم ملف csv ليتم إنشاؤها، أي" MaskFiles / VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv "
- انقر فوق تشغيل. يؤدي هذا إلى إنشاء ملف VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv جديد.
- كرر 6.14 لكل ملف قناع.
7. إعداد RStudio
- فتح Rstudio وفتح ripleys_k_analysis. R ملف.
- تثبيت الحزمة "spatstat" في RStudio عن طريق الانتقال إلى أدوات | تثبيت الحزم والكتابة في "spatstat" متبوعا بالنقر فوق تثبيت.
ملاحظة: هذا يحتاج فقط إلى تنفيذ مرة واحدة لكل تثبيت Rstudio. - تشغيل مكتبة spatstat في بداية كل جلسة عمل.
- انتبه إلى متغيرين رئيسيين في هذه الحالة: "neuron_mask" و "neuron_datapoints". قناع الخلايا العصبية يشير إلى مجموعة من ملفات قناع لتشغيل، أي، سوما قناع الملفات.
ملاحظة: تشغيل كافة ملفات قناع سوما معا، بشكل منفصل عن ملفات قناع Neurite، والعكس بالعكس. - قراءة في .csv من ملفات قناع لكل من الخلايا العصبية ليتم تحليلها.
- تشغيل ملفات متعددة في وقت واحد عن طريق نسخ neuron_mask_n+1 إضافية. سيسمح هذا بتجميع تحليل ريبلي معا ، باستخدام السيناريو الموصوف في القسم 8.
- الآن تحقق من المتغير الثاني ، "neuron_datapoints".
- اقرأ في. X_fluorescent_traces.csv" الملف الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج التحليل (بواسطة ميزات كافة extracted_R ملف) مع المواضع x,y,t الأحداث exocytic، وكذلك ملف neurite الخاصة بمواضع x,y لشبكة الاتصال 2D. هذا يذهب في موقف "neuron_datapoints".
- في RStudio حدد رمز | تشغيل | المنطقة تشغيل كافة. وهذا يولد العديد من المؤامرات، بما في ذلك قيم ريبلي K المجمعة وكذلك قطع الكثافة.
- حفظ قطع الأراضي عن طريق الذهاب إلى تصدير | حفظ الصورة كما | حدد تنسيق الصورة المناسب والدليل، ثم أدخل اسم الملف المناسب، ثم انقر فوق حفظ.
ملاحظة: يتم استدعاء دالة رسم خرائط الحرارة في البرنامج النصي باستخدام "plot(density(soma_data,0.4)"." يمثل الرقم "0.4" هنا مدى سلاسة وظيفة الكثافة. يمكن تغييره ليتناسب مع بيانات المستخدم بطريقة ذات معنى، ولكن إذا كان سيتم إجراء المقارنات بين خرائط الحرارة المختلفة، يجب أن يكون الرقم هو نفسه بينهما. - تصدير أو حفظ الصورة من Rstudio. إذا تطلبت خريطة الحرارة المزيد من التحرير، فاختر نوع ملف مناسب (SVG أو EPS).
8. تحليل ريبلي
ملاحظة: Ripleys_k_analysis. R الملف أيضا تلقائيا ولدت ريبلي ك قيمة المؤامرات. تشغيل البرنامج النصي بأكمله سيتم تلقائيا تشغيل الوظائف المذكورة أدناه، ولكن يتم تضمينه بالتفصيل إذا كان أحد يرغب في تشغيل كل جزء من البرنامج النصي بشكل فردي أو إجراء تغييرات على التحليل.
- أولا، تشغيل دالة المغلف لكل خلية. هذه الدالة محاكاة عشوائية المكانية كاملة (CSR) لاختبار القيمة K ريبلي من نمط نقطة الحدث exocytic ضد.
Data_envelope_1 = المغلف (soma_data_1، Kest، nsim = 19، savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = المغلف (soma_data_2، Kest، nsim = 19، savefuns = TRUE) - بعد ذلك، تجمع هذه المغلفات معا وإنشاء تقدير واحد من المسؤولية الاجتماعية للشركات للمجموعة:
Pool_csr = تجمع (Data_envelope_1، Data_envelop_2,...)
بعد ذلك، قم بتشغيل الدالة K ريبلي لكافة نقاط البيانات.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1، نسبة = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2، نسبة = TRUE) - بمجرد الانتهاء، تجمع قيم ريبلي K معا وbootstrap فترات الثقة الخاصة بهم مع الأمر التالي:
تجمع البيانات = تجمع (Data_ripleys_k_1، Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap مع الأمر التالي:
Final_Ripleys_K = varblock (متعة = Kest ، Data_pool) - رسم البيانات.
- إذا كان هناك حاجة إلى اختلاف إحصائي ثابت، يتم تضمين اختبار التباديل Studentised في حزمة spatstat لاختبار الفرق بين مجموعات من أنماط النقاط:
Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test ، exocytic_events ~ المجموعة ، nperm = NP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 2A)تم استخدامها لتحليل الأحداث exocytic من ثلاثة VAMP2-pHluorin التعبير عن الخلايا العصبية في 3 DIV باستخدام TIRF (الانعكاس الداخلي الكلي مضان) المجهر. تم عزل الخلايا العصبية القشرية E15.5، تليها العدوى مع VAMP2-pHluorin والطلاء باستخدام البروتوكولات على النحو المبين في وينكل وآخرون، 2016 وفيسيلمان وآخرون، 201111،12. منهجية معلمات التصوير كما هو موضح في أوربينا وآخرون، 20182. لفترة وجيزة، تم استخدام المجهر TIRF لتصوير غشاء البلازما القاعدية من الخلايا العصبية كل 100 مللي ثانية لمدة 2 دقيقة. الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4 تظهر دليل خطوة بخطوة لتحليل الأحداث exocytic. يتم تحديد المجلد حيث توجد الصور العصبية، ويتم اختيار دليل لإيداع ملفات البيانات التحليل النهائي (الشكل 2A). باستخدام وظيفة MaskMaker ، يتم إنشاء قناع للخلايا العصبية ، والتي يتم فحصها في واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 2B). في هذه الحالة، قناع الخلية ذات نوعية جيدة، ويمكن المضي قدما في التحليل. إذا كان القناع غير كاف، يمكن إنشاء قناع في ImageJ (الشكل 3). بعد استخدام وظيفة MaskMaker أو إنشاء قناع في ImageJ وتحديد الدليل حيث توجد ملفات القناع ، يتم إجراء التحليل(الشكل 4A). يتم إنشاء النتائج في المجلد DataFiles عند الانتهاء من التحليل (يتغير المؤشر الأصفر مرة أخرى إلى اللون الأخضر) (الشكل 4B).
يتم إنشاء ملفات البيانات تلقائيا و تسميتها وفقا لملفات البيانات الأولية المتوفرة.
بافتراض أن ملف البيانات يسمى X:
X_tracking: يتضمن هذا الملف x,y موضع ورقم الإطار لكل حدث بالإضافة إلى مربعات الحدود التي يمكن استخدامها لرسم مربعات حول كل حدث. يشير العمر إلى عدد الإطارات التي تجاوزت الكشف الأولي حيث يكون الحدث هو بونكتا غاوسي متميز. إذا تم التحقق من التصنيف، ستظهر نتائج التصنيف في هذا الملف، مما يشير إلى احتمال حدوث حدث خارجي ينتمي إلى واحدة من أربع فئات. إذا كان الاحتمال أكبر من .5، وأكبر من الاحتمالات الأخرى، ثم تم اختيار فئة exocytic.
آثار X_fluorescent: يتضمن هذا الملف x,y موضع ورقم الإطار لكل حدث. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن مقاييس كثافة الفلورسنت في منطقة ذات أهمية حول كل حدث قبل ثانيتين و10 ثوان بعد ذروة ΔF/F لكل حدث (المشار إليه بأعمدة Timepoint).
X_cell_statistics: يتضمن هذا الملف منطقة الخلية، إجمالي وقت الصورة، وتكرار محسوب تلقائيا للأحداث exocytic لكل خلية (في الأحداث/mm2/minute).
تتضمن ملفات استخراج الميزات ما يلي:
X_contrast: تباين. مقياس لتباين الكثافة بين البكسل وجاره على الصورة بأكملها.
X_correlation: الارتباط. مقياس لمدى ارتباط البكسل بجاره على الصورة بأكملها.
X_energy مجموع الطاقة. تعريف ك مجموع مربع لشدة البكسل.
X_homogeneity يقيس مدى قرب توزيع العناصر في عائد الاستثمار إلى قطر عائد الاستثمار.
X_ring_fluorescence: متوسط الفلورسينس من بكسل الحدود.
X_SD: الانحراف المعياري. يتم تعريف هذا على أنه الانحراف المعياري لعائد الاستثمار.
تم رسم أمثلة من متوسط آثار الفلورسينس ± SEM من كل فئة exocytic من ملف آثار X_fluorescent(الشكل 5A). باستخدام ملف Cell_statistics، تم رسم وتيرة التناضح لكل فئة لكل خلية عصبية(الشكل 5B). مع النقر فوق خانة الاختيار تصنيف البرنامج بتعيين كل حدث exocytic إلى فئة، مرسومة في الشكل 5C. بعد التصنيف، تم استخدام رمز تحليل K الخاص ب Ripley لتحديد ما إذا كانت الأحداث الإكسوسيتيكية عشوائية أو مجمعة أو مشتتة في المكان والزمان. تم إنشاء خرائط الحرارة الكثافة لتوطين الأحداث exocytic (الشكل 5D). هذه تكشف عن المتوقع تتجمع "النقاط الساخنة" في مناطق متميزة من الخلايا العصبية. بعد ذلك ، تم إجراء تحليل ريبلي K للسما ، neurite ، والتكتلات مع مرور الوقت(الشكل 5E). ترتفع قيمة ريبلي K و SEM (الخط الأسود والمنطقة المظللة الزرقاء على التوالي) فوق خط العشوائية المكانية الكاملة (الخط المنقط الأحمر) ، مما يشير إلى تجمع مهم إحصائيا.
الشكل 1: تمثيل التحليل والتصنيف الخارجيين. (أ) مخطط خط أنابيب التحليل ل GUI. يتم تقسيم الخلايا من الخلفية قبل تحديد الأحداث exocytic وتعقبها. يتم حساب المعلمات مثل ذروة ΔF / F و t1 /2 من آثار الفلورسنت من التقشير في عائد الاستثمار حول الحدث قبل وبعد الانصهار. (ب) توضيح لأربعة أنماط من exocytosis ومثال المونتاج الصورة. بعد الانصهار، قد تستمر الأحداث لحظيا إلى FVF أو KNR (FVFi و KNRi)، أو قد يكون هناك تأخير قبل بداية مصير الاندماج إلى FVF أو KNR (FVFd و KNRd). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خطوة بخطوة تحليل المثال. (أ) أولا، يتم اختيار مجموعات البيانات (1.، مربع أحمر)، ويتم اختيار دليل لوضع ملفات التحليل (2.، مربع أحمر). بعد ذلك، يتم تحديد معدل الإطارات وحجم البكسل (3.، المربع الأخضر). هنا، تم استخدام حجم بكسل 0.08 ميكرومتر ومعدل إطار 100 مللي ثانية. ثم يتم الضغط على زر وظيفة MaskMaker (4.، مربع أزرق). يتم إنشاء مجلد بعنوان "MaskFiles" تلقائيا في الدليل المختار الذي يحتوي على ملف قناع لكل ملف صورة في مجموعة البيانات. (ب) عند تحميل مجموعات البيانات، سيؤدي تحديد ملف بيانات و/أو ملف قناع إلى عرض الإطار الأول للصور لتسهيل المقارنة (المربع الأخضر). قد لا تكون ملفات القناع صحيحة تماما؛ فقد تكون ملفات الأقنعة صحيحة تماما؛ فقد تكون ملفات الأقنعة غير صحيحة تماما يمكن تصحيح ملف القناع هذا للأخطاء، أو قد يتم إجراء ملف قناع جديد يدويا الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إنشاء ملف قناع يدويا في ImageJ. (أ) أولا، افتح الملف لصنع قناع. يتم تحديد الزر "تحديدات المضلع" باللون الأحمر. بالنقر فوق حافة الخلية، يتم إنشاء مخطط تفصيلي للمضلع. (B) كيفية إنشاء قناع من المخطط التفصيلي للمضلع. بتحديد تحرير | | التحديد إنشاء قناع، سيتم إنشاء قناع أبيض وأسود من المضلع (الصورة اليمنى). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الأحداث exocytic. (أ) عرض توضيحي لزر التحليل (مربع برتقالي) وتحليل قيد التشغيل. لاحظ أن مؤشر التشغيل يتحول إلى اللون الأصفر أثناء إجراء تحليل. (B) ملفات تحليل المثال التي يتم إنشاؤها في الدليل المختار عند اكتمال التحليل. تحتوي DataFiles على كافة ملفات التحليل للحدث exocytic. (C) ملفات التحليل التي تم إنشاؤها في مجلد DataFiles. تمثل مربعات الألوان الملفات المفتوحة في الصور اللاحقة. (د) ثلاثة ملفات مفتوحة، "X_fluorescent_traces.csv" (أحمر) و "X_Cell_statistics" (أخضر)، و "X_tracking" (أزرق). تحتوي آثار الفلورسنت على موضع x وy ورقم الإطار لكل حدث ، بالإضافة إلى كثافة الفلورسنت في كل عائد استثمار. Cell_statistics يحتوي على معلومات موجزة عن الإحصاءات exocytic الخلية الكاملة مثل تواتر exocytosis. X_tracking يحتوي على معلومات الموضع والوقت لكل حدث exocytic وكذلك احتمال كل فئة من exocytosis لكل حدث، ممثلة كعدد بين 0-1 (>0.5 يشير إلى حدث ينتمي إلى فئة معينة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية. (أ)متوسط آثار مضان +/- SEM من كل فئة exocytic. (ب) وتيرة الأحداث المرسومة لثلاث خلايا عصبية القشرية مورين لكل فئة exocytic. تم رسم قيم البيانات هذه من "X_Cell_statistics" باستخدام الفئات المعينة في "X_tracking". (ج) توزيع فئات التقشير لنفس الخلايا الثلاث المستخدمة في A). هنا، يتم رسم نسبة كل وضع. (D) مؤامرة كثافة حيث تحدث الأحداث exocytic كما تم إنشاؤها في جزء تحليل K ريبلي من البروتوكول. ويمكن تفسير ذلك على أنه "خريطة حرارية" للاحتمالات المكانية للمكان الذي تحدث فيه الأحداث. (ه) تحليل ريبلي K من ثلاث خلايا تستخدم ل A) وباء). يشير الخط الأحمر إلى القيمة التي ستكون عليها التوزيع العشوائي المكاني للأحداث الإكسوسيتيكية. يشير السطر الأسود إلى القيمة K ريبلي التجميعي للخلايا الثلاث في هذا المثال، وتمثل المنطقة المظللة الزرقاء الفاصل الزمني الثقة. هنا، تقع المنطقة المظللة بشكل خاص خارج خط العشوائية المكانية الكاملة بين ~0.25-1 ميكرومتر، مما يشير إلى أن الأحداث الخارجية تتجمع عند تلك المسافات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند استخدام الكشف عن exocytic وتحليل البرمجيات ، يرجى النظر في أن البرنامج يقبل فقط ضغط فقدان .tif الملفات والمدخلات. قد تكون ملفات الصور .tif 8 بت أو 16 بت أو 32 بت الرمادي (قناة واحدة) الصور. يجب تحويل تنسيقات الصور الأخرى إلى أحد هذه الأنواع قبل الإدخال. كمرجع، الأمثلة المستخدمة هنا هي صور تدرج الرمادي 16 بت.
تتم معالجة مجموعات الصور الفاصلة زمنيا، المتأصلة في عملية الكشف الآلي، من أجل الطرح الآلي للخلفية وتصحيح bleaching. بالنسبة للطرح الخلفية، يتم متوسط وحدات البكسل خارج المنطقة المقنعة لملف القناع خلال الفاصل الزمني للصورة بأكملها، ويتم طرح متوسط القيمة من مجموعة الصور. لتصحيح photobleaching ، يتم تطبيق نوبة تسوس أحادي الأسي على متوسط الفلورسينس من بكسل في القناع على مدار الفيديو ، مع تعديل الكثافة المصححة على النحو التالي:
شدة تصحيح = (كثافة في وقت ر) ÷ إكسب ك×ت حيث ك = الاضمحلال ثابت
لذلك، لا يلزم معالجة مسبقة قبل الإدخال. هذه العمليات، ومع ذلك، تعتمد بشكل حاسم على قناع الصورة لفصل الخلية بشكل فعال من الخلفية، وبالتالي قناع الخلية المناسبة ضروري لتحقيق نتائج جيدة.
يتطلب منشئ قناع الخلية الآلي إشارة موحدة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية (من الناحية المثالية ، على الأقل 2x الانحراف المعياري لإشارة الخلفية المتوسطة) لأداء جيد. من الناحية التجريبية ، يعمل مربع CAAX الموسوم ببروتين فلوري ، والذي يدخل في غشاء البلازما عند ما قبل االتكميل ، بشكل جيد. ليس هناك شرط أن الإشارة يمكن الحفاظ عليها طوال الوقت الفاصل التصوير من exocytosis، كما يمكن إنشاء قناع مناسب من إشارة عالية في الأطر 10 الأولى من التسلسل. ومع ذلك ، إذا تغير مورفولوجيا الخلية بشكل كبير أثناء نموذج التصوير ، فيجب توخي الحذر.
عند استخدام برنامج الكشف الآلي، قم بتضمين معدل الإطار وحجم البكسل للحصول على مخرجات زمنية ومكانية دقيقة. إذا لم يتم تعريف حجم الإطار أو بكسل، سيكون الإخراج لكل بكسل وكل إطار. كقاعدة عامة، أقطار الحويصلات في تطوير الخلايا العصبية هي على مقياس ~ 100 نانومتر13،وبالتالي الكشف الآلي للأحداث قد تعمل ل vesicles مماثلة في الحجم. كما هو الحال ، لا يوجد حد صعب لحجم الحويصلات التي يمكن اكتشافها (حسب منطقة البكسل) ، حيث يعتمد الكشف الآلي على كثافة على شكل جاوسي على مجموعة كبيرة من العروض الغاوسية. يمكن الكشف عن دمج الحويصلات الأصغر من عرض البكسل بدقة إذا كانت شدة الحدث تفي بمعايير الإشارة إلى الضوضاء ل 2x الانحراف المعياري لإشارة الخلفية المتوسطة مع توسع الحيود الفلوري عبر وحدات بكسل متعددة.
تم تطوير هذا البرنامج للكشف عن الأحداث الخارجية في تطوير الخلايا العصبية. ومع ذلك ، تم استغلال البرنامج للكشف بنجاح عن الأحداث exocytic في خطوط الخلية الأخرى2، مما يشير إلى أن خوارزمية الكشف قوية. على الرغم من أننا استخدمنا البرنامج للكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية في أنواع الخلايا غير العصبية، تشير الاختلافات في وضع الحدث ال exocytic بين أنواع الخلايا14 إلى أن خوارزمية التصنيف قد لا تكون مناسبة لأنواع الخلايا الأخرى. تم تصنيف الأحداث Exocytic في تطوير الخلايا العصبية أصلا باستخدام ثلاث طرق مختلفة: التجمع الهرمي، تزييف الوقت الديناميكي، وتحليل المكون الرئيسي (PCA)، والكشف عن أربع فئات مختلفة3. هنا يتم توظيف جميع المصنفين الثلاثة في واجهة المستخدم الرسومية لتصنيف الأحداث exocytic في واحدة من هذه الفئات الأربع المنشأة. لكل حدث exocytic يتم تعيين درجة احتمال بين 0-1 لكل من الفئات الأربع المحتملة. أي فئة مع احتمال درجة > 0.5 يعتبر أن تكون من تلك الفئة. وقد استخدم هذا التصنيف فقط في تطوير الخلايا العصبية حتى الآن. لا يعرف ما إذا كانت هذه الفئات موجودة في أنواع الخلايا الأخرى أو في وقت لاحق نقاط وقت النمو في الخلايا العصبية. ويشير عدد كبير من الأحداث التي قد تصل درجات الاحتمال فيها إلى <0.5 لأي من الفئات إلى أن إجراء التصنيف قد لا يكون مناسبا للأحداث الخارجية التي يجري تقييمها حاليا. إذا تم تعيين درجات الاحتمال المنخفض للأحداث exocytic من أنواع الخلايا المختلفة، وهذا من شأنه أن يوحي بأن هناك حاجة إلى تصنيف دي نوفو كما وسائط جديدة أو بديلة من exocytosis قد تكون موجودة. وينبغي تطبيق نفس أساليب التصنيف المستخدمة هنا على الأحداث الإكسوسيتيكية التي يتم اكتشافها تلقائيا.
لاستكشاف التجمع المكاني والزمني للأحداث exocytic ، يتم استغلال تحليل ريبلي K15. تحليل التجمع للخلايا العصبية ينطوي على ثلاثة تحليلات منفصلة: واحد للسما، واحد للنيوريتس، وواحد للوقت. السبب في تقسيم سوما ونيوريتس هو لحساب مورفولوجيا المتطرفة من neurites، والتي غالبا ما تكون رقيقة بما فيه الكفاية بحيث يمكن التعامل معها كشبكة 2D وتطبيق البديل 2D من تحليل ريبلي K. للوقت ، يتم تنفيذ تحليل K ريبلي 1D للتكتل الزمني. تحليل ريبلي K هو طريقة قوية للكشف عن تجميع عمليات النقطة والتكتل. يمكن تفسير الرسم البياني ل Ripley's K على هذا النحو: قيمة ريبلي K + الفاصل الزمني للثقة لديه فرصة 5٪ للسقوط خارج خط العشوائية المكانية الكاملة في أي نقطة ، على غرار قيمة p من 0.05. عندما تقع القيمة خارج خط العشوائية المكانية الكاملة، يتم تجميع الأحداث الخارجية (فوق CSR) أو يتم فصلها على فترات منتظمة (أسفل CSR) عند تلك المسافات (المحور س).
يعتمد إنشاء ملف القناع على إشارة أولية عالية إلى ضوضاء الخلية. قد لا تؤدي العلامات الحساسة لhh دائما أداء جيدا في إضاءة الخلية ، اعتمادا على البروتين الذي يرتبط به المسبار. خيار آخر لصنع ملفات قناع إذا كانت إشارة إلى ضجيج علامة exocytic يسلط الضوء على حد الخلية بشكل غير كاف هو توظيف قناة الفلورسنت الثانية / صورة لخلق قناع. إذا كنت تستخدم علامة مضان مختلفة (tagRFP-CAAX، على سبيل المثال) لصنع أقنعة، عند اختيار مجموعة بيانات، انتقل أولا إلى المجلد مع الصور لصنع أقنعة من (على سبيل المثال، مجلد يحتوي على tagRFP-CAAX الصور). استخدم زر صانع القناع هنا. الأهم من ذلك، تذكر إعادة تسمية ملفات القناع لمطابقة ملف البيانات exocytic ليتم تحليلها مع نظام التسمية أعلاه (على سبيل المثال أعلاه، ملفات قناع اسمه "CAAX_1_mask_file.tif" سوف تحتاج إلى إعادة تسمية إلى "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" لتتناسب مع مجموعة الصور VAMP2 ليتم تحليلها). بمجرد تسمية ملفات القناع بشكل مناسب، ارجع إلى الزر اختيار مجموعة البيانات مرة أخرى للانتقال إلى ملفات مجموعة البيانات الخارجية لتحليلها.
الكشف عن الإصابة بالتشوه الخارجي حساس بشكل ملحوظ ، وتم اكتشاف الأحداث الخارجية بدقة بنسب إشارة إلى ضوضاء منخفضة مثل ΔF / F من 0.01. تعتمد حساسية الكشف جزئيا على تباين الفلورسينس الخلفية، ولن يتم الكشف عن الأحداث التي تقل عن 4 انحرافات معيارية فوق إشارة الخلفية.
يعتمد الكشف عن الأحداث الإكسوسية على طبيعتها العابرة. كميزة لتحليل الأحداث العابرة، تستكشف رمز الكشف لدينا نافذة 20 ثانية حول الحدث exocytic. في بعض أنواع الخلايا، قد "يبقى" التناضح قبلة والبقاء لفترة زمنية أطول بكثير مما هو عليه في تطوير الخلايا العصبية، وقد لا يلتقط الكشف الآلي هذه الأحداث الأقل عابرة بقوة. هذه الميزة هي متغير قابل للتعديل بسهولة لأولئك الذين يشعرون بالراحة مع MATLAB. على غرار الحد من العائد على الاستثمار 20 ثانية، قد لا تحسب الأحداث exocytic التي تظهر ولكن لا تختفي قبل الإطار الزمني الأخير من الفيديو كما exocytosis الحقيقي، والتي قد تؤثر على التردد، الذي يحسب على أساس طول السلسلة الزمنية بأكملها.
صانع قناع المدرجة الآلي حسب التصميم ويؤدي بشكل جيد على تقسيم الأشكال المعقدة من الخلفية؛ ومع ذلك، يحد التصميم المؤتمت بالكامل من نطاق نوع الإشارة إلى الضوضاء والإشارة التي يمكن استخدامها لإنشاء قناع تلقائيا. إذا كان المستخدم لا يمكن أن تشمل علامة الخلية الفلورية التي هي موحدة ونسبة إشارة إلى الضوضاء كبيرة، قناع الخلية سوف تحتاج إلى رسمها يدويا.
التحليل القائم على المستخدم للإفراز هو عملية تستغرق وقتا طويلا ويخضع للتحيز الشخصي ، حيث لا يتم فصل الأحداث دائما بوضوح عن الفلورسينس الأخرى. استخدام برنامج التحليل الآلي لتحديد وتحليل الأحداث الخارجية بشكل صحيح بطريقة غير متحيزة يزيد من كفاءة التحليل ويحسن القابلية للاستنساخ والصرامة.
لا يعمل هذا الكشف عن الأحداث الإفرازية على التقاط الفلورة الحساسة لhH بدقة في تطوير الخلايا العصبية فحسب ، بل يعمل أيضا على أنواع الخلايا الأخرى (Urbina et al.، 2018). ما إذا كان التصنيف يعمل لأنواع الخلايا الأخرى سيتطلب تحديد. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قد تكون مفيدة في نقاط الاشتباك العصبي، في أنواع الخلايا غير العصبية، أو مع علامات جديدة من الالتحام الحويص exocytic والانصهار، مثل pHmScarlet وصف مؤخرا16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي شيء يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر داستن ريفيل وريجنالد إدواردز لاختبار رمز واجهة المستخدم الرسومية. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة التي دعمت هذا البحث: بما في ذلك R01NS112326 (SLG) وR35GM135160 (SLG) وF31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
