Summary
פיתחנו תוכנת ראייה ממוחשבת אוטומטית לזיהוי אירועים אקסוציאטיים המסומנים על ידי בדיקות פלואורסצנטיות רגישות ל- pH. כאן, אנו מדגימים את השימוש בממשק משתמש גרפי ו- RStudio כדי לזהות אירועי היתוך, לנתח ולהציג פרמטרים spatiotemporal של היתוך, ולסווג אירועים למצבי היתוך נפרדים.
Abstract
מיקרוסקופיית Timelapse TIRF של GFP רגיש ל-pH (pHluorin) המצורפת לחלבוני SNARE ארסיים היא שיטה יעילה לדמיין אירועים אקסוציאטיים ארסיים בודדים בתרבית התאים. כדי לבצע זיהוי וניתוח יעילים ובלתי משוחדים של אירועים כאלה, פותחה ויושמה גישה מבוססת ראייה ממוחשבת ב- MATLAB. צינור הניתוח מורכב מפילוח תאים ומאלגוריתם זיהוי אירועים אקסוציאטיים. גישת הראייה הממוחשבת כוללת כלים לחקירת פרמטרים מרובים של אירועים בודדים, כולל מחצית החיים של דעיכה פלואורסצנטית ושיא ΔF/F, כמו גם ניתוח תאים שלמים של תדירות האקסוציאטוזיס. פרמטרים אלה ואחרים של היתוך משמשים בגישה סיווג להבחין מצבי היתוך נפרדים. כאן GUI שנבנה לאחרונה מבצע את צינור הניתוח מתחילתו ועד סופו. עיבוד נוסף של פונקציית K של ריפלי ב- R Studio משמש להבחנה בין מופע מקובץ באשכולות, מפוזרים או אקראיים של אירועי היתוך הן במרחב והן בזמן.
Introduction
מבנים VAMP-pHluorin או קולטן העברה (TfR)-pHuji מבנים הם סמנים מצוינים של אירועים אקסוציאטיים, כמו אלה פלואורופורים רגישים pH מרווים בתוך לומן ארסית חומצה פלואורסצ'ה מיד עם פתיחת נקבובית היתוך בין קרום הלסת ופלזמה1. לאחר פתיחת נקבוביות היתוך, פלואורסצנטיות מתפורר באופן אקספוננציאלי, עם קצת הטרוגניות החושפת מידע על אירוע ההיתוך. כאן, מתואר יישום ממשק משתמש גרפי (GUI) המזהה ומנתח באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים. יישום זה מאפשר למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים שנחשפו על ידי סמנים רגישים ל- pH2 וליצור תכונות מכל אירוע שניתן להשתמש בה למטרות סיווג3 (איור 1A). בנוסף, מתואר ניתוח של קיבוץ אירועים אקסוציאטיים באמצעות הפונקציה K של ריפלי.
הסיווג האוטומטי של אירועים אקסוציאטיים למצבים אקסוציאטיים שונים דווח לאחרונה3. שני מצבים של אקסוציאטוזיס, היתוך ארסיה מלאה (FVF) ואקוציאציה של נשיקה וריצה (KNR) תוארו בעבר4,5,6,7. במהלך FVF, נקבובית ההיתוך מתרחבת, ואת ההדבקה משולבת לתוך קרום הפלזמה. במהלך KNR, נקבובית ההיתוך נפתחת באופן ארעי ולאחר מכן חותם מחדש4,5,8,9,10. ארבעה מצבים של אקסוציאטוזיס זוהו בפיתוח נוירונים, שניים הקשורים FVF ושניים הקשורים KNR. עבודה זו מדגימה כי הן FVF והן KNR ניתן לחלק עוד לאירועי היתוך הממשיכים מיד לריקבון פלואורסצנטיות (FVFi ו- KNRi) לאחר פתיחת נקבוביות היתוך או אירועים אקסוציטיים המציגים עיכוב לאחר פתיחת נקבובית היתוך לפני תחילת דעיכה פלואורסצנטית (FVFd ו- KNRd) (איור 1B). המסווג מזהה את מצב האקסוציאטוזיס עבור כל אירוע היתוך. כאן ניתוח זה שולב ב- GUI שניתן להתקין ב- MATLAB במערכות הפעלה מבוססות Windows ו- Mac. ניתן למצוא את כל קבצי הניתוח https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing או
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בחירת ערכות נתונים וספריות
- כדי לבחור ערכות נתונים לניתוח, לחץ על לחצן חפש ערכות נתונים (איור 2A, תיבה אדומה 1) כדי לנווט לתיקיה שבה נתונים מופקדים (לדוגמה, התיקיה RawData). קבצי נתונים יאוכלסו באופן אוטומטי את קבצי הנתונים כרשימה. יכולה להיות יותר מעריפת נתונים אחת בתיקיה.
- לחץ על לחצן בחר ספריה ובחר את הספריה (למשל, בדיקה) שבה יופקדו קבצים שנותחו (איור 2A, תיבה אדומה 2). קבוצה של תיקיות וקבצי ניתוח מוגמרים וכן תמונות זמניות ביניים ייווצרו בספריה זו בעת לחיצה על לחצן ניתוח. שגיאות יופקו אם לא נבחרה ספריה.
2. הגדר את גודל הפיקסלים ואת קצב המסגרות
- מלאו את קצב הפריימים והפיקסל המתאימים של התמונות בתיבה המתאימה "Framerate" או "גודל פיקסל"(איור 2A, תיבה ירוקה). אם לא סופקו ערכים (הם מוגדרים לברירת המחדל "0"), התוכנית תחפש במטה-נתונים המשויכים לקובץ אחר קצב המסגרות וגודל הפיקסלים. אם לא ניתן למצוא ערכים אלה, התוכנית תהיה ברירת המחדל לפיקסל למדידה ולמסגרת עבור נקודות זמן.
הערה: בדוגמה שסופקה, קצב המסגרות הוא 100 וגודל הפיקסלים הוא 0.08.
3. לבחור או להכין מסכות
- השתמש בלחצן יוצר מסיכות כדי ליצור באופן אוטומטי מסיכות תאים עבור הנתונים ברשימת ערכות הנתונים של הקבצים(איור 2A, תיבה כחולה). בעת השימוש בלחצן יוצר מסיכות, תיקיה חדשה בספריה שנבחרה תיווצר בשם MaskFiles. "מחוון ההפעלה" יהפוך לצהוב בעת ריצה ויחזור לירוק עם השלמתו.
הערה: מסיכה עבור כל קובץ ברשימה קבצי נתונים תיווצר מתוך 10 המסגרות הראשונות של קובץ התמונה (או מכל המסגרות אם פחות מ- 10 נמצאות בקובץ התמונה) ותופקד בתיקיה MaskFiles באמצעות ערכת מתן השמות המתאימה (המתוארת להלן). - ודא שקבצי המסיכה מאכלסים באופן אוטומטי את הרשימה 'קבצי מסיכה'. המשתמש רשאי להמשיך ישירות לניתוח.
הערה: בדוק תמיד באופן חזותי קבצי מסיכה ואשר שהם לוכדים את כל אזור העניין. המסגרת הראשונה של קובץ הנתונים וקובץ המסיכה מוצגים בממשק המשתמש כאשר אפשרות זו נבחרת. (איור 2B). יוצר המסכות עשוי ליצור שגיאות במקרה של אות לרעש נמוך, כך שאימות שקבצי מסיכה מתאימים הוא קריטי לבקרת איכות. - כחלופה לשימוש ב-Mask Maker, אם האות לרעש של תמונות אינו מספיק, צור מסיכות באופן ידני ב-ImageJ.
- תחילה, פתחו את קובץ התמונה הגולמי ב- ImageJ (איור 3A).
- לחץ על לחצן בחירת מצולע ולחץ כדי לצייר מסיכה סביב התא. לאחר סיום, לחץ פעמיים על הנקודה האחרונה כדי להשלים את המצולע.
- לאחר סיום, נווט אל ערוך | בחירת | צור מסיכה (איור 3B). מסיכה הפוכה חדשה תיווצר בהתבסס על ציור המצולע. שמור מסיכות בתיקיה ייעודית של קבצי מסיכה בספריה שנבחרה. ערכת מתן השמות של קובץ המסיכה חייבת להתאים לקבצי הנתונים הבודדים המתאימים ואחריה "_mask_file". לדוגמה, אם קובץ נתונים נקרא "VAMP2_488_WT_1.tif", יש להיקרא קובץ המסיכה המתאים "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- השתמש בלחצן חפש קבצי מסיכה כדי לנווט לתיקיה שנבחרה של קבצי מסיכה מותאמים אישית שהופקדו. המסכות יאכלסו את קבצי המסכה כרשימה.
הערה: חשוב שתהיה מסיכה עבור כל קובץ נתונים לפני הפעלת הניתוח.
4. ניתוח ומיצוי תכונות
- לאחר בחירת הספריה והרשימה קבצי נתונים וקבצי מסיכה יאוכלסו, לחץ על לחצן ניתוח (איור 4A). אם נדרש סיווג של אירועים אקסוציאטיים, עבור לשלב 5.
הערה: לחיצת לחצן ניתוח תבצע סדרה של משימות אוטומטיות כדי לנתח את הנתונים. הוא ייצור תיקיות בודדות בספריה שנבחרה להפקדת נתונים מנותחים. במהלך הריצה, "מחוון הריצה" ישתנה מירוק לצהוב(איור 4A,תיבה אדומה). לאחר סיום הניתוח, זה ישתנה בחזרה לירוק. - מצא תיקיית DataFiles(איור 4B) עם ערכה מלאה של קבצי ניתוח (כמו גם קבצי חילוץ תכונות, שישמשו בסיווג מאוחר יותר) הנקראים על פי כל קובץ נתונים (איור 4C).
הערה: תיאור של קבצי ניתוח אלה נכלל להלן בסעיף תוצאות מייצגות.
5. סיווג אירועים אקסוציאטיים
- כדי לבצע סיווג סימולטני של אירועים אקסוציאטיים עם זיהוי אוטומטי, סמן את תיבת הסימון סיווג לפני לחיצה על לחצן ניתוח. עבור כל אירוע אקסוציאטי, הקצה ציון הסתברות בין 0-1 עבור כל מחלקה. אירוע אקסוציאטי נחשב מסווג כאחת מארבע הכיתות אם ציון ההסתברות עבור כיתה זו הוא > 0.5.
הערה: לאחר השלמת הניתוח, תופיע תיקיית קובץ נתונים חדשה בתוך הספריה שנבחרה. התיקיה תכיל קבצי ניתוח המתאימים לכל קובץ תמונה.
6. ניתוח Spatiotemporal של אקסוציטוזיס באמצעות ערכי K של ריפלי
- צור קובץ מסיכה נפרד "נויריט" ו"סומה". ראשית, קטע את הסומה מהנויריט. אין שיטה משוחדת לפולח הסומה מהנוריטים, ולכן המשתמש צריך להיות עיוור לניסוי ההתניה ולהשתמש בשיקול הדעת הטוב ביותר; אליפסואיד ללא הרחבות נויריט ברורות מוצע.
- פתח את ImageJ/פיג'י.
- גרור ושחרר את קובץ המסיכה או השתמש | קובץ פתח ולאחר מכן בחר את קובץ המסיכה.
- השתמשו בכלי דוקרן הצבעים ולחצו על כל אחד מהפיקסלים השחורים ברקע המסיכה כדי להגדיר את הצבע לשחור.
- השתמש בכלי בחירת המצולעים או ביד חופשית כדי לצייר קו מתאר סביב הסומה, להפריד אותו מהנוריטים. זה דורש קבלת החלטות ידנית.
- לחץ על ערוך | בחירת | הפוך מסכה. תמונה חדשה תיפתח כאשר הסומה המקיפה מפולחת משאר התמונה. פעולה זו תיצור קובץ מסיכת סומה.
- מבלי להזיז את האזור המצויר, לחץ על הכותרת של קובץ המסיכה המקורי.
- לחץ על ערוך | מלאו כדי למלא את הסומה המקיפה כך שרק הנוריטים יישארו המסכה.
- לאחר קבלת קבצי נוריט ומסיכות נפרדים, שמור את שני קבצי המסיכה.
- פתח את "neurite_2D_network" במטלב.
- ב- MATLAB, נווט לספריה עם כל נתוני הניתוח.
- שנה את הנתיב "שם מסיכה" לשם מסיכת הנויריט, כלומר , "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- שנה את ה"csv_file_name" למקום שבו נמצא קובץ fluorescent_traces.csv, כלומר "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- לחץ על הפעל כדי לשלד את קובץ מסיכת הנוריט. פעולה זו יוצרת גרסה שלד של קובץ מסיכת הנויריט ומפקידה אותו כקובץ CSV מתחת לתיקיה maskes.
- לאחר מכן, צור קובץ CSV עבור הסומה. פתח את "CSV_mask_creator.m" במטלב.
- שים את הנתיב עבור "שם המסכה" לשם מסכת סומה, כלומר, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- שינוי "writematrix" לשם הקובץ csv שיש ליצור, כלומר, "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- לחץ על הפעל. פעולה זו יוצרת את קובץ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv החדש.
- חזור על 6.14 עבור כל קובץ מסכה.
7. הגדרת RStudio
- פתח את Rstudio ופתח ripleys_k_analysis. קובץ R.
- התקן את החבילה "spatstat" ב- RStudio על-ידי כך שהיכנס אל כלים | התקן חבילות והקלדה ב- "spatstat" ולאחר מכן לחיצה על התקן.
הערה: יש לבצע זאת רק פעם אחת לכל התקנת Rstudio. - הפעל את יריית הספריה בתחילת כל הפעלה.
- שים לב לשני משתנים עיקריים במקרה זה: "neuron_mask" ו "neuron_datapoints". מסיכת נוירון מצביעה על ערכת קבצי המסכה להפעלה, כלומר קבצי מסכת סומה."
הערה: הפעל את כל קבצי מסכת סומה יחד, בנפרד מקבצי מסיכת Neurite, ולהיפך. - קרא .csv של קבצי המסכה עבור כל אחד הנוירונים להיות מנותח.
- הפעל קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי העתקת neuron_mask_n+1 נוספים. זה יאפשר לצבור את הניתוח של ריפלי יחד, באמצעות התסריט המתואר בסעיף 8.
- עכשיו לבדוק את המשתנה השני, "neuron_datapoints".
- קרא ב." קובץ X_fluorescent_traces.csv" שנוצר על ידי תוכנית הניתוח (על ידי תכונות כל extracted_R קובץ) עם x, y,t מיקומים של האירועים האקסוציאטיים, כמו גם את הקובץ הספציפי neurite של מיקומי x,y עבור רשת 2D. זה הולך בתנוחת "neuron_datapoints".
- ב- RStudio בחר | קוד הפעל | אזור הפעל את כל. זה יוצר מספר חלקות, כולל ערכי K המקובצים של ריפלי, כמו גם חלקות צפיפות.
- שמור חלקות על-ידי כך שתלך אל ייצוא | שמירת תמונה | בחר תבנית תמונה לספריה מתאימה וקלט את שם הקובץ המתאים ולאחר מכן לחץ על שמור.
הערה: פונקציית התוויית התוויות עבור מפת החום נקראת בתסריט באמצעות "התוויה(צפיפות(soma_data,0.4)". המספר "0.4" כאן מייצג עד כמה פונקציית הצפיפות צריכה להיות חלקה. ניתן לשנות אותו כך שיתאים לנתוני משתמשים בצורה משמעותית, אך אם יש לבצע השוואות בין מפת חום שונות, המספר חייב להיות זהה ביניהן. - יצא או שמור תמונה מ- Rstudio. אם מפת חום דורשת עריכה נוספת, בחרו סוג קובץ מתאים (SVG או EPS).
8. הניתוח של ריפלי
הערה: Ripleys_k_analysis. קובץ R גם יצר באופן אוטומטי את התוויות ערך k של ריפלי. הפעלת קובץ ה- Script כולו תריץ באופן אוטומטי את הפונקציות המוזכרות להלן, אך הוא ייכלל בפירוט אם ברצונך להפעיל כל חלק של קובץ ה- Script בנפרד או לבצע שינויים בניתוח.
- ראשית, הפעל את פונקציית המעטפה עבור כל תא. פונקציה זו דימתה אקראיות מרחבית מלאה (CSR) כדי לבדוק את ערך ה- K של ריפלי של תבנית נקודת האירוע האקסוציאטית נגד.
Data_envelope_1 = מעטפות(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = מעטפות(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - לאחר מכן, איחד מעטפות אלה וצור הערכה אחת של CSR עבור הקבוצה:
Pool_csr = בריכה (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
לאחר מכן, הפעל את הפונקציה K של ריפלי עבור כל נקודות הנתונים.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, יחס = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, יחס = TRUE) - לאחר השלמת הפעולה, חברו יחד את ערכי ה-K של ריפלי ואפטרו את מרווחי הביטחון שלהם באמצעות הפקודה הבאה:
מאגר נתונים = מאגר (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - אתחול באמצעות הפקודה הבאה:
Final_Ripleys_K = varblock(כיף = Kest, Data_pool) - התווה את הנתונים.
- אם נדרש הבדל סטטיסטי קשיח, מבחן התמורות לתלמידים נכלל בחבילת spatstat כדי לבדוק הבדל בין קבוצות של דפוסי נקודות:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ קבוצה, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן נעשה שימוש ב- GUI(איור 2A)כדי לנתח אירועים אקסוציאטיים משלושה VAMP2-pHluorin המביעים נוירונים ב- 3 DIV באמצעות TIRF (פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת). E15.5 נוירונים קליפת המוח היו מבודדים, ואחריו transfection עם VAMP2-pHluorin ו ציפוי באמצעות הפרוטוקולים כפי שמתואר Winkle ואח ', 2016 ו Viesselmann ואח ', 201111,12. המתודולוגיה של פרמטרי ההדמיה היא כפי שמתואר באורבינה ואח ', 20182. בקצרה, מיקרוסקופיה TIRF שימשה לצילום קרום הפלזמה הבזלי של נוירונים כל 100 אלפיות השנייה למשך 2 דקות. איור 2, איור 3, איור 4 מציג מדריך שלב אחר שלב לניתוח אירועים אקסוציאטיים. התיקיה שבה ממוקמות תמונות הנוירון נבחרה, ונבחרת ספריה להפקדת קבצי הנתונים של הניתוח הסופי(איור 2A). באמצעות הפונקציה MaskMaker, נוצרת מסכה עבור הנוירונים, אשר נבדק ב- GUI (איור 2B). במקרה זה, מסכת התא היא באיכות טובה, ואת הניתוח יכול להמשיך. אם מסיכה אינה מספיקה, ניתן ליצור מסיכה ב- ImageJ (איור 3). לאחר שימוש בפונקציה MaskMaker או יצירת מסיכה ב- ImageJ ובחירת הספריה שבה ממוקמים קבצי המסכה, מתבצע הניתוח (איור 4A). התוצאות נוצרות בתיקיה DataFiles עם סיום הניתוח (המחוון הצהוב משתנה בחזרה לירוק) (איור 4B).
קבצי נתונים נוצרים באופן אוטומטי ונקראים על-פי קבצי הנתונים הגולמיים שסופקו.
בהנחה שfil הנתונים נקרא X:
X_tracking: קובץ זה כולל x, y מיקום ומספר מסגרת של כל אירוע, כמו גם תיבות תוחמות אשר ניתן להשתמש בהם כדי לצייר תיבות סביב כל אירוע. הגיל מציין את מספר המסגרות מעבר לגילוי הראשוני שבו אירוע הוא puncta גאוסי מובהק. אם הסיווג נבדק, תוצאות הסיווג יופיעו בקובץ זה, המציין את ההסתברות לאירוע אקסוציאטי השייך לאחת מארבע מחלקות. אם ההסתברות גדולה מ- .5, וגדולה מהסתברויות אחרות, נבחרה מחלקה אקסוציאטית.
עקבות X_fluorescent: קובץ זה כולל x, מיקום ומספר מסגרת של כל אירוע. בנוסף, הוא כולל אמצעי עוצמה פלואורסצנטיים באזור של עניין סביב כל אירוע 2 שניות לפני ו 10 שניות לאחר השיא ΔF / F עבור כל אירוע (מצוין על ידי העמודות Timepoint).
X_cell_statistics: קובץ זה כולל את אזור התא, זמן התמונה הכולל ותדירות מחושבת אוטומטית של אירועים אקסוציאטיים עבור כל תא (באירועים/מ"מ2 /minute).
קבצי חילוץ תכונה כוללים:
X_contrast: ניגוד. מדד של ניגודיות העוצמה בין פיקסל לשכנו על פני התמונה כולה.
X_correlation: מתאם. מדד לאופן המתאם של פיקסל לשכנו לאורך כל התמונה.
X_energy סה"כ אנרגיה. מוגדר כסכום בריבוע של עוצמת הפיקסלים.
X_homogeneity מודד את הקרבה של התפלגות האלמנטים ב- ROI לאלכסון ROI.
X_ring_fluorescence: הפלואורסצנטיות הממוצעת של פיקסלי גבול.
X_SD: סטיית תקן. זה מוגדר כסטיית התקן של ה- ROI.
דוגמאות לעקבות פלואורסצנטיות ממוצעות ± SEM מכל כיתה אקסוציאטית נותנו מקובץ המעקבים X_fluorescent (איור 5A). באמצעות קובץ Cell_statistics, התדירות של אקסוציאטוזיס עבור כל כיתה זוותה עבור כל נוירון (איור 5B). בעת לחיצה על תיבת הסימון סיווג, התוכנית מקצה כל אירוע אקסוציאטי למחלקה, המותווה באיור 5C. לאחר הסיווג, נעשה שימוש בקוד ניתוח K של ריפלי כדי לקבוע אם אירועים אקסוציאטיים הם אקראיים, מקובצים באשכולות או מפוזרים במרחב ובזמן. ממות חום של לוקליזציה של אירועים אקסוציאטיים(איור 5D)נוצרו. אלה חושפים "נקודות חמות" מקובצות צפויות באזורים נפרדים של הנוירון. לאחר מכן, ניתוח K של ריפלי בוצע עבור הסומה, הנויריט וההתקבצות לאורך זמן(איור 5E). ערך K של ריפלי ו- SEM (קו שחור ואזור מוצלל כחול, בהתאמה) עולים מעל קו האקראיות המרחבית המלאה (קו מקווקו אדום), דבר המצביע על קיבוץ משמעותי סטטיסטית.
איור 1: ייצוג ניתוח וסיווג אקסוציאטיים. (A) מתאר של צינור הניתוח עבור ה- GUI. תאים מפולחים מהרקע לפני זיהוי ומעקב אחר אירועים אקסוציאטיים. פרמטרים כגון שיא ΔF / F ו- t1/2 מחושבים מעקבות פלואורסצנטיות של אקסוציטוזיס ב- ROI סביב האירוע לפני האירוע ולאחר היתוך. (ב)המחשה לארבעת מצבי האקסוציאטוזיס ומונטאז'ים לדוגמה של תמונה. לאחר ההיתוך, אירועים עשויים להמשיך באופן מיידי FVF או KNR (FVFi ו- KNRi), או עיכוב עשוי להיות נוכח לפני תחילת גורל ההיתוך ל- FVF או KNR (FVFd ו- KNRd). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח דוגמאות צעד אחר צעד. (א)ראשית, נבחרות ערכות נתונים (1., תיבה אדומה) ונבחרת ספריה כדי למקם קבצי ניתוח (2., תיבה אדומה). לאחר מכן, צוינו קצב המסגרות וגודל הפיקסלים (3., תיבה ירוקה). כאן, 0.08 גודל פיקסל מיקרומטר ו 100 ms framerate שימשו. לאחר מכן לוחצים על כפתור הפונקציה MaskMaker (4., תיבה כחולה). תיקיה בשם "MaskFiles" נוצרת באופן אוטומטי בספריה שנבחרה המכילה קובץ מסיכה עבור כל קובץ תמונה במערכת הנתונים. (B)כאשר ערכות נתונים נטענות, בחירת קובץ נתונים ו/או קובץ מסיכה תציג את המסגרת הראשונה של התמונות כדי להקל על ההשוואה (תיבה ירוקה). ייתכן שקבצי מסיכה אינם נכונים לחלוטין; ניתן לתקן קובץ מסיכה זה עבור שגיאות, או קובץ מסיכה חדש עשוי להתבצע באופן ידני נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יצירת קובץ מסיכה באופן ידני ב- ImageJ. (A) תחילה, פתח את הקובץ ליצירת מסיכה. לחצן "בחירות מצולע" מחולק בקווים לרמות באדום. על-ידי לחיצה על קצה התא, נוצר חלוקה לרמות של מצולע. (B)כיצד ליצור מסיכה מחלוקה לרמות של המצולע. על-ידי בחירה באפשרות ערוך | בחירת | צור מסיכה, מסיכה בשחור לבן תיווצר מהמצולע (תמונה ימנית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח אירועים אקסוציאטיים. (א)הדגמת לחצן הניתוח (תיבה כתומה) וניתוח ריצה. שים לב מחוון הריצה הופך צהוב בעת ניתוח מתבצע. (B)קבצי ניתוח לדוגמה הנוצרים בספריה שנבחרה לאחר השלמת הניתוח. קבצי נתונים מכילים את כל קבצי הניתוח של האירוע האקסוציאטי. (C)ניתוח קבצים שנוצרו בתיקיה קבצי נתונים. תיבות צבע מייצגות את הקבצים הפתוחים בתמונות הבאות. (ד)שלושה קבצים פתוחים, "X_fluorescent_traces.csv" (אדום) ו-"X_Cell_statistics"(ירוק) ו-"X_tracking"(כחול). עקבות פלואורסצנטיות מכילות את מיקום x, y ומספר המסגרת של כל אירוע, כמו גם עוצמה פלואורסצנטית בכל ROI. Cell_statistics מכיל מידע סיכום של סטטיסטיקות אקסוציאטיות של תאים שלמים כגון תדירות האקסוציאטוזיס. X_tracking מכיל מידע מיקום וזמן עבור כל אירוע אקסוציטי, כמו גם את ההסתברות של כל סוג של exocytosis עבור כל אירוע, המיוצג כמספר בין 0-1 (>0.5 מציין אירוע שייך למחלקה מסוימת). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות. (א)פלואורסצנטיות ממוצעת עוקבת אחר +/- SEM מכל כיתה אקסוציאטית. (ב)תדירות האירועים שפורטו עבור שלושה נוירונים קליפת המוח המורינית עבור כל כיתה אקסוציאטית. ערכי נתונים אלה נותנו מ- "X_Cell_statistics", באמצעות המחלקות שהוקצו ב- "X_tracking". (ג)התפלגות מחלקות האקסוציאטוזיס עבור אותם שלושה תאים המשמשים ב- A). כאן, היחס של כל מצב הוא שרטט. (D)עלילת צפיפות של המקום שבו מתרחשים אירועים אקסוציטיים כפי שנוצר בחלק ניתוח K של ריפלי של הפרוטוקול. זה יכול להתפרש כ"מפת חום "של הסבירות המרחבית למקום שבו מתרחשים אירועים. (E)ניתוח K של ריפלי של שלושה תאים המשמשים A) ו- B). הקו האדום מציין איזה ערך תהיה התפלגות אקראית לחלוטין של אירועים אקסוציאטיים. הקו השחור מציין את ערך ה- K של ריפלי המצטבר עבור שלושת התאים בדוגמה זו, והאזור המוצלל הכחול מייצג את מרווח הביטחון. כאן, האזור המוצל במיוחד נופל מחוץ לקו של אקראיות מרחבית מלאה בין ~ 0.25-1 מיקרומטר, דבר המצביע על אירועים אקסוציאטיים מקובצים במרחקים אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעת שימוש בתוכנת הזיהוי והניתוח האקסוציאטית, שקול שהתוכנית מקבלת דחיסה ללא אובדן נתונים בלבד .tif קבצים כקלט. קבצי התמונה .tif עשויים להיות תמונות בגווני אפור של 8 סיביות, 16 סיביות או 32 סיביות (ערוץ יחיד). יש להמיר תבניות תמונה אחרות לאחד מסוגים אלה לפני הקלט. לעיון, דוגמאות המשמשות כאן הן תמונות בגווני אפור של 16 סיביות.
טבוע בתהליך הזיהוי האוטומטי, ערכות התמונה timelapse מעובדות עבור חיסור הרקע האוטומטי ותיקון ההלבנה. עבור חיסור רקע, הפיקסלים מחוץ לאזור המסיכה של קובץ המסיכה משויכים בממוצע לאורך לוח הזמנים של התמונה כולה, והערך הממוצע מופחת מערכת התמונה. לתיקון להלבנה, להתאים ריקבון מונו-מעריכי מוחל על הפלואורסצנטיות הממוצעת של פיקסלים במסכה במהלך הסרטון, כאשר העוצמה המתוקנת מותאמת כדלקמן:
עוצמה מתוקנת = (עוצמה בזמן t) ÷ exp-k×t כאשר k = קבוע ריקבון
לכן, אין צורך בעיבוד מקדים לפני הכניסה. תהליכים אלה, עם זאת, מסתמכים באופן קריטי על מסכת התמונה כדי להפריד ביעילות את התא מהרקע, ולכן מסכת תא נכונה נחוצה לתוצאות טובות.
יוצר מסכות התא האוטומטי דורש אות אחיד עם יחס אות לרעש מספיק (באופן אידיאלי, לפחות פי 2 מסטיית התקן של אות הרקע הממוצע) כדי לבצע ביצועים טובים. אמפירית, תיבת CAAX מתויגת עם חלבון פלואורסצנטי, אשר מכניס לתוך קרום הפלזמה על prenylation, עובד טוב. אין דרישה כי האות יכול להישמר לאורך כל הדמיית timelapse של exocytosis, כמו מסכה מתאימה ניתן ליצור אות גבוה ב 10 המסגרות הראשונות של הרצף. עם זאת, אם מורפולוגיית התא משתנה באופן משמעותי במהלך פרדיגמת ההדמיה, יש לנקוט זהירות.
בעת שימוש בתוכנת הזיהוי האוטומטית, כלול את קצב המסגרות ואת גודל הפיקסלים לפלטים זמניים ומרחביים מדויקים. אם לא יוצהר קצב מסגרות או גודל פיקסלים, הפלט יהיה לפי פיקסל ולמסגרת. ככלל אצבע, קטרים ארסיים בפיתוח נוירונים הם בקנה מידה של ~ 100 ננומטר13, ולכן הזיהוי האוטומטי של אירועים עשוי לעבוד עבור שלל דומה בגודל. כפי שהוא עומד, אין מגבלה קשה על גודל שלל שניתן לזהות (לפי אזור פיקסל), כמו זיהוי אוטומטי מסתמך על עוצמה בצורת גאוס על פני מגוון גדול של רוחב גאוס. ניתן לזהות במדויק היתוך של שלפוחיות קטנות מרוחב הפיקסל אם עוצמת האירוע עומדת בקריטריוני האות לרעש של פי 2 מסטיית התקן של אות הרקע הממוצע כאשר עקיפה פלואורסצנטית מתרחבת על פני פיקסלים מרובים.
תוכנית זו פותחה לאיתור אירועים אקסוציאטיים בפיתוח נוירונים. עם זאת, התוכנה נוצלה כדי לזהות בהצלחה אירועים exocytic בשורות תא אחרות2, המציין את אלגוריתם הזיהוי הוא חזק. למרות שהשתמשנו בתוכנה לזיהוי אירועים אקסוציאטיים בסוגי תאים שאינם עצביים, הבדלים במצב אירוע אקסוציאטי בין סוגי תאים14 מצביעים על כך שאלגוריתם הסיווג עשוי שלא להתאים לסוגי תאים אחרים. אירועים אקסוציאטיים בפיתוח נוירונים סווגו במקור באמצעות שלוש שיטות שונות: קיבוץ היררכי, עיוות זמן דינמי וניתוח רכיבים ראשי (PCA), וחשפו ארבעה סוגים שונים3. כאן כל שלושת המסווגים מועסקים ב- GUI כדי לסווג אירועים אקסוציאטיים לאחת מארבעת השיעורים המבוססים האלה. עבור כל אירוע אקסוציאטי, ציון הסתברות בין 0-1 מוקצה עבור כל אחת מארבע הכיתות האפשריות. כל כיתה עם ציון הסתברות > 0.5 נחשבת לכיתה זו. סיווג זה שימש רק בפיתוח נוירונים עד כה. לא ידוע אם שיעורים אלה קיימים בסוגי תאים אחרים או בנקודות זמן התפתחותיות מאוחרות יותר בנוירונים. מספר רב של אירועים עם ציוני הסתברות של <0.5 עבור כל אחת מהכיתות יציעו שהליך הסיווג עשוי שלא להתאים לאירועים האקסוציאטיים הנבחנים כעת. אם ציוני הסתברות נמוכה מוקצים לאירועים אקסוציאטיים מסוגי תאים שונים, הדבר מצביע על כך שיש צורך בסיווג דה נובו כמצבים חדשים או חלופיים של אקסוציאטוזיס עשויים להתקיים. אותן שיטות סיווג המשמשות כאן יצטרכו להיות מוחלות על האירועים האקסוציאטיים שזוהו באופן אוטומטי.
כדי לחקור את קיבוץ מרחבי וטמפורלי של אירועים אקסוציאטיים, ניתוח K של ריפלימנוצל. ניתוח קיבוץ אשכולות עבור נוירונים כרוך בשלושה ניתוחים נפרדים: אחד לסומה, אחד לנוריטים ואחד לזמן. הסיבה לפיצול הסומה והנויריטים היא להסביר את המורפולוגיה הקיצונית של נוירטים, שלעתים קרובות דקים מספיק כדי שניתן יהיה להתייחס אליהם כרשת דו-ידית וליישם גרסה דו-יומית של ניתוח K של ריפלי. במשך זמן, ניתוח K של ריפלי 1D מיושם עבור קיבוץ זמני. ניתוח K של ריפלי הוא שיטה חזקה לאיתור קיבוץ של תהליכי נקודה ו colocalization. הגרף של K של ריפלי יכול להתפרש ככזה: ערך K של ריפלי + מרווח ביטחון יש סיכוי של 5% ליפול מחוץ לקו של אקראיות מרחבית מלאה בכל נקודה, מקביל ערך p של 0.05. כאשר הערך נופל מחוץ לקו האקראיות המרחבית המלאה, אירועים אקסוציאטיים מקובצים באשכולות (מעל CSR) או מופרדים במרווחי זמן קבועים (מתחת ל- CSR) במרחקים אלה (ציר x).
יצירת קובץ המסיכה מסתמכת על אות-לרעש ראשוני גבוה של התא. סמנים רגישים ל- pH לא תמיד יכולים לבצע היטב בהארת תא, בהתאם לחלבון שאליו מחובר הגשוש. אפשרות נוספת ליצירת קבצי מסיכה אם האות לרעש של הסמן האקסוציאטי מדגיש מספיק את גבול התא היא להשתמש בערוץ/תמונה פלואורסצנטי שני ליצירת מסיכה. אם אתה משתמש בסמן פלואורסצנטיות שונה (tagRFP-CAAX, לדוגמה) כדי ליצור מסיכות, בעת בחירת ערכת נתונים, תחילה נווט לתיקיה עם התמונות כדי ליצור מסיכות (לדוגמה, תיקיה המכילה את תמונות tagRFP-CAAX). השתמש בלחצן יוצר המסכות כאן. חשוב לציין, זכור לשנות את שם קבצי המסיכה כך שיתאימו לקובץ הנתונים האקסוציאטיים שיש לנתח עם ערכת מתן השמות לעיל (בעקבות הדוגמה לעיל, יהיה צורך לשנות את שמות קבצי המסכה בשם "CAAX_1_mask_file.tif" ל- "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" כדי להתאים את ערכת התמונה VAMP2 לניתוח). לאחר ששמם של קבצי מסיכה מתאים, חזור שוב ללחצן בחר ערכת נתונים כדי לנווט לקבצי ערכת נתונים אקסוציאטית לניתוח.
גילוי האקסוציאטוזיס רגיש להפליא, ואירועים אקסוציאטיים זוהו במדויק ביחסי אות לרעש נמוכים כמו ΔF/F של 0.01. רגישות הזיהוי תלויה בחלקה בשונות הפלואורסצנטיות ברקע, ואירועים פחות מ-4 סטיות תקן מעל אות הרקע לא יזוהו.
גילוי אירועים אקסוציאטיים נשען על טבעם החולף. כתכונה של ניתוח אירועים ארעיים, קוד הזיהוי שלנו בוחן חלון של 20 שניות סביב האירוע האקסוציאטי. בסוגי תאים מסוימים, אקסוציאטוזיס נשיקה ולהישאר עשוי "להישאר" עבור חלון זמן ארוך בהרבה מאשר בפיתוח נוירונים, ואת הזיהוי האוטומטי לא יכול ללכוד בחוזקה אירועים פחות ארעיים אלה. תכונה זו היא משתנה ניתן לשינוי בקלות עבור אלה נוחים עם MATLAB. בדומה למגבלה של 20 שניות ROI, אירועים exocytic המופיעים אך אינם נעלמים לפני מסגרת הזמן האחרונה של הווידאו לא יכול להיחשב exocytosis אמיתי, אשר עשוי להשפיע על התדירות, אשר מחושב על סמך כל אורך סדרת הזמן.
יצרנית המסכות הכלולה אוטומטית בעיצוב ומתפקדת היטב בפילוח צורות מורכבות מהרקע; עם זאת, העיצוב האוטומטי לחלוטין מגביל את טווח האות לרעש וסוג האות שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מסיכה באופן אוטומטי. אם המשתמש אינו יכול לכלול סמן תא פלואורסצנטי אחיד ויחס אות לרעש משמעותי, יהיה צורך לצייר את מסיכת התא באופן ידני.
ניתוח מבוסס משתמש של exocytosis הוא תהליך גוזל זמן ובכפוף להטיה אישית, כמו אירועים לא תמיד מופרדים בבירור פלואורסצנטיות אחרת. השימוש בתוכנית ניתוח אוטומטית לזיהוי וניתוח נכון של אירועים אקסוציאטיים באופן לא משוחד מגביר את יעילות הניתוח ומשפר את יכולת הרבייה והקפדה.
לא רק זיהוי אירוע אקסוציאטי זה עובד ללכידת פלואורסצנטיות רגישה ל- pH בפיתוח נוירונים אלא גם סוגי תאים אחרים (Urbina et al., 2018). האם הסיווג פועל עבור סוגי תאים אחרים ידרוש קביעה. יישומים עתידיים של טכניקה זו עשויים להיות שימושיים בסינפסות, בסוגי תאים שאינם עצביים, או עם סמנים חדשניים של עגינה והיתוך ארסית אקסוציאטית, כגון pHmScarlet16שתוארו לאחרונה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לדסטין רבל ורג'ינלד אדוארדס על בדיקת הקוד וה-GUI. המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות נתמך מחקר זה: כולל R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ו F31NS103586 (שפעת).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
