Summary
pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.
Abstract
소포 SNARE 단백질에 부착된 pH-민감한 GFP(pHluorin)의 타임랩스 TIRF 현미경 검사는 세포 배양에서 단일 소포 외세포 이벤트를 시각화하는 효과적인 방법입니다. 이러한 이벤트에 대한 편견없고 효율적인 식별 및 분석을 수행하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 비전 기반 접근 방식을 개발하고 구현했습니다. 분석 파이프라인은 셀 세분화 및 외식 이벤트 식별 알고리즘으로 구성됩니다. 컴퓨터 비전 접근법에는 형광 부패및 피크 ΔF/F의 반감기를 비롯한 단일 이벤트의 여러 매개 변수를 조사하는 도구뿐만 아니라 외세포증 주파수의 전체 세포 분석을 포함하는 도구가 포함되어 있습니다. 이러한 융합의 매개 변수및 기타 매개 변수는 뚜렷한 융합 모드를 구별하기 위한 분류 접근 방식에 사용됩니다. 여기서 새로 구축된 GUI는 처음부터 끝까지 분석 파이프라인을 수행합니다. R Studio에서 Ripley의 K 기능을 추가로 조정하여 공간과 시간 모두에서 클러스터, 분산 또는 임의의 융합 이벤트를 구별하는 데 사용됩니다.
Introduction
VAMP-pHluorin 구조 또는 트랜스프레린 수용체(TfR)-pHuji 구조는 이러한 pH 민감형 형광류가 소포와 혈장 멤브레인1사이의 융합 모공 개구 시 즉시 산 소포 루멘 및 형광 내에 담금질되기 때문에 외세포 현상의 우수한 마커이다. 퓨전 모공 개구부에 이어 형광은 기하급수적으로 부패하며 융합 이벤트에 대한 정보를 드러내는 이질성도가 있습니다. 여기서, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 응용 프로그램은 자동으로 외세포 이벤트를 감지하고 분석하는 설명입니다. 이 응용 프로그램은 사용자가 자동으로 pH 민감한마커에 의해 공개 엑소시틱 이벤트를 감지 할 수 있습니다 2 분류 목적 에 사용할 수있는 각 이벤트에서 기능을 생성(그림 1A). 또한, 리플리의 K 함수를 이용한 외식 이벤트 클러스터링의 분석이 설명된다.
다른 외세포 모드로 외세포 이벤트의 자동화 된 분류는 최근보고되었다3. 엑소시토시스의 두 가지 모드, 풀 소포 융합(FVF) 및 키스 앤런 융합(KNR) 엑소시토시스는 이전에4,5,6,7로설명되었다. FVF 동안, 융합 모공팽창, 및 소포는 플라즈마 멤브레인에 통합된다. KNR 동안 융합 공공은 일시적으로 열리고4,5,8,9,10을다시 밀봉합니다. 4가지 엑소시토시스 는 뉴런 개발에서 확인되었으며, 2개는 FVF와 관련이 있으며 KNR과 관련된 2가지. 이 작품은 FVF와 KNR 모두 형광 붕괴가 시작되기 전에 융합 모공 개구(FVFd 및 KNRd)(도 1B)가시작되기 전에 융합 모공 개구 후 지연을 나타내는 융합 모공 개구 또는 외세포 이벤트 후 즉시 형광 붕괴(FVFi 및 KNRi)로 진행되는 융합 이벤트로 더욱 세분화될 수 있음을 보여준다. 분류자는 각 융합 이벤트에 대한 외세포증 모드를 식별합니다. 이 분석은 Windows 및 Mac 기반 운영 체제의 MATLAB에 설치할 수 있는 GUI에 통합되었습니다. 모든 분석 파일은 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 또는
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 데이터 집합 및 디렉터리 선택
- 분석을 위해 데이터 집합을 선택하려면 데이터 집합 찾기 버튼(그림2A,빨간색 상자 1)을클릭하여 데이터가 증착된 폴더(예: RawData 폴더)로 이동합니다. 데이터 파일은 데이터 파일을 목록으로 자동으로 채웁니다. 폴더에 두 개 이상의 데이터 집합이 있을 수 있습니다.
- 디렉토리 선택 버튼을 클릭하고 분석된 파일이 입금되는 디렉토리(예: 테스트)를 선택합니다(그림2A,빨간색 상자 2). 분석 버튼을 누르면 폴더 및 완성된 분석 파일 세트와 중간 임시 이미지가 이 디렉토리에서 만들어집니다. 디렉터리를 선택하지 않으면 오류가 생성됩니다.
2. 픽셀 크기와 프레임 레이트 설정
- 적절한 "프레임 레이트" 또는 "픽셀 크기"상자(그림 2A,그린 박스)에서 이미지의 적절한 프레임 속도와 픽셀 크기를입력합니다. 값이 제공되지 않는 경우(기본 "0"으로 설정됨) 프로그램은 프레임 레이트 및 픽셀 크기에 대한 파일과 연결된 메타데이터를 검색합니다. 이러한 값을 찾을 수 없는 경우 프로그램은 시간 점에 대한 측정을 위해 픽셀당 및 프레임당 기본값으로 기본값입니다.
참고: 제공된 예제에서는 프레임 레이트가 100이고 픽셀 크기는 0.08입니다.
3. 마스크 선택 또는 만들기
- 마스크 메이커 버튼을 사용하여 파일 데이터 집합 목록(그림2A,파란색 상자)의데이터에 대한 셀 마스크를 자동으로 만듭니다. 마스크 메이커 버튼을 사용하면 선택한 디렉터리에서 새 폴더를 MaskFiles라고 합니다. 실행 표시기"는 실행 중 노란색으로 바뀌고 완료되면 녹색으로 돌아갑니다.
참고: 데이터 파일 목록의 각 파일에 대한 마스크는 이미지 파일의 첫 10프레임(또는 이미지 파일에 있는 경우 모든 프레임에서)에서 생성되고 적절한 명명 체계(아래에 설명된 설명)를 사용하여 MaskFiles 폴더에 증착됩니다. - 마스크 파일이 마스크 파일 목록을 자동으로 채웁니다. 사용자는 분석으로 직접 진행할 수 있습니다.
참고: 항상 시각적으로 마스크 파일을 확인하고 관심 영역 전체를 캡처하는지 확인합니다. 선택한 경우 데이터 파일과 마스크 파일의 첫 번째 프레임이 UI에 표시됩니다. (그림2B). 마스크 메이커는 신호 대 노이즈가 낮은 경우 오류를 생성할 수 있으므로 마스크 파일이 적절한지 확인하는 것은 품질 관리에 매우 중요합니다. - 마스크 메이커를 사용하는 대신 이미지 의 노이즈에 대한 신호가 충분하지 않은 경우 ImageJ에서 수동으로 마스크를 만듭니다.
- 먼저 ImageJ(그림3A)에서원시 이미지 파일을 엽니다.
- 다각형 선택 버튼을 클릭하고 클릭하여 셀 주위에 마스크를 그립니다. 완료되면 마지막 지점을 두 번 클릭하여 다각형을 완성합니다.
- 작업이 완료되면 편집| 선택 | 마스크 만들기(그림 3B). 다각형 도면에 따라 새로운 반전 마스크가 만들어집니다. 선택한 디렉터리에서 지정된 MaskFiles 폴더에 마스크를 저장합니다. 마스크 파일 명명 방식은 "_mask_file"이 뒤따르는 해당 개별 데이터 파일과 일치해야 합니다. 예를 들어 데이터 파일의 이름이 "VAMP2_488_WT_1.tif"인 경우 해당 마스크 파일의 이름을 "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"로 지정해야 합니다.
- 마스크 파일 찾기 버튼을 사용하여 입금된 사용자 지정 마스크 파일의 선택한 폴더로 이동합니다. 마스크는 마스크 파일을 목록으로 채웁니다.
참고: 분석을 실행하기 전에 모든 데이터 파일에 대해 마스크를 두는 것이 중요합니다.
4. 분석 및 기능 추출
- 디렉터리를 선택하고 데이터 파일 목록과 마스크 파일 목록이 채워진 후 분석 단추(그림4A)를클릭합니다. 외세포 이벤트의 분류가 필요한 경우 5단계로 이동합니다.
참고: 분석 단추 클릭은 데이터를 분석하기 위해 일련의 자동화된 작업을 수행합니다. 선택한 디렉토리에 개별 폴더를 만들어 분석된 데이터를 예치합니다. 실행 하는 동안, "실행 표시기" 녹색에서 노란색으로 변경 됩니다(그림 4A,빨간색 상자). 분석이 완료되면 다시 녹색으로 변경됩니다. - 각 데이터 파일(그림 4C)에 따라 명명된 전체 분석 파일 세트(기능 추출 파일뿐만 아니라 나중에 분류에 사용할 기능 추출 파일)를 가진 DataFiles폴더(그림 4B)를찾습니다.
참고: 이러한 분석 파일에 대한 설명은 아래의 대표 결과 섹션에 포함되어 있습니다.
5. 외세포 이벤트의 분류
- 자동 감지를 사용하여 외세포 이벤트의 동시 분류를 수행하려면 분석 버튼을 클릭하기 전에 분류 확인란을 선택합니다. 각 외식 이벤트에 대해 각 클래스에 대해 0-1 사이의 확률 점수를 할당합니다. 엑소시틱 이벤트는 해당 클래스의 확률 점수가 0.5> 인 경우 4개 클래스 중 하나로 분류됩니다.
참고: 분석이 완료되면 선택한 디렉터리 내에 새 데이터 파일 폴더가 나타납니다. 폴더에는 각 이미지 파일에 해당하는 분석 파일이 포함됩니다.
6. 리플리의 K 값을 사용하여 외세포증의 현면 분석
- 별도의 "neurite" 및 "소마" 마스크 파일을 만듭니다. 첫째, 중성염으로부터 소마를 분할한다. 중성염에서 소마를 분할하는 편견없는 방법이 없으므로 사용자는 컨디셔닝 실험에 눈을 멀게하고 최상의 판단을 사용해야합니다. 명백한 neurite 확장이없는 타원은 제안됩니다.
- 이미지J/피지 오픈.
- 마스크 파일을 드래그 앤 드롭하거나 파일 | 사용 마스크 파일을 열고 선택합니다.
- 색상 선택 도구를 사용하고 마스크 배경의 검은 색 픽셀을 클릭하여 색상을 검은색으로 설정합니다.
- 다각형 선택 도구 또는 프리핸드를 사용하여 소마 주위에 윤곽선을 그려 중성염에서 분리합니다. 이를 위해서는 수동 적인 의사 결정이 필요합니다.
- | 편집을 클릭합니다. 선택 | 마스크를 만듭니다. 이미지의 나머지 부분에서 분할된 동그라미 된 소마로 새 이미지가 열립니다. 이렇게 하면 소마 마스크 파일이 생성됩니다.
- 그려진 영역을 이동하지 않고 원래 마스크 파일의 헤더를 클릭합니다.
- | 편집을 클릭합니다. 중성염만 마스크로 유지되도록 동그라미된 소마를 채우기 위해 채웁니다.
- 별도의 neurite 및 마스크 파일을 가져오면 두 마스크 파일을 모두 저장합니다.
- Matlab에서 "neurite_2D_network"을 엽니다.
- MATLAB에서는 모든 분석 데이터를 사용하여 디렉터리로 이동합니다.
- "마스크 파일/ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"와 같은 노이라이트 마스크의 이름으로 경로 "마스크 이름"을 변경합니다.
- "csv_file_name"을 fluorescent_traces.csv 파일이 있는 위치(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"로 변경합니다.
- 실행을 클릭하여 neurite 마스크 파일을 골격화합니다. 이렇게 하면 neurite 마스크 파일의 골격화된 버전이 생성되어 마스크 파일 폴더 아래에 CSV 파일로 기록합니다.
- 다음으로 소마에 대한 CSV 파일을 생성합니다. Matlab에서 "CSV_mask_creator.m"를 엽니다.
- "마스크 이름"의 경로에 "마스크 이름"을 soma 마스크의 이름으로 넣습니다(예: "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- "쓰기 매트릭스"를 생성할 csv 파일 이름으로 변경합니다(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- 실행 실행을클릭합니다. 이렇게 하면 새 VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv 파일이 만들어집니다.
- 모든 마스크 파일에 대해 6.14를 반복합니다.
7. RStudio 설정
- Rstudio를 열고 ripleys_k_analysis 열립니다. R 파일.
- 도구 | 패키지를 설치하고 "스패츠스타트"에 입력한 다음 설치를클릭합니다.
참고: Rstudio 설치당 한 번만 수행해야 합니다. - 각 세션의 시작 부분에서 라이브러리 스패츠스타트를 실행합니다.
- 이 경우 "neuron_mask"과 "neuron_datapoints"의 두 가지 주요 변수에주의를 기울이세요. 뉴런 마스크는 실행마스크 파일 세트, 즉 소마 마스크 파일을 가리킵니다."
참고: 모든 소마 마스크 파일을 Neurite 마스크 파일과 별도로 함께 실행하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. - 분석할 각 뉴런에 대한 마스크 파일의 .csv 읽습니다.
- 추가 neuron_mask_n+1을 복사하여 한 번에 여러 파일을 실행합니다. 이렇게 하면 섹션 8에 설명된 스크립트를 사용하여 Ripley의 분석을 함께 집계할 수 있습니다.
- 이제 두 번째 변수인 "neuron_datapoints"을 확인합니다.
- 읽어보십시오." X_fluorescent_traces.csv"파일은 외식 이벤트의 x, y, t 위치뿐만 아니라 2D 네트워크에 대한 x,y 위치의 neurite 특정 파일과 함께 분석 프로그램 (모든 extracted_R 파일)에 의해 생성됩니다. 이것은 "neuron_datapoints" 위치에 간다.
- RStudio에서 코드 | 선택 실행 지역 | 모든 실행. 이렇게 하면 그룹화된 Ripley의 K 값과 밀도 플롯을 비롯한 여러 플롯이 생성됩니다.
- | 내보내서 플롯 저장 이미지 저장 | 적절한 이미지 형식과 디렉토리를 선택하고 적절한 파일 이름을 입력한 다음 저장을 클릭합니다.
참고: 히트맵의 플로팅 함수는 "플롯(밀도(soma_data,0.4)"을 사용하여 스크립트에서 호출됩니다. 여기서 "0.4"는 밀도 함수가 얼마나 부드럽게 되어야 하는지 나타냅니다. 사용자 데이터에 의미 있는 방식으로 맞게 변경할 수 있지만 다른 히트맵 간에 비교를 수행해야 하는 경우 그 사이에 숫자가 같아야 합니다. - Rstudio에서 이미지를 내보내거나 저장합니다. 히트맵에 추가 편집이 필요한 경우 적절한 파일 유형(SVG 또는 EPS)을 선택합니다.
8. 리플리의 분석
참고: Ripleys_k_analysis. R 파일은 또한 자동으로 리플리의 k 값 플롯을 생성. 전체 스크립트를 실행하면 아래에 언급된 함수가 자동으로 실행되지만 스크립트의 각 부분을 개별적으로 실행하거나 분석을 변경하려는 경우 자세히 포함됩니다.
- 먼저 각 셀에 대한 봉투 함수를 실행합니다. 이 함수는 완전한 공간 임의성(CSR)을 시뮬레이션하여 리플리의 K 값에 대한 외식 이벤트 포인트 패턴을 테스트했습니다.
Data_envelope_1 = 봉투(soma_data_1, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE)
Data_envelope_2 = 봉투(soma_data_2, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE) - 다음으로 이러한 봉투를 함께 풀을 짜고 그룹에 대한 CSR 추정치하나를 만듭니다.
Pool_csr = 풀(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
그런 다음 모든 데이터 포인트에 대해 Ripley의 K 함수를 실행합니다.
Data_ripleys_k_1 = 키스 (soma_data_1, 비율 = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = 키스 (soma_data_2, 비율 = TRUE) - 완료되면 리플리의 K 값을 함께 풀링하고 다음 명령으로 자신감 간격을 부트스트랩합니다.
데이터 풀 = 풀(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - 다음 명령이 있는 부트스트랩:
Final_Ripleys_K = varblock (재미 = 키스, Data_pool) - 데이터를 플롯합니다.
- 통계적 차이가 어려운 경우 학생 순열 테스트가 스패츠스타트 패키지에 포함되어 포인트 패턴 그룹 간의 차이를 테스트합니다.
Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test, exocytic_events ~ 그룹, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서GUI(그림 2A)는TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경을 사용하여 3DIV에서 뉴런을 발현하는 3개의 VAMP2-pHluorin으로부터 의 외세포 이벤트를 분석하는 데 활용되었다. E15.5 피질 뉴런은 격리되었고, 그 다음으로 VAMP2-pHluorin과 함께 트랜스페팅및 윙클 등에서 설명된 프로토콜을 이용한 도금 및 도금에 의해 2016년 및 비셀만 외, 20111년11,12. 이미징 매개 변수의 방법론은 Urbina 외, 20182에설명된 대로 설명되어 있습니다. 간단히, TIRF 현미경 검사는 2 분 동안 100 ms마다 뉴런의 기저 플라즈마 멤브레인을 이미지하는 데 사용되었다. 뉴런 이미지가 있는 폴더가 선택되고 최종 분석 데이터 파일을 입금하는 디렉토리가 선택됩니다(그림2A). 마스크메이커 기능을 이용하여GUI(도 2B)에서검사되는 뉴런용 마스크가 생성된다. 이 경우 셀 마스크는 품질이 좋으며 분석이 진행될 수 있습니다. 마스크가 충분하지 않은 경우 ImageJ(그림3)에서마스크를 만들 수 있습니다. MaskMaker 기능을 사용하거나 ImageJ에서 마스크를 만들고 마스크 파일이 있는 디렉토리를 선택한 후 분석이수행됩니다(그림 4A). 분석이 완료되면 DataFiles 폴더에서 결과가 생성됩니다(노란색 표시등이 다시 녹색으로 변경)(그림 4B).
데이터 파일은 제공된 원시 데이터 파일에 따라 자동으로 생성되고 이름이 지정됩니다.
데이터 파일의 이름을 X로 가정합니다.
X_tracking: 이 파일에는 각 이벤트의 x, y 위치 및 프레임 수와 각 이벤트 주위에 상자를 그리는 데 사용할 수 있는 경계 상자가 포함됩니다. 나이는 이벤트가 뚜렷한 가우시안 말장난인 초기 검색을 지나는 프레임 수를 나타냅니다. 분류를 선택하면 분류 결과가 이 파일에 나타나며, 이는 네 클래스 중 하나에 속하는 외세포 이벤트의 가능성을 나타냅니다. 확률이 .5보다 크고 다른 확률보다 큰 경우 외세포 클래스가 선택되었습니다.
X_fluorescent 추적: 이 파일에는 각 이벤트의 x, y 위치 및 프레임 번호가 포함됩니다. 또한 각 이벤트에 대한 ΔF/F 피크(Timepoint columns에 의해 표시)에 따라 2초 전과 10초 전에 각 이벤트 주변의 관심 영역에서 형광 강도 측정값을 포함한다.
X_cell_statistics: 이 파일에는 셀 영역, 총 이미지 시간 및 각 셀에 대한 외식 이벤트의자동으로 계산된 빈도(이벤트/mm 2/분)가 포함됩니다.
기능 추출 파일은 다음과 같습니다.
X_contrast: 대조. 전체 이미지에 대한 픽셀과 이웃 사이의 강도 대비를 측정합니다.
X_correlation: 상관. 픽셀과 픽셀의 상관 관계가 전체 이미지를 통해 이웃과 상관관계가 있는 정도를 측정합니다.
X_energy 총 에너지. 픽셀 강도의 제곱합으로 정의됩니다.
X_homogeneity ROI 대각선에 ROI에 있는 요소의 분포의 근접성을 측정합니다.
X_ring_fluorescence: 테두리 픽셀의 평균 형광.
X_SD: 표준 편차. 이는 ROI의 표준 편차로 정의됩니다.
각 외세포 클래스로부터 SEM에 ± 평균 형광 흔적의 예는 X_fluorescent 추적파일(그림 5A)으로부터플롯되었다. Cell_statistics 파일을 사용하여 각 클래스에 대한 외세포증의 빈도가 각뉴런(도 5B)에대해 플롯되었다. 분류 확인란을 클릭하면 프로그램은 그림 5C에플롯된 각 외동 이벤트를 클래스에 할당합니다. 분류 후 Ripley의 K 분석 코드를 사용하여 외식 이벤트가 임의인지, 클러스터화되거나, 시간과 분산되는지 여부를 결정했습니다. 외세포 이벤트의 국소화의 밀도 열지도(도5D)가생성되었다. 이들은 뉴런의 별개의 영역에서 예상되는 클러스터된 "핫스팟"을 드러냅니다. 다음으로, 리플리의 K 분석은 소마, 중성염 및 시간이 지남에 따라 클러스터링(그림5E)에대해 수행되었다. Ripley의 K 값과 SEM(각각 검은 선과 파란색 그늘진 영역)은 완전한 공간 무작위성(빨간색 점선)의 선 위로 상승하여 통계적으로 유의한 클러스터링을 제안합니다.
그림 1: 외세포 분석 및 분류의 표현. (A)GUI에 대한 분석 파이프라인의 개요. 세포는 외세포 이벤트가 식별되고 추적되기 전에 배경에서 분할됩니다. 피크 ΔF/F 및 t1/2와 같은 매개 변수는 이벤트 전 및 후 융합을 중심으로 ROI에서 외세포증의 형광 추적으로부터 계산됩니다. (B)외세포증 및 예제 이미지 몽타주의 의 네 가지 모드의 그림. 융합 후, 이벤트는 FVF 또는 KNR(FVFi 및 KNRi)으로 즉시 진행될 수 있거나, FVF 또는 KNR(FVFd 및 KNRd)에 대한 융합 운명이 시작되기 전에 지연이 발생할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단계별 예제 분석. (A)먼저 데이터 집합이 선택되고(1., 빨간색 상자) 및 디렉토리가 분석 파일(2., 빨간색 상자)을 배치하도록 선택됩니다. 다음으로 프레임 레이트와 픽셀 크기가 지정됩니다(3., 녹색 상자). 여기서, 0.08 μm 픽셀 크기와 100 ms 프레임 레이트가 사용되었다. 그런 다음 마스크메이커 함수 버튼이 푸시됩니다(4., 파란색 상자). "MaskFiles"라는 제목의 폴더는 데이터 집합의 각 이미지 파일에 대한 마스크 파일을 포함하는 선택한 디렉토리에서 자동으로 만들어집니다. (B)데이터 집합을 로드하면 데이터 파일 및/또는 마스크 파일을 선택하면 비교용 이미지의 첫 번째 프레임(Green box)이 표시됩니다. 마스크 파일이 완전히 정확하지 않을 수 있습니다. 이 마스크 파일은 오류에 대해 수정할 수 있으며 새 마스크 파일이 수동으로 만들어질 수 있으므로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ImageJ. (A)먼저 마스크를 만들기 위한 파일을 열어 마스크 파일을 수동으로 만듭니다. "다각형 선택" 버튼은 빨간색으로 설명되어 있습니다. 셀 가장자리를 클릭하면 다각형 윤곽선이 만들어집니다. (B)다각형 윤곽선에서 마스크를 만드는 방법. 편집 | 선택하여 선택 | 다각형(오른쪽이미지)에서 흑백 마스크가 만들어지는 마스크 만들기 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 외세포 이벤트 분석. (A)분석 버튼(주황색 상자)의 데모 및 실행 분석. 분석이 수행되는 동안 실행 표시등이 노란색으로 바뀝니다. (B)해석이 완료되면 선택한 디렉터리에서 생성되는 예제 분석 파일입니다. DataFiles에는 외세포 이벤트의 모든 분석 파일이 포함되어 있습니다. (C)데이터 파일 폴더에서 생성된 분석 파일입니다. 색상 상자는 후속 이미지의 열린 파일을 나타냅니다. (D)세 개의 열려 있는 파일, "X_fluorescent_traces.csv"(빨간색) 및 "X_Cell_statistics"(녹색), "X_tracking"(파란색). 형광 추적에는 각 이벤트의 x, y 위치 및 프레임 수와 각 ROI의 형광 강도가 포함됩니다. Cell_statistics 외세포증의 주파수와 같은 전세포 외세포 통계의 요약 정보가 포함되어 있습니다. X_tracking 각 외식증 이벤트에 대한 위치 및 시간 정보와 각 이벤트에 대한 각 클래스의 외세포증 의 확률을 포함하며, 0-1 사이의 숫자로 표현됩니다(>0.5는 이벤트가 특정 클래스에 속한다는 것을 나타냅니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표 결과. (A)각 외세포 클래스에서 평균 형광 추적 +/- SEM.(B)각 외세포 클래스에 대한 3개의 뮤린 피질 뉴런을 위해 플롯된 이벤트 빈도. 이러한 데이터 값은 "X_tracking"에 할당된 클래스를 사용하여 "X_Cell_statistics"에서 플롯되었습니다. (C)A에서 사용되는 동일한 3개의 세포에 대한 외세포의 클래스분포). 여기서각 모드의 비율이 플롯됩니다. (D)프로토콜의 리플리의 K 분석 부분에서 생성된 바와 같이 외식 이벤트가 발생하는 위치의 밀도 플롯입니다. 이는 이벤트가 발생하는 공간의 가능성의 "열맵"으로 해석될 수 있습니다. (E)리플리의 K 분석은 A에 사용되는 3개의 세포와 B). 빨간색 선은 외식 이벤트의 공간적으로 임의 분포가 어떤 값인지 를 나타냅니다. 검은색 선은 이 예제에서 세 셀에 대한 리플리의 K 값을 나타내며 파란색 그늘진 영역은 신뢰 구간을 나타냅니다. 여기서, 그늘진 영역은 특히 ~0.25-1 μm 사이의 완전한 공간 임의성의 선 밖으로 떨어지며, 이는 외세포 이벤트가 그 거리에서 클러스터링된다는 것을 시사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
외식 감지 및 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 프로그램은 무손실 압축 .tif 파일만 입력으로 수락한다는 점을 고려하십시오. .tif 이미지 파일은 8비트, 16비트 또는 32비트 그레이스케일(단일 채널) 이미지일 수 있습니다. 다른 이미지 형식은 입력하기 전에 이러한 유형 중 하나로 변환해야 합니다. 참고로 여기에서 사용되는 예제는 16비트 회색 크기 이미지입니다.
자동 감지 프로세스에 내재된 타임랩스 이미지 세트는 자동화된 배경 감속 및 광표백 보정을 위해 처리됩니다. 배경 빼기의 경우 마스크 파일의 마스크 영역 외부의 픽셀은 전체 이미지의 시간 경과에 따라 평균되며 평균 값은 이미지 집합에서 빼됩니다. 포토표백 보정의 경우, 모노 지수 부패 핏이 비디오 의 과정을 통해 마스크의 평균 형광에 적용되며 수정된 강도는 다음과 같이 조정됩니다.
보정 강도 = (시간에 강도 t) ÷ exp-k×t 어디 k = 붕괴 상수
따라서 입력하기 전에 사전 처리가 필요하지 않습니다. 그러나 이러한 프로세스는 이미지 마스크에 비판적으로 의존하여 셀을 배경과 효과적으로 분리하므로 좋은 결과를 얻으려면 적절한 셀 마스크가 필요합니다.
자동화된 셀 마스크 작성자는 충분한 신호 대 잡음 비(평균 배경 신호의 표준 편차의 2배 이상)를 갖춘 균일한 신호가 필요합니다. 경험적으로, CAAX 상자는 prenylation 의 플라즈마 막에 삽입하는 형광 단백질로 태그, 잘 작동합니다. 시퀀스의 첫 10프레임에서 높은 신호로부터 적합한 마스크를 생성할 수 있기 때문에, 외세포증의 타임랩스 이미징 전반에 걸쳐 신호를 유지할 수 있는 요구 사항은 없다. 그러나, 화상 진찰 패러다임 도중 세포 형태학이 현저하게 변경되는 경우에, 주의해야 합니다.
자동화된 감지 소프트웨어를 사용하는 경우 정확한 시간적 및 공간 출력을 위한 프레임레이트 및 픽셀 크기를 포함합니다. 프레임 레이트 또는 픽셀 크기가 선언되지 않으면 출력은 픽셀당 및 프레임당됩니다. 일반적으로 엄지 손가락으로, 개발 뉴런에서 소포 직경은 ~ 100 nm13의규모에 있으며, 따라서 이벤트의 자동 검출은 크기와 유사한 소포에 대해 작동 할 수 있습니다. 자동 감지가 가우시안 의 폭의 넓은 범위에 따라 가우시안 모양의 강도에 의존하기 때문에(픽셀 면적별로) 감지할 수 있는 소포의 크기에는 하드 제한이 없습니다. 픽셀 너비보다 작은 소포의 융합은 이벤트의 강도가 형광 회절이 여러 픽셀에 걸쳐 확장됨에 따라 평균 배경 신호의 표준 편차를 2배의 신호 대 잡음 기준을 충족하는 경우 정확하게 감지할 수 있다.
이 프로그램은 뉴런 개발에 외세포 이벤트를 감지하기 위해 개발되었다. 그러나, 소프트웨어는 성공적으로 검출 알고리즘이 견고함을 나타내는 다른 셀라인2에서외세포 이벤트를 검출하기 위해 악용되었습니다. 우리는 비 신경 세포 모형에서 외세포 사건을 검출하기 위한 소프트웨어를 사용했더라도, 세포 모형14 사이 외세포 이벤트 모드에 있는 다름은 분류 알고리즘이 그밖 세포 모형에 적합하지 않을 수 있다는 것을 표시합니다. 뉴런 개발의 외동적 이벤트는 원래 계층 적 클러스터링, 동적 시간 왜곡 및 주 성분 분석 (PCA)의 세 가지 방법을 사용하여 분류되어 4 개의 다른 클래스3을드러냅니다. 여기에 세 분류자는 모두 GUI에 고용되어 엑소시틱 이벤트를 이러한 확립된 4개 클래스 중 하나로 분류합니다. 각 외식 이벤트에 대해 가능한 4개의 클래스 각각에 대해 0-1 사이의 확률 점수가 할당됩니다. 확률 점수가 0.5> 있는 모든 클래스는 해당 클래스로 간주됩니다. 이 분류는 현재까지 뉴런 개발에만 사용되었습니다. 이러한 클래스는 다른 세포 유형또는 뉴런의 나중에 발달 시점에 존재하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 클래스에 대해 확률 점수<0.5의 많은 수의 이벤트는 분류 절차가 현재 평가중인 외식 이벤트에 적합하지 않을 수 있음을 시사합니다. 낮은 확률 점수가 다른 세포 유형의 외세포 이벤트에 할당되는 경우, 이것은 외세포증의 새로운 또는 대체 모드가 존재할 수 있기 때문에 de novo 분류가 필요하다는 것을 시사합니다. 여기에서 사용되는 동일한 분류 메서드는 자동으로 감지된 외세포 이벤트에 적용해야 합니다.
외식 이벤트의 공간적 및 측두적인 클러스터링을 탐구하기 위해 Ripley의 K 분석15가 악용됩니다. 뉴런을 위한 군집을 분석하는 것은 세 가지 별도 분석을 포함합니다: 소마를 위한 하나, 중성염을 위한 하나, 그리고 시간 동안 하나. 소마와 중성염을 분할하는 이유는 종종 2D 네트워크로 취급될 수 있을 만큼 얇고 Ripley의 K 분석의 2D 변형을 적용하는 중성염의 극단적인 형태를 설명하기 때문입니다. 시간 동안 시간적 클러스터링을 위해 1D Ripley의 K 분석이 구현됩니다. Ripley의 K 분석은 포인트 프로세스 및 공동 지역화의 클러스터링을 감지하는 강력한 방법입니다. 리플리의 K그래프는 리플리의 K값 + 신뢰 구간이 0.05의 p-값과 유사하게 어떤 시점에서든 완전한 공간 무작위성 선 밖으로 떨어질 확률이 5%입니다. 값이 완전한 공간 임의성 선 밖으로 떨어지는 경우 외식 이벤트는 CSR(CSR 위) 클러스터링되거나 해당 거리(x 축)에서 일정한 간격(CSR 아래)으로 분리됩니다.
마스크 파일의 생성은 셀의 초기 신호 대 노이즈에 의존합니다. pH 민감한 마커는 프로브가 부착되는 단백질에 따라 세포를 비추는 데 항상 잘 수행되지 않을 수 있습니다. 외식 마커의 노이즈신호가 세포 경계를 충분히 강조하면 마스크 파일을 만들기 위한 또 다른 옵션은 마스크 생성을 위해 제2 형광 채널/이미지를 사용하는 것입니다. 다른 형광 마커(tagRFP-CAAX)를 사용하여 마스크를 만드는 경우 먼저 데이터 집합을 선택할 때 이미지가 있는 폴더로 이동하여 마스크를 만듭니다(예: 태그RFP-CAAX 이미지가 포함된 폴더). 마스크 메이커 버튼을 사용하십시오. 중요한 것은 위의 명명 체계와 분석할 외세포 데이터 파일에 맞게 마스크 파일의 이름을 바꾸는 것을 기억하십시오(위의 예에 따라"CAAX_1_mask_file.tif"라는 마스크 파일의 이름을 "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"로 변경하여 분석할 VAMP2 이미지와 일치해야 합니다.). 마스크 파일의 이름이 적절하게 지정되면 데이터 집합 선택 단추로 다시 돌아와 외동 데이터 집합 파일로 이동하여 분석합니다.
외세포증의 검출은 매우 민감하며, 외세포 이벤트는 0.01의 ΔF/F만큼 낮은 신호 대 잡음 비에서 정확하게 검출되었다. 검출의 감도는 배경 형광의 분산에 부분적으로 좌우되며 배경 신호 위의 4개 미만의 표준 편차 이벤트는 감지되지 않습니다.
외세포 이벤트의 검출은 일시적인 성격에 의존합니다. 일시적인 이벤트 분석의 특징으로 서, 우리의 탐지 코드는 외식 이벤트 주위 20 초 창을 탐구. 일부 세포 유형에서, 키스 앤 스테이 엑소세포증은 뉴런 개발보다 훨씬 더 긴 시간적 창을 위해 "체류"할 수 있으며, 자동화된 검출은 이러한 보다 적은 일시적인 사건을 강력하게 포착하지 못할 수 있습니다. 이 기능은 MATLAB에 익숙한 사람들에게 쉽게 수정할 수 있는 변수입니다. 20초 ROI의 제한과 유사하게, 비디오의 마지막 시간 프레임 이전에 나타나지만 사라지지 않는 외세포 이벤트는 실제 외세포증으로 계산되지 않을 수 있으며, 이는 주파수에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 타임 시리즈의 전체 길이에 따라 계산된다.
포함 된 마스크 메이커는 디자인에 의해 자동화되고 배경에서 복잡한 모양을 분할에 잘 수행; 그러나 완전히 자동화된 설계는 마스크를 자동으로 생성하는 데 사용할 수 있는 신호 대 노이즈 및 신호 유형의 범위를 제한합니다. 사용자가 균일하고 상당한 신호 대 잡음 비율을 포함하는 형광 세포 마커를 포함 할 수없는 경우, 셀 마스크는 수동으로 그려져야합니다.
엑소시토시스의 사용자 기반 분석은 시간이 많이 소요되는 과정이며 이벤트가 항상 다른 형광과 명확하게 분리되지 않기 때문에 개인적인 편견에 따라 달라질 수 있습니다. 자동화된 분석 프로그램을 사용하여 편견없는 방식으로 외세포 이벤트를 올바르게 식별하고 분석하여 분석 효율성을 높이고 재현성과 엄격함을 향상시킵니다.
뿐만 아니라이 외세포 이벤트 검출은 정확하게 뉴런 개발에서 pH 민감한 형광을 캡처하기위한 작동하지만 다른 세포 유형 (Urbina 외. al., 2018). 분류가 다른 세포 유형에 적합한지 여부는 결정이 필요합니다. 이 기술의 향후 응용 프로그램은 시냅스, 비신경 세포 유형, 또는 최근 설명된 pHmScarlet16과같은 외세포 소포 도킹 및 융합의 새로운 마커와 함께 유용할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 코드와 GUI를 테스트 더스틴 Revell 및 레지널드 에드워즈 감사합니다. 자금은 이 연구를 지원하는 국립 보건원에 의해 제공되었습니다: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), F31NS103586 (독감)을 포함.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
