Automatiseret påvisning og analyse af exocytose

Summary

Vi udviklede automatiseret computer vision software til at opdage exocytiske hændelser præget af pH-følsomme fluorescerende sonder. Her demonstrerer vi brugen af en grafisk brugergrænseflade og RStudio til at registrere fusionshændelser, analysere og vise spatiotemporale parametre for fusion og klassificere hændelser i forskellige fusionstilstande.

Abstract

Timelapse TIRF mikroskopi af pH-følsomme GFP (pHluorin) knyttet til vesikel SNARE proteiner er en effektiv metode til at visualisere enkelt vesikel exocytiske begivenheder i cellekulturen. For at udføre en upartisk, effektiv identifikation og analyse af sådanne hændelser blev der udviklet og implementeret en computervisionsbaseret tilgang i MATLAB. Analysepipelinen består af en cellesegmentering og en algoritme til identifikation af exocytiske begivenheder. Computersynsmetoden omfatter værktøjer til undersøgelse af flere parametre for enkelthændelser, herunder halveringstid for fluorescens henfald og peak ΔF/F samt helcelleanalyse af hyppigheden af exocytose. Disse og andre fusionsparametre anvendes i en klassificeringsmetode til at skelne mellem forskellige fusionstilstande. Her udfører en nybygget GUI analysepipeline fra start til slut. Yderligere tilpasning af Ripleys K-funktion i R Studio bruges til at skelne mellem grupperet, spredt eller tilfældig forekomst af fusionshændelser i både rum og tid.

Introduction

VAMP-pHluorin konstruerer eller transferrin receptor (TfR)-pHuji konstruktioner er fremragende markører for exocytiske begivenheder, da disse pH-følsomme fluorophorer slukkes i syre vesikel lumen og fluoresce umiddelbart efter fusion pore åbning mellem vesikel og plasmamembran¹. Efter fusion pore åbning, henfalder fluorescens eksponentielt, med en vis heterogenitet, der afslører oplysninger om fusion begivenhed. Her beskrives et grafisk brugergrænsefladeprogram, der automatisk registrerer og analyserer exocytiske hændelser. Denne applikation giver brugeren mulighed for automatisk at registrere exocytiske hændelser afsløret af pH-følsomme markører² og generere funktioner fra hver hændelse, der kan bruges til klassificeringsformål³ (Figur 1A). Derudover beskrives analyse af exocytisk hændelsesklynge ved hjælp af Ripleys K-funktion.

Den automatiserede klassificering af exocytiske hændelser i forskellige exocytiske tilstande blev for nylig rapporteret³. To former for exocytose, fuld-vesikel fusion (FVF) og kys-og-run fusion (KNR) exocytose er tidligere blevet beskrevet^4,5,6,7. Under FVF udvides fusionsporen, og vesikel er indarbejdet i plasmamembranen. Under KNR åbner fusionsporen forbigående og reseals^4,5,8,9,10. Fire former for exocytose blev identificeret i udviklingen af neuroner, to relateret til FVF og to relateret til KNR. Dette arbejde viser, at både FVF og KNR yderligere kan opdeles i fusion begivenheder, der går straks til fluorescens henfald (FVFi og KNRi) efter fusion pore åbning eller exocytiske begivenheder, der udviser en forsinkelse efter fusion pore åbning før fluorescens henfald begynder (FVFd og KNRd) (Figur 1B). Klassificeringen identificerer exocytosemåden for hver fusionshændelse. Her er denne analyse blevet indarbejdet i en GUI, der kan installeres i MATLAB i Windows- og Mac-baserede operativsystemer. Alle analysefiler kan findes på https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.

Protocol

1. Vælg datasæt og mappe

1. Hvis du vil vælge datasæt til analyse, skal du klikke på knappen Søg efter datasæt (Figur 2A, rød boks 1) for at navigere til den mappe, hvor data deponeres (f.eks. mappen RawData). Datafiler udfylder automatisk datafilerne som en liste. Der kan være mere end ét datasæt i mappen.
2. Klik på knappen Vælg mappe, og vælg den mappe (f.eks. test), hvor analyserede filer skal deponeres (Figur 2A, rød boks 2) . Der oprettes et sæt mapper og færdige analysefiler samt midlertidige mellemliggende billeder i denne mappe, når der trykkes på knappen Analyse. Der opstår fejl, hvis der ikke vælges en mappe.

2. Angiv pixelstørrelse og billedhastighed

1. Udfyld den relevante billedhastighed og pixelstørrelse for billederne i den relevante boks "Framerate" eller "pixel size"(Figur 2A, grøn boks). Hvis der ikke angives værdier (de er angivet til standard "0"), søges der i de metadata, der er knyttet til filen, efter framerate og pixelstørrelse. Hvis disse værdier ikke kan findes, vil programmet som standard pr. pixel for måling og pr. ramme for tidspoint.
   BEMÆRK: I det angivne eksempel er billedhastigheden 100, og pixelstørrelsen er 0,08.

3. Vælg eller lav masker

1. Brug knappen Mask maker til automatisk at oprette cellemasker til dataene på listen over fildatasæt (Figur 2A, blå boks). Når du bruger knappen Mask Maker, oprettes der en ny mappe i den valgte mappe med navnet MaskFiles. Indikatoren "Kør" bliver gul, mens den kører, og vender tilbage til grøn, når den er fuldført.
   BEMÆRK: Der oprettes en maske for hver fil på listen Datafiler ud fra de første 10 rammer i billedfilen (eller fra alle rammerne, hvis der er mindre end 10 i billedfilen) og deponeres i mappen MaskFiles ved hjælp af det korrekte navngivningsskema (beskrevet nedenfor).
2. Kontroller, at maskefilerne automatisk udfylder listen Maskefiler. Brugeren kan gå direkte til analysen.
   BEMÆRK: Kontroller altid maskefiler visuelt, og bekræft, at de fanger hele interesseområdet. Den første ramme i datafilen og maskefilen vises i brugergrænsefladen, når den er valgt. (Figur 2B). Mask Maker kan forårsage fejl i tilfælde af lav signal-til-støj, så validering af, at maskefiler er passende, er afgørende for kvalitetskontrol.
3. Hvis signalet til støj fra billeder er utilstrækkeligt, kan du som et alternativ til at bruge Mask Maker oprette masker manuelt i ImageJ.
   1. Åbn først den rå billedfil i ImageJ (Figur 3A).
   2. Klik på knappen Polygonmarkering, og klik for at tegne en maske rundt om cellen. Når du er færdig, skal du dobbeltklikke på det sidste punkt for at fuldføre polygonen.
   3. Når du er færdig, skal du gå til Rediger | Valg | Opret maske (Figur 3B). Der oprettes en ny omvendt maske baseret på polygontegningen. Gem masker i en angivet MaskFiles-mappe i den valgte mappe. Navngivningsskemaet for maskefilen skal svare til de tilsvarende individuelle datafiler efterfulgt af "_mask_file". Hvis en data VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif VAMP2_488_WT_1.tif fil f.eks.
   4. Brug knappen Find maskefiler til at navigere til den valgte mappe med deponerede brugerdefinerede maskefiler. Maskerne udfylder maskefilerne som en liste.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at have en maske for hver datafil, før analysen køres.

4. Analyse og funktionsudtræk

1. Når mappen er valgt, og listen Datafiler og listen Maskefiler er udfyldt, skal du klikke på knappen Analyse (Figur 4A). Hvis klassificeringen af exocytiske hændelser er påkrævet, skal du gå til trin 5.
   BEMÆRK: Knappen Analyse skal du klikke på en række automatiserede opgaver for at analysere dataene. Det opretter individuelle mapper i den valgte mappe for at deponere analyserede data. Under kørsel ændres "run indicator" fra grøn til gul (Figur 4A, rød boks). Når analysen er færdig, vil dette skifte tilbage til grøn.
2. Find en datafilmappe (Figur 4B) med det komplette sæt analysefiler (samt funktionsudtræksfiler, der skal bruges i klassificering senere) navngivet i henhold til hver datafil (Figur 4C).
   BEMÆRK: En beskrivelse af disse analysefiler er medtaget nedenfor i afsnittet Repræsentative resultater.

5. Klassificering af exocytiske hændelser

1. Hvis du vil udføre samtidig klassificering af exocytiske hændelser med automatisk registrering, skal du markere afkrydsningsfeltet Klassifikation, før du klikker på knappen Analyse. For hver exocytisk hændelse skal du tildele en sandsynlighedsscore mellem 0-1 for hver klasse. En exocytisk hændelse betragtes som klassificeret som en af de fire klasser, hvis sandsynlighedsscoren for den pågældende klasse er > 0,5.
   BEMÆRK: Når analysen er færdig, vises en ny datafilmappe i den valgte mappe. Mappen indeholder analysefiler, der svarer til hver billedfil.

6. Spatiotemporal analyse af exocytose ved hjælp af Ripley's K værdier

1. Opret en separat "neurite" og "soma" maskefil. Først segmenter soma fra neuritten. Der er ingen upartisk metode til segmentering af soma fra neuritterne, så brugeren skal blændes til konditioneringseksperimentet og bruge den bedste dømmekraft; en ellipsoid uden åbenlyse neuritudvidelser foreslås.
2. Åbn ImageJ/Fiji.
3. Træk og slip maskefilen, eller brug fil | Åbn og vælg derefter maskefilen.
4. Brug farvevælgerværktøjet, og klik på en af de sorte pixel i maskens baggrund for at indstille farven til sort.
5. Brug polygonmarkeringsværktøjet eller frihåndsværktøjet til at tegne en kontur omkring somaen og adskille den fra neuritterne. Dette kræver manuel beslutningstagning.
6. Klik på Rediger | Valg | Lav maske. Et nyt billede vil åbne med den cirkelde soma segmenteret fra resten af billedet. Dette opretter en soma-maskefil.
7. Uden at flytte det tegnede område skal du klikke på overskriften på den oprindelige maskefil.
8. Klik på Rediger | Fyld for at udfylde den cirkelde soma, så kun neuritterne forbliver masken.
9. Når der er hentet separate neurite- og maskefiler, skal du gemme begge maskefiler.
10. Åbn "neurite_2D_network" i Matlab.
11. I MATLAB skal du navigere til mappen med alle analysedata.
12. Ret stien "maskenavn" til navnet på neuritemasken VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif, dvs.
13. Ret "csv_file_name" til det VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv fluorescent_traces.csv, dvs.
14. Klik på Kør for at gøre neuritemaskefilen til skeletter. Dette opretter en skelettet version af neuritemaskefilen og deponerer den som en CSV-fil under mappen med maskefiler.
15. Opret derefter en CSV-fil til soma. Åbn "CSV_mask_creator.m" i Matlab.
16. Sæt stien til "maskenavnet" ind til navnet på soma-masken, dvs VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Ret "writematrix" til csv-filnavn, der skal oprette VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv s, dvs.
18. Klik på Kør. Derved oprettes den nye VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv fil.
19. Gentag 6.14 for hver maskefil.

7. RStudio opsætning

1. Åbn Rstudio og åbn ripleys_k_analysis. R-fil.
2. Installer pakken "spatstat" i RStudio ved at gå til Tools | Installer pakker, og skriv "spatstat" efterfulgt af et klik på Installer.
   BEMÆRK: Dette skal kun udføres én gang pr. Rstudio-installation.
3. Kør biblioteksspatten i begyndelsen af hver session.
4. Vær opmærksom på to hovedvariabler i dette tilfælde: "neuron_mask" og "neuron_datapoints.". Neuron Mask peger på det sæt af maske filer til at køre, dvs soma maske filer.
   BEMÆRK: Kør alle soma maskefiler sammen, adskilt fra Neurite-maskefiler og omvendt.
5. Læs i .csv af maskefilerne for hver af de neuroner, der skal analyseres.
6. Kør flere filer på én gang ved at kopiere yderligere neuron_mask_n+1. Dette vil gøre det muligt at samle Ripley's analyse sammen, ved hjælp af scriptet er beskrevet i afsnit 8.
7. Tjek nu den anden variabel, "neuron_datapoints".
8. Læs i." X_fluorescent_traces.csv"-fil, der genereres af analyseprogrammet (efter funktioner i alle extracted_R fil) med x,y,t-positionerne for de exocytiske hændelser samt den neuritspecifikke fil for x,y-positionerne for 2D-netværket. Dette går i "neuron_datapoints" position.
9. Vælg kode | i RStudio Kør område | Kør alle. Dette genererer flere plots, herunder de grupperede Ripley's K værdier samt tæthed plots.
10. Gem parceller ved at gå til Eksporter | Gem billede som | Vælg det relevante billedformat og den relevante mappe, og indtast det relevante filnavn, og klik derefter på Gem.
    BEMÆRK: Plottefunktionen for varmekortene kaldes i scriptet ved hjælp af "plot(density(soma_data,0.4))". Tallet "0,4" her repræsenterer, hvor udjævnet tæthedsfunktionen skal være. Det kan ændres, så det passer til brugerdata på en meningsfuld måde, men hvis sammenligninger skal udføres mellem forskellige heatmaps, skal tallet være det samme mellem dem.
11. Eksporter eller gem billede fra Rstudio. Hvis en varmemap kræver yderligere redigering, skal du vælge en passende filtype (SVG eller EPS).

8. Ripleys analyse

BEMÆRK: Den Ripleys_k_analysis. R-filen genererede også automatisk Ripleys k-værdiplot. Kørsel af hele scriptet kører automatisk de funktioner, der er nævnt nedenfor, men det er inkluderet i detaljer, hvis man ønsker at køre hver del af scriptet individuelt eller foretage ændringer i analysen.

1. Kør først konvolutfunktionen for hver celle. Denne funktion simulerede fuldstændig rumlig tilfældighed (CSR) for at teste Ripleys K-værdi af det exocytiske hændelsespunktmønster i forhold til.
   Data_envelope_1 = konvolut(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = SAND)
   Data_envelope_2 = konvolut(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = SAND)
2. Derefter skal du samle disse konvolutter og oprette et estimat af CSR for gruppen:
   Pool_csr = pulje(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Kør derefter Ripleys K-funktion for alle datapunkter.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, forhold = SAND)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, forhold = SAND)
3. Når du er færdig, skal du samle Ripleys K-værdier og bootstrap deres konfidensintervaller med følgende kommando:
   Datapulje = pulje(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Bootstrap med følgende kommando:
   Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
5. Plotte dataene.
6. Hvis der kræves en hård statistisk forskel, er Studenteret Permutationstest inkluderet i spatstat-pakken for at teste for en forskel mellem grupper af punktmønstre:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ gruppe, nperm = np).

Representative Results

Her GUI (Figur 2A) blev udnyttet til at analysere exocytiske begivenheder fra tre VAMP2-pHluorin udtrykke neuroner på 3 DIV ved hjælp af TIRF (total intern refleksion fluorescens) mikroskopi. E15.5 kortikale neuroner blev isoleret, efterfulgt af transfekt med VAMP2-pHluorin og plating ved hjælp af protokollerne som skitseret i Winkle et al., 2016 og Viesselmann et al., 2011^11,12. Metoden til billeddiagnostiske parametre er som beskrevet i Urbina et al., 2018². Kort sagt, TIRF mikroskopi blev brugt til at billedet den basale plasmamembran af neuroner hver 100 ms i 2 min. Figur 2, Figur 3, Figur 4 viser en trin-for-trin guide til at analysere exocytiske hændelser. Den mappe, hvor neuronbillederne er placeret, er valgt, og der vælges en mappe til deponering af de endelige analysedatafiler (Figur 2A). Ved hjælp af MaskMaker-funktionen genereres en maske for neuronerne, som inspiceres i GUI (Figur 2B). I dette tilfælde er cellemasken af god kvalitet, og analysen kan fortsætte. Hvis en maske er utilstrækkelig, kan der oprettes en maske i ImageJ (Figur 3). Når du har brugt funktionen MaskMaker eller oprettet en maske i ImageJ og valgt den mappe, hvor maskefilerne er placeret, udføres analysen (Figur 4A). Resultaterne genereres i mappen DataFiles, når analysen er færdig (den gule indikator skifter tilbage til grøn) (Figur 4B).

Datafiler genereres automatisk og navngives i henhold til de leverede rå datafiler.

Hvis datafilen hedder X:

X_tracking: Denne fil indeholder x,y placering og rammenummer for hver hændelse samt afgrænsningsrammer, som kan bruges til at tegne bokse omkring hver hændelse. Alder angiver antallet af rammer forbi den første detektion, hvor en begivenhed er en tydelig gaussisk punktvista. Hvis klassificeringen kontrolleres, vises klassifikationsresultaterne i denne fil, hvilket angiver sandsynligheden for en exocytisk hændelse, der tilhører en af fire klasser. Hvis sandsynligheden er større end 0,5 og større end andre sandsynligheder, blev der valgt en exocytisk klasse.

X_fluorescent spor: Denne fil indeholder x,y-placering og rammenummer for hver hændelse. Derudover omfatter den fluorescerende intensitetsmål i et område af interesse omkring hver begivenhed 2 sekunder før og 10 sekunder efter toppen ΔF/F for hver hændelse (angivet med Timepoint-kolonnerne).

X_cell_statistics: Denne fil indeholder celleområdet, den samlede billedtid og den automatisk beregnede hyppighed af exocytiske hændelser for hver celle (i hændelser/mm²/minute).

Filer til udpakning af funktioner omfatter:

X_contrast: Kontrast. Et mål for intensitetskontrasten mellem en pixel og naboen over hele billedet.

X_correlation: Korrelation. Et mål for, hvordan korreleret en pixel er til sin nabo over hele billedet.

X_energy Energi i alt. Defineret som den kvadrerede sum af pixelintensiteten.

X_homogeneity måler nærheden af fordelingen af elementer i investeringsafkastet til ROI diagonalen.

X_ring_fluorescence: den gennemsnitlige fluorescens af kantpixel.

X_SD: Standardafvigelse. Dette defineres som standardafvigelsen for investeringsafkastet.

Eksempler på gennemsnitlige fluorescensspor ± SEM fra hver exocytisk klasse blev afbildet ud fra X_fluorescent sporfil (Figur 5A). Ved hjælp af Cell_statistics fil blev hyppigheden af exocytose for hver klasse afbildet for hver neuron (Figur 5B). Når afkrydsningsfeltet Klassifikation er markeret, tildeles hver exocytisk hændelse til en klasse, afbildet i Figur 5C. Efter klassificeringen blev Ripleys K-analysekode brugt til at afgøre, om exocytiske hændelser er tilfældige, grupperede eller spredt i tid og rum. Der blev genereret tæthedsvarmekort over lokaliseringen af exocytiske hændelser (figur 5D). Disse afslører forventede grupperede "hotspots" i forskellige regioner af neuron. Dernæst blev Ripleys K-analyse udført for soma, neurite og klyngedannelse over tid (Figur 5E). Ripleys K-værdi og SEM (henholdsvis sort linje og blåt skyggeområde) hæver sig over linjen med fuldstændig rumlig tilfældighed (rød stødlinje), hvilket tyder på statistisk signifikant klyngedannelse.

Figur 1: Repræsentation af exocytisk analyse og klassificering. Celler segmenteres fra baggrunden, før exocytiske hændelser identificeres og spores. Parametre som peak ΔF/F og t_1/2 beregnes ud fra fluorescerende spor af exocytose i et investeringsafkast omkring hændelsen før og efter fusion. (B) illustration af de fire former for exocytose og eksempel billedmontage. Efter fusion kan begivenheder fortsætte øjeblikkeligt til FVF eller KNR (FVFi og KNRi), eller en forsinkelse kan være til stede før starten af fusion skæbne til FVF eller KNR (FVFd og KNRd). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Trinvis eksempelanalyse. (A) Først vælges datasæt (1., rød boks), og der vælges en mappe til at placere analysefiler (2., rød boks). Derefter angives billedhastigheden og pixelstørrelsen (3., grøn boks). Her blev der brugt 0,08 μm pixelstørrelse og 100 ms framerate. Derefter trykkes der på funktionsknappen MaskMaker (4., blå boks). Der oprettes automatisk en mappe med navnet "MaskFiles" i den valgte mappe, der indeholder en maskefil for hver billedfil i datasættet. (B) Når datasæt indlæses, viser valg af en datafil og/eller maskefil den første ramme af billederne, så det er nemt at sammenligne dem (grøn boks). Maskefiler er muligvis ikke helt korrekte. Denne maskefil kan rettes for fejl, eller der kan oprettes en ny maskefil manuelt Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Figur 3: Oprette en maskefil manuelt i ImageJ. (A) Åbn først filen for at oprette en maske. Knappen "Polygonmarkeringer" er angivet med rødt. Ved at klikke rundt om cellens kant oprettes en polygonkontur. (B) Sådan oprettes en maske ud fra polygondispositionen. Ved at vælge Rediger | Valg |  Opret maske, oprettes en sort-hvid maske ud fra polygonen (højre billede). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Analyse af exocytiske hændelser. Bemærk, at kørselsindikatoren bliver gul, mens der udføres en analyse. (B) Eksempel på analysefiler, der oprettes i den valgte mappe, når analysen er fuldført. DataFiles indeholder alle analysefiler af den exocytiske hændelse. (C) Analysefiler, der er oprettet i mappen DataFiles. Farvebokse repræsenterer de åbne filer i efterfølgende billeder. d) Tre ufiler, "X_fluorescent_traces.csv" (rød) og "X_Cell_statistics"(grøn) og "X_tracking" (blå). Fluorescerende spor indeholder x,y position og rammenummer for hver hændelse samt fluorescerende intensitet ved hvert investeringsafkast. Cell_statistics indeholder sammenfattende oplysninger om fuldcelle exocytiske statistikker såsom hyppigheden af exocytose. X_tracking indeholder positions- og klokkeslætsoplysninger for hver exocytisk hændelse samt sandsynligheden for hver klasse af exocytose for hver hændelse, repræsenteret som et tal mellem 0-1 (>0,5 angiver, at en hændelse tilhører en bestemt klasse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Repræsentative resultater. (A)Gennemsnitlige fluorescensspor +/- SEM fra hverexocytisk klasse. Disse dataværdier blev afbildet fra "X_Cell_statistics" ved hjælp af de klasser, der er tildelt i "X_tracking". (C) Fordeling af exocytoseklasserne for de samme tre celler, der anvendes i A). Her afbildes forholdet mellem hver tilstand. (D) Tæthedsplot for, hvor der forekommer exocytiske hændelser som genereret i Ripleys K-analysedelen af protokollen. Dette kan fortolkes som et "varmekort" over den rumlige sandsynlighed for, hvor hændelserne finder sted. (E)Ripleys K-analyse af tre celler, der anvendes til A) og B). Den røde linje angiver, hvilken værdi helt rumligt tilfældig fordeling af exocytiske hændelser ville være. Den sorte linje angiver den samlede Ripleys K-værdi for de tre celler i dette eksempel, og det blå skraverede område repræsenterer konfidensintervallet. Her falder den skraverede region især uden for linjen med fuldstændig rumlig tilfældighed mellem ~ 0,25-1 μm, hvilket tyder på, at exocytiske begivenheder er grupperet på disse afstande. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Når du bruger den exocytiske detektions- og analysesoftware, skal du overveje, at programmet kun accepterer tabsfri komprimering .tif filer som input. De .tif billedfiler kan være 8-bit, 16-bit eller 32-bit gråtonebilleder (enkeltkanalsbilleder). Andre billedformater skal konverteres til en af disse typer, før der indtastes. Som reference er eksempler, der bruges her, 16-bit gråtonebilleder.

Tidslapsbilledsættene, der er indbygget i den automatiserede detektionsproces, behandles til automatisk baggrundstraktion og fotobleachingkorrektion. I forbindelse med baggrundsfratraktion beregnes gennemsnittet af pixel uden for maskefilens maskerede område over hele billedets tidslaps, og gennemsnitsværdien trækkes fra billedsættet. Til photobleaching-korrektion påføres en mono eksponentiel henfaldstilpasning på den gennemsnitlige fluorescens af pixels i masken i løbet af videoen, med den korrigerede intensitet justeret som følger:

Korrigeret intensitet = (Intensitet på tidspunktet t) ÷ exp-k×t hvor k = henfald konstant

Derfor er det ikke nødvendigt at forbehandle, før der indtastes. Disse processer er imidlertid kritisk afhængige af billedmasken for effektivt at adskille cellen fra baggrunden, og derfor er en ordentlig cellemaske nødvendig for gode resultater.

Den automatiserede cellemaskeskaber kræver et ensartet signal med et tilstrækkeligt signal-til-støj-forhold (ideelt set mindst 2x standardafvigelsen for det gennemsnitlige baggrundssignal) for at fungere godt. Empirisk fungerer CAAX-boksen mærket med et fluorescerende protein, som indsættes i plasmamembranen ved ægtepagtning, godt. Der er ikke noget krav om, at signalet kan opretholdes gennem hele timelapse imaging af exocytose, da en passende maske kan oprettes fra et højt signal i de første 10 rammer af sekvensen. Men hvis cellen morfologi ændrer sig betydeligt i løbet af billeddannelse paradigme, bør man være forsigtig.

Når du bruger den automatiserede detektionssoftware, skal du inkludere framerate og pixelstørrelsen for nøjagtige tidsmæssige og rumlige udgange. Hvis der ikke erklæres nogen framerate- eller pixelstørrelse, vil outputtet være pr. pixel og pr. ramme. Som tommelfingerregel er vesikeldiametre i udviklingen af neuroner på skalaen ~ 100 nm¹³, og dermed kan automatiseret detektion af begivenheder fungere for vesikler af samme størrelse. Som det ser ud, er der ingen hård grænse for størrelsen af vesikler, der kan detekteres (efter pixelområde), da automatiseret detektion er afhængig af gaussisk-formet intensitet over en lang række gaussiske bredder. Fusion af vesikler, der er mindre end bredden af en pixel, kan registreres nøjagtigt, hvis intensiteten af hændelsen opfylder signal-til-støj-kriterierne på 2x standardafvigelsen for det gennemsnitlige baggrundssignal, efterhånden som fluorescensdiffraktionen udvides over flere pixels.

Dette program blev udviklet til at opdage exocytiske begivenheder i udviklingen af neuroner. Softwaren er dog blevet udnyttet til at registrere exocytiske hændelser i andre cellelinjer², hvilket indikerer, at detektionsalgoritmen er robust. Selvom vi har brugt softwaren til at detektere exocytiske hændelser i ikke-neuronale celletyper, indikerer forskelle i exocytisk hændelsestilstand mellem celletype^14, at klassificeringsalgoritmen muligvis ikke er egnet til andre celletyper. Exocytiske hændelser i udviklingen af neuroner blev oprindeligt klassificeret ved hjælp af tre forskellige metoder: Hierarkisk klyngedannelse, Dynamisk tidskvakling og hovedkomponentanalyse (PCA), der afslører fire forskellige klasser³. Her er alle tre klassificeringer ansat i GUI til at kategorisere exocytiske begivenheder i en af disse etablerede fire klasser. For hver exocytisk hændelse tildeles en sandsynlighedsscore mellem 0-1 for hver af de fire mulige klasser. Enhver klasse med en sandsynlighedsscore > 0,5 anses for at være af den pågældende klasse. Denne klassificering er kun blevet brugt til at udvikle neuroner til dato. Hvorvidt disse klasser findes i andre celletyper eller på senere udviklingsmæssige tidspunkter i neuroner vides ikke. Et stort antal hændelser med sandsynlighedsscores på <0,5 for nogen af klasserne tyder på, at klassificeringsproceduren muligvis ikke er passende for de exocytiske hændelser, der i øjeblikket evalueres. Hvis der tildeles lave sandsynlighedsscores til exocytiske hændelser af forskellige celletyper, tyder dette på, at de novo-klassificering er nødvendig, da der kan eksistere nye eller alternative exocytosemåder. De samme klassifikationsmetoder, der anvendes her, skal anvendes på de automatisk fundne exocytiske hændelser.

For at udforske den rumlige og tidsmæssige klyngedannelse af exocytiske begivenheder udnyttes Ripleys K-analyse^15. Analyse af klyngedannelser for neuroner involverer tre separate analyser: En for soma, en for neuritterne og en for tiden. Årsagen til opdeling af soma og neuritter er at tage højde for neuritternes ekstreme morfologi, som ofte er tynde nok til, at de kan behandles som et 2D-netværk og anvende en 2D-variant af Ripleys K-analyse. For tiden implementeres en 1D Ripleys K-analyse til tidsmæssig klyngedannelse. Ripleys K-analyse er en robust metode til registrering af klyngedannelse af punktprocesser og colocalisering. Grafen af Ripley's K kan fortolkes som sådan: Ripley's K værdi + konfidensinterval har en 5% chance for at falde uden for linjen for fuldstændig rumlig tilfældighed på ethvert tidspunkt, svarende til en p-værdi på 0,05. Hvis værdien falder uden for linjen med fuldstændig rumlig tilfældighed, grupperes exocytiske hændelser (over CSR) eller adskilles med jævne mellemrum (under CSR) på disse afstande (x-akse).

Oprettelsen af maskefilen er afhængig af en høj indledende signal-til-støj fra cellen. pH-følsomme markører fungerer muligvis ikke altid godt ved belysning af en celle, afhængigt af hvilket protein sonden er fastgjort til. En anden mulighed for at lave maskefiler, hvis signalet til støj fra den exocytiske markør ikke i tilstrækkelig grad fremhæver cellekanten, er at anvende en anden fluorescerende kanal / billede til oprettelse af masker. Hvis du bruger et andet fluorescensmærke (f.eks. tagRFP-CAAX) til at oprette masker, skal du først navigere til mappen med de billeder, der skal laves masker fra (f.eks. en mappe, der indeholder tagRFP-CAAX-billederne). Brug knappen Mask maker her. Det er vigtigt at huske at omdøbe maskefilerne, så de svarer til den exocytiske datafil, der skal analyseres med ovenstående navngivningsskema (i følge eksemplet ovenfor skal maskefilerne med navnet "CAAX_1_mask_file.tif" omdøbes til "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" for at matche VAMP2-billedsættet, der skal analyseres). Når maskefilerne er navngivet korrekt, skal du vende tilbage til knappen Vælg datasæt igen for at navigere til eksocytiske datasætfiler, der skal analyseres.

Påvisning af exocytose er bemærkelsesværdigt følsom, og exocytiske hændelser blev nøjagtigt påvist ved signal-til-støj-forhold så lavt som en ΔF/F på 0,01. Detektionens følsomhed afhænger delvist af variansen af baggrundslyst, og hændelser mindre end 4 standardafvigelser over baggrundssignalet vil ikke blive opdaget.

Opdagelsen af exocytiske hændelser afhænger af deres forbigående karakter. Som en funktion i analysen af forbigående begivenheder udforsker vores detektionskode et 20-sekunders vindue omkring den exocytiske begivenhed. I nogle celletyper, kys-og-ophold exocytose kan "ophold" for en meget længere tidsmæssige vindue end i udviklingen af neuroner, og den automatiserede detektion kan ikke robust fange disse mindre forbigående begivenheder. Denne funktion er en let modificerbar variabel for dem, der er komfortable med MATLAB. I lighed med begrænsningen af den 20 sekunders ROI kan exocytiske hændelser, der vises, men ikke forsvinder før videoens sidste tidsramme, muligvis ikke tælles som ægte exocytose, hvilket kan påvirke hyppigheden, som beregnes ud fra hele tidsseriens længde.

Den medfølgende maskeproducent automatiseres af design og fungerer godt på segmentering af komplekse figurer fra baggrunden; Det fuldautomatiske design begrænser dog det udvalg af signal-til-støj- og signaltype, der kan bruges til at generere en maske automatisk. Hvis brugeren ikke kan medtage en fluorescerende cellemarkør, der er ensartet og med et betydeligt signal-til-støj-forhold, skal cellemasken tegnes manuelt.

Brugerbaseret analyse af exocytose er en tidskrævende proces og underlagt personlig bias, da begivenheder ikke altid er klart adskilt fra anden fluorescens. Brugen af et automatiseret analyseprogram til korrekt at identificere og analysere exocytiske hændelser på en upartisk måde øger analyseeffektiviteten og forbedrer reproducerbarheden og stringensen.

Ikke alene fungerer denne exocytiske hændelsesdetektering for nøjagtigt at fange pH-følsom fluorescens i udviklingen af neuroner, men også andre celletyper (Urbina et al., 2018). Om klassificering fungerer for andre celletyper, kræver bestemmelse. Fremtidige anvendelser af denne teknik kan være nyttige ved synapser, i ikke-neuronale celletyper eller med nye markører for exocytisk vesikeldocking og fusion, som for nylig beskrevet pHmScarlet¹⁶.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/