Summary
Vi utvecklade automatiserad datorseende programvara för att upptäcka exocytic händelser markerade med pH-känsliga fluorescerande sonder. Här demonstrerar vi användningen av ett grafiskt användargränssnitt och RStudio för att upptäcka fusionshändelser, analysera och visa spatiotemporala parametrar för fusion och klassificera händelser i distinkta fusionslägen.
Abstract
Timelapse TIRF mikroskopi av pH-känsliga GFP (pHluorin) fäst vid vesikel SNARE proteiner är en effektiv metod för att visualisera enskilda vesikel exocytic händelser i cellkulturen. För att utföra en opartisk, effektiv identifiering och analys av sådana händelser utvecklades och implementerades ett datorseendebaserat tillvägagångssätt i MATLAB. Analyspipelinen består av en cellsegmenterings- och exocytisk händelseidentifieringsalgoritm. Metoden med datorseende innehåller verktyg för att undersöka flera parametrar för enskilda händelser, inklusive halveringstiden för fluorescensförfall och topp ΔF/F, samt helcellsanalys av frekvensen av exocytos. Dessa och andra fusionsparametrar används i en klassificeringsmetod för att skilja distinkta fusionslägen. Här utför ett nybyggt GUI analyspipelinen från början till slut. Ytterligare anpassning av Ripleys K-funktion i R Studio används för att skilja mellan grupperade, spridda eller slumpmässiga förekomster av fusionshändelser i både tid och rum.
Introduction
VAMP-pHluorin konstruktioner eller transferrin receptor (TfR)-pHuji konstruktioner är utmärkta markörer för exocytic händelser, eftersom dessa pH-känsliga fluorforer släcks inom syra vesikel lumen och fluoresce omedelbart vid fusion por öppning mellan vesikel och plasmamembran 1. Efter fusion por öppning sönderfaller fluorescens exponentiellt, med viss heterogenitet som avslöjar information om fusionshändelsen. Här beskrivs ett grafiskt GUI-program (User Interface) som automatiskt identifierar och analyserar exocytiska händelser. Denna applikation gör det möjligt för användaren att automatiskt upptäcka exocytiska händelser som avslöjas av pH-känsligamarkörer 2 och generera funktioner från varje händelse som kan användas förklassificeringsändamål 3 (figur 1A). Dessutom beskrivs analys av exocytic händelse kluster med Ripleys K funktion.
Den automatiserade klassificeringen av exocytic händelser i olika exocytic lägen rapporterades nyligen3. Två lägen av exocytos, full vesikel fusion (FVF) och kyss-och-kör fusion (KNR) exocytos har tidigare beskrivits4,5,6,7. Under FVF vidgas fusionsporen och vesikeln införlivas i plasmamembranet. Under KNR öppnas fusionsporen tillfälligt och återförsluter sedan4,5,8,9,10. Fyra lägen av exocytos identifierades i utveckla nervceller, två relaterade till FVF och två relaterade till KNR. Detta arbete visar att både FVF och KNR kan delas in ytterligare i fusionshändelser som omedelbart fortsätter till fluorescensförfall (FVFi och KNRi) efter fusionsporöppning eller exocytiska händelser som uppvisar en fördröjning efter fusionsporöppning innan fluorescensförfall börjar (FVFd och KNRd) (Figur 1B). Klassificeraren identifierar exocytosläget för varje fusionshändelse. Här har denna analys införlivats i ett GUI som kan installeras i MATLAB i Windows och Mac baserade operativsystem. Alla analysfiler finns i https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Välj datamängder och katalog
- Om du vill välja datamängder för analys klickar du på knappen Sök datamängder (bild 2A, röd ruta 1) för att navigera till mappen där data deponeras (t.ex. RawData-mappen). Datafiler fyller automatiskt i datafilerna som en lista. Det kan finnas mer än en datauppsättning i mappen.
- Klicka på knappen Välj katalog och välj katalogen (t.ex. Testa) där analyserade filer ska deponeras (Bild 2A, röd ruta 2). En uppsättning mappar och färdiga analysfiler samt mellanliggande tillfälliga bilder skapas i den här katalogen när knappen Analys trycks in. Fel uppstår om en katalog inte väljs.
2. Ställ in pixelstorlek och bildhastighet
- Fyll i lämplig bildhastighet och pixelstorlek på bilderna i lämplig "Framerate" eller "pixel size"(bild 2A, grön ruta). Om inga värden anges (de är inställda på standard "0") söker programmet efter metadata som är associerade med filen efter bildhastighet och pixelstorlek. Om dessa värden inte kan hittas kommer programmet att vara standard per pixel för mätning och per bildruta för tidpunkter.
I exemplet är bildhastigheten 100 och pixelstorleken 0,08.
3. Välj eller gör masker
- Använd knappen Mask Maker för att automatiskt skapa cellmasker för data i fildatauppsättningslistan (Bild 2A, blå ruta). När du använder knappen Mask Maker skapas en ny mapp i den valda katalogen som heter MaskFiles. "Körindikatorn" blir gul när den körs och återgår till grönt när den är klar.
OBS: En mask för varje fil i listan Datafiler skapas från de första 10 bildrutorna i bildfilen (eller från alla ramar om mindre än 10 finns i bildfilen) och deponeras i mappen MaskFiles med rätt namnschema (beskrivs nedan). - Kontrollera att maskfilerna automatiskt fyller i listan Maskfiler. Användaren kan gå direkt till analysen.
OBS: Kontrollera alltid maskfiler visuellt och bekräfta att de fångar hela intresseområdet. Den första bildrutan i datafilen och maskfilen visas på användargränssnittet när den är markerad. (Figur 2B). Mask maker kan producera fel vid lågt signal-till-brus, så validering av att maskfiler är lämpliga är avgörande för kvalitetskontroll. - Som ett alternativ till att använda Mask Maker, om signalen till brus av bilder är otillräcklig, skapa masker manuellt i ImageJ.
- Öppna först den råa bildfilen i ImageJ (Bild 3A).
- Klicka på knappen Polygonmarkering och klicka här om du vill rita en mask runt cellen. När du är klar dubbelklickar du på den sista punkten för att slutföra polygonen.
- När du är klar navigerar du till Redigera | Urval | Skapa mask (bild 3B). En ny inverterad mask skapas baserat på polygonritningen. Spara masker i en utsedd MaskFiles-mapp i den valda katalogen. Maskeringsfilnamnschemat måste matcha motsvarande enskilda datafiler följt av "_mask_file". Om en datafil till exempel heter "VAMP2_488_WT_1.tif" måste motsvarande maskfil heta "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Använd knappen Sök maskfiler för att navigera till den valda mappen med insatta anpassade maskfiler. Maskerna fyller i maskfilerna som en lista.
Obs: Det är viktigt att ha en mask för varje datafil innan du kör analysen.
4. Analys och funktionsutvinning
- När katalogen har valts och listan Datafiler och maskfiler har fyllts i klickar du på knappen Analys (Bild 4A). Om klassificeringen av exocytiska händelser krävs, gå till steg 5.
Obs: Klicka på knappen Analys utför en serie automatiserade uppgifter för att analysera data. Det skapar enskilda mappar i den valda katalogen för att deponera analyserade data. Under körningen ändras "körindikatorn" från grönt till gult (Bild 4A, röd ruta). När analysen är klar ändras detta tillbaka till grönt. - Hitta en DataFiles-mapp (figur 4B) med den kompletta uppsättningen analysfiler (samt funktionsutsugningsfiler, som ska användas i klassificering senare) namngivna enligt varje datafil (figur 4C).
OBS: En beskrivning av dessa analysfiler ingår nedan i avsnittet Representativa resultat.
5. Klassificering av exocytiska händelser
- Om du vill utföra samtidig klassificering av exocytiska händelser med automatisk identifiering markerar du kryssrutan Klassificering innan du klickar på knappen Analys. För varje exocytisk händelse tilldelar du en sannolikhetspoäng mellan 0-1 för varje klass. En exocytisk händelse anses klassificeras som en av de fyra klasserna om sannolikhetspoängen för den klassen > 0,5.
När analysen är klar visas en ny datafilmapp i den valda katalogen. Mappen innehåller analysfiler som motsvarar varje bildfil.
6. Spatiotemporal analys av exocytos med Ripleys K-värden
- Skapa en separat maskfil för "neurit" och "soma". Segmentera först soma från neuriten. Det finns ingen opartisk metod för att segmentera soma från neuriterna, så användaren bör förblindas av konditioneringsexperimentet och använda bästa omdöme; en ellipsoid utan några uppenbara neurit förlängningar föreslås.
- Öppna ImageJ/Fiji.
- Dra och släpp maskfilen eller använd | Öppna och markera sedan maskfilen.
- Använd färgplockarverktyget och klicka på någon av de svarta pixlarna i maskens bakgrund för att ställa in färgen på svart.
- Använd polygonvalsverktyget eller frihanden för att rita en kontur runt soma och separera den från neuriterna. Detta kräver manuellt beslutsfattande.
- Klicka på Redigera | Urval | Gör mask. En ny bild öppnas med den inringade soma segmenterad från resten av bilden. Detta skapar en soma maskfil.
- Utan att flytta det ritade området klickar du på rubriken på den ursprungliga maskfilen.
- Klicka på Redigera | Fyll för att fylla i den inringade soma så att endast neuriterna förblir masken.
- När separata neurit- och maskfiler har hämtats sparar du båda maskfilerna.
- Öppna "neurite_2D_network" i Matlab.
- Navigera till katalogen med alla analysdata i MATLAB.
- Ändra sökvägen "masknamn" till namnet på neuritmasken, dvs.,MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Ändra "csv_file_name" till fluorescent_traces.csv finns, det vill säga "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Klicka på Kör om du vill skelettisera neuritmaskfilen. Detta skapar en skelettiserad version av neuritmaskfilen och deponerar den som en CSV-fil under maskfilsmappen.
- Generera sedan en CSV-fil för soma. Öppna "CSV_mask_creator.m" i Matlab.
- Sätt in sökvägen för "masknamnet" till namnet på soma-masken, dvs"MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Ändra "writematrix" till csv filnamn som ska skapas, dvs"MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Klicka på Kör. Detta skapar den nya VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv filen.
- Upprepa 6.14 för varje maskfil.
7. RStudio-installation
- Öppna Rstudio och öppna ripleys_k_analysis. R-fil.
- Installera paketet "spatstat" i RStudio genom att gå till Verktyg | Installera paket och skriv in "spatstat" följt av att klicka på Installera.
OBS: Detta behöver endast utföras en gång per Rstudio Installation. - Kör bibliotekets spatstat i början av varje session.
- Var uppmärksam på två huvudvariabler i det här fallet: "neuron_mask" och "neuron_datapoints". Neuron Mask pekar på uppsättningen maskfiler som ska köras, det vill säga soma maskfiler."
OBS: Kör alla soma maskfiler tillsammans, separat från Neurit maskfiler, och vice versa. - Läs i .csv maskfilerna för var och en av nervcellerna som ska analyseras.
- Kör flera filer samtidigt genom att kopiera ytterligare neuron_mask_n+1. Detta gör det möjligt att aggregera Ripleys analys tillsammans med hjälp av skriptet som beskrivs i avsnitt 8.
- Kolla nu den andra variabeln, "neuron_datapoints".
- Läs i." X_fluorescent_traces.csv"-fil som genereras av analysprogrammet (av funktioner alla extracted_R-fil) med x,y,t-positionerna för de exocytiska händelserna, liksom den neuritspecifika filen för x,y-positionerna för 2D-nätverket. Detta går i "neuron_datapoints" -positionen.
- Välj kod för | i RStudio Kör region | Kör alla. Detta genererar flera tomter, inklusive de grupperade Ripleys K-värden samt densitetsdiagram.
- Spara tomter genom att gå till Exportera | Spara bild som | Välj lämpligt bildformat och lämplig katalog och ange lämpligt filnamn och klicka sedan på Spara.
OBS: Plottningsfunktionen för värmekartorna kallas i skriptet med hjälp av "plot(density(soma_data,0.4))". Siffran "0,4" här representerar hur utjämnad densitetsfunktionen ska vara. Det kan ändras så att de passar användardata på ett meningsfullt sätt, men om jämförelser ska utföras mellan olika värmekartor måste antalet vara detsamma mellan dem. - Exportera eller spara bild från Rstudio. Om en värmekarta kräver ytterligare redigering väljer du en lämplig filtyp (SVG eller EPS).
8. Ripleys analys
OBS: Ripleys_k_analysis. R-filen genererade också automatiskt Ripleys k-värdediagram. Om du kör hela skriptet körs automatiskt de funktioner som nämns nedan, men det inkluderas i detalj om man vill köra varje del av skriptet individuellt eller göra ändringar i analysen.
- Kör först kuvertfunktionen för varje cell. Denna funktion simulerade fullständig rumslig slumpmässighet (CSR) för att testa Ripleys K-värde för det exocytiska händelsepunktsmönstret mot.
Data_envelope_1 = kuvert(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = SANT)
Data_envelope_2 = kuvert(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = SANT) - Slå sedan ihop dessa kuvert och skapa en uppskattning av CSR för gruppen:
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Kör sedan Ripleys K-funktion för alla datapunkter.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = SANT)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = SANT) - När du är klar slår du ihop Ripleys K-värden och drar ihop konfidensintervallen med följande kommando:
Datapool = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrap med följande kommando:
Final_Ripleys_K = varblock(kul = Kest, Data_pool) - Rita data.
- Om en svår statistisk skillnad krävs ingår Studentised Permutation Test i spatstatpaketet för att testa för en skillnad mellan grupper av poängmönster:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupp, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här användes GUI (Figur 2A) för att analysera exocytiska händelser från tre VAMP2-pHluorin uttrycker nervceller vid 3 DIV med TIRF (total intern reflektion fluorescens) mikroskopi. E15.5 när nervceller isolerades, följt av transfection med VAMP2-pHluorin och plätering med hjälp av protokollen som beskrivs i Winkle et al., 2016 och Viesselmann et al., 201111,12. Metoden för bildparametrar beskrivs i Urbina et al., 20182. Kort, TIRF mikroskopi användes för att avbilda det basala plasmamembranet av nervceller var 100 ms i 2 min. Bild 2, Figur 3, Bild 4 visar en steg-för-steg guide för att analysera exocytiska händelser. Mappen där neuronbilderna finns är markerad och en katalog för att deponera de slutliga analysdatafilerna väljs (figur 2A). Med funktionen MaskMaker genereras en mask för nervcellerna, som inspekteras i GUI (Figur 2B). I det här fallet är cellmasken av god kvalitet, och analysen kan fortsätta. Om en mask är otillräcklig kan en mask skapas i BildJ (Bild 3). När du har använt maskmakerfunktionen eller skapat en mask i ImageJ och valt katalogen där maskfilerna finns utförs analysen (bild 4A). Resultaten genereras i mappen DataFiles när analysen är klar (den gula indikatorn ändras tillbaka till grönt) (bild 4B).
Datafiler genereras automatiskt och namnges enligt de tillhandahållna rådatafilerna.
Förutsatt att datafilen heter X:
X_tracking: Den här filen innehåller x,y-position och ramnummer för varje händelse samt begränsningsrutor som kan användas för att rita rutor runt varje händelse. Ålder anger antalet bildrutor förbi den första identifieringen där en händelse är en distinkt gaussisk puncta. Om klassificeringen är markerad visas klassificeringsresultaten i den här filen, vilket indikerar sannolikheten för en exocytisk händelse som tillhör en av fyra klasser. Om sannolikheten är större än .5 och större än andra sannolikheter, valdes en exocytisk klass.
X_fluorescent spår: Den här filen innehåller x,y-position och ramnummer för varje händelse. Dessutom innehåller den fluorescerande intensitetsmått i en intresseregion runt varje händelse 2 sekunder före och 10 sekunder efter toppen ΔF/F för varje händelse (indikeras av Timepoint-kolumnerna).
X_cell_statistics: Den här filen innehåller cellområdet, den totala bildtiden och automatiskt beräknad frekvens av exocytiska händelser för varje cell (i händelser/mm2/minut).
Funktioner extrahering filer inkluderar:
X_contrast: Kontrast. Ett mått på intensitetskontrasten mellan en pixel och dess granne över hela bilden.
X_correlation: Korrelation. Ett mått på hur korrelerad en pixel är för grannen över hela bilden.
X_energy Total energi. Definieras som den kvadratiska summan av pixelintensiteten.
X_homogeneity mäter närheten till fördelningen av element i ROI till ROI diagonalen.
X_ring_fluorescence: den genomsnittliga fluorescensen för kantpixlar.
X_SD: Standardavvikelse. Detta definieras som standardavvikelsen för avkastningen på sysselsatta.
Exempel på genomsnittliga fluorescensspår ± SEM från varje exocytisk klass ritades från X_fluorescent spårfil (figur 5A). Med hjälp Cell_statistics den första filen ritades frekvensen av exocytos för varje klass för varje neuron (figur 5B). Med kryssrutan Klassificering klickad tilldelar programmet varje exocytisk händelse till en klass, ritad i bild 5C. Efter klassificeringen användes Ripleys K-analyskod för att avgöra om exocytiska händelser är slumpmässiga, grupperade eller spridda i tid och rum. Densitet värmekartor för lokalisering av exocytic händelser (Figur 5D) genererades. Dessa avslöjar förväntade klustrade "hotspots" i olika regioner av neuron. Därefter utfördes Ripleys K-analys för soma, neurit och klustring över tid (Figur 5E). Ripleys K-värde och SEM (svart linje respektive blå skuggad region) stiger över linjen fullständig rumslig slumpmässighet (röd prickad linje), vilket tyder på statistiskt signifikant klustring.
Figur 1: Representation av exocytisk analys och klassificering. (A) Kontur av analyspipelinen för det europeiska gränssnittet. Celler segmenteras från bakgrunden innan exocytiska händelser identifieras och spåras. Parametrar som topp ΔF/F och t1/2 beräknas utifrån fluorescerande spår av exocytos i en ROI runt händelsen före och efter fusion. B)Illustration av de fyra lägena exocytos och exempel på bildmontage. Efter fusion kan händelser fortsätta omedelbart till FVF eller KNR (FVFi och KNRi), eller en försening kan förekomma före uppkomsten av fusion öde till FVF eller KNR (FVFd och KNRd). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Steg för steg-exempelanalys. (A) Först väljs datamängder (1., röd ruta) och en katalog väljs för att placera analysfiler (2., röd ruta). Därefter anges bildhastigheten och pixelstorleken (3., grön ruta). Här användes 0,08 μm pixelstorlek och 100 ms framerate. Funktionsknappen MaskMaker trycks sedan in (4., blå ruta). En mapp med titeln "MaskFiles" skapas automatiskt i den valda katalogen som innehåller en maskfil för varje bildfil i datauppsättningen. (B) När datamängder läses in visas den första bildrutan för enkel jämförelse (grön ruta) när du väljer en datafil och/eller maskfil. Maskfiler kanske inte är helt korrekta. Den här maskfilen kan korrigeras för fel, eller så kan en ny maskfil göras manuellt Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Skapa en maskfil manuellt i ImageJ. (A) Öppna först filen för att göra en mask. Knappen "Polygonval" är skisserad i rött. Genom att klicka runt cellens kant skapas en polygonkontur. (B) Hur man skapar en mask från polygonkonturen. Genom att välja Redigera | Markering | Skapa mask, en svartvit mask skapas från polygonen (höger bild). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Analys av exocytiska händelser. (A) Demonstration av analysknappen (orange låda) och en löpande analys. Observera att körningsindikatorn blir gul medan en analys utförs. (B) Exempel på analysfiler som skapas i den valda katalogen när analysen är klar. DataFiles innehåller alla analysfiler för den exocytiska händelsen. (C) Analysfiler som genereras i mappen DataFiles. Färgrutor representerar de öppna filerna i efterföljande bilder. (D) Tre öppna filer, "X_fluorescent_traces.csv" (röd) och "X_Cell_statistics"(grön) och "X_tracking"(blå). Fluorescerande spår innehåller x,y-positionen och bildrutenumret för varje händelse, samt fluorescerande intensitet vid varje ROI. Cell_statistics innehåller sammanfattande information om exocytisk statistik i hela cellen, såsom frekvensen av exocytos. X_tracking innehåller position och tidsinformation för varje exocytisk händelse samt sannolikheten för varje klass av exocytos för varje händelse, representerad som ett tal mellan 0-1 (>0,5 indikerar att en händelse tillhör en viss klass). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa resultat. A)Genomsnittliga fluorescensspår +/- SEM från varje exocytisk klass. ( B )Frekvensav händelser som plottas för tre murinkortikala nervceller för varje exocytisk klass. Dessa datavärden ritades från "X_Cell_statistics", med hjälp av de klasser som tilldelats i "X_tracking". C)Fördelning av klasserna exocytos för samma tre celler som används i A). Här ritas förhållandet mellan varje läge. D)Densitetsdiagram över var exocytiska händelser inträffar som genereras i Ripleys K Analysis-del av protokollet. Detta kan tolkas som en "värmekarta" över den rumsliga sannolikheten för var händelser inträffar. (E) Ripleys K-analys av tre celler som används för A) och B). Den röda linjen anger vilket värde helt rumsligt slumpmässig fördelning av exocytiska händelser skulle vara. Den svarta linjen anger det aggregerade Ripleys K-värde för de tre cellerna i det här exemplet och det blå skuggade området representerar konfidensintervallet. Här faller den skuggade regionen särskilt utanför linjen av fullständig rumslig slumpmässighet mellan ~ 0,25-1 μm, vilket tyder på att exocytiska händelser är grupperade på dessa avstånd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När du använder exocytic detekterings- och analysprogramvaran, vänligen tänk på att programmet endast accepterar förlustfri komprimering .tif filer som indata. De .tif bildfilerna kan vara 8-bitars, 16- eller 32-bitars gråskalebilder (en kanal). Andra bildformat måste konverteras till någon av dessa typer innan de matas in. Som referens är exempel som används här 16-bitars gråskalebilder.
Som en naturlig del av den automatiska identifieringsprocessen bearbetas timelapse-bilduppsättningarna för automatisk bakgrundssubtraktion och fotograferingskorrigering. För bakgrundssubtraktion är pixlarna utanför maskfilens maskerade region genomsnittliga under tidslapse för hela bilden och medelvärdet subtraheras från bilduppsättningen. För fotograferingskorrigering appliceras en mono-exponentiell sönderfallspassning på den genomsnittliga fluorescensen av pixlar i masken under videons gång, med den korrigerade intensiteten justerad enligt följande:
Korrigerad intensitet = (Intensitet vid tidpunkten t) ÷ exp-k×t där k = sönderfallskonstant
Därför är ingen förbehandling nödvändig före indata. Dessa processer förlitar sig dock kritiskt på bildmasken för att effektivt separera cellen från bakgrunden, och därför är en korrekt cellmask nödvändig för bra resultat.
Den automatiska cellmaskskaparen kräver en enhetlig signal med ett tillräckligt signal-till-brusförhållande (helst minst 2x standardavvikelsen för den genomsnittliga bakgrundssignalen) för att fungera bra. Empiriskt fungerar CAAX-lådan märkt med ett fluorescerande protein, som sätter in i plasmamembranet vid preylering, bra. Det finns inget krav på att signalen kan upprätthållas under hela timelapse-avbildningen av exocytos, eftersom en lämplig mask kan skapas från en hög signal i de första 10 ramarna i sekvensen. Men om cellmorfologin förändras avsevärt under bildparadigmet bör försiktighet vidtas.
När du använder den automatiska detekteringsprogramvaran ska du inkludera bildhastigheten och pixelstorleken för exakta temporala och rumsliga utgångar. Om ingen bildhastighet eller pixelstorlek deklareras blir utdata per pixel och per bildruta. Som en tumregel är blåsglasdiametrar vid utveckling av nervceller på skalan ~ 100 nm13, och därmed kan den automatiska detektionen av händelser fungera för blåsor liknande i storlek. Som det ser ut nu finns det ingen hård gräns för storleken på blåsor som kan detekteras (efter pixelområde), eftersom automatiserad detektion förlitar sig på gaussiskformad intensitet över ett stort antal gaussiska bredder. Fusion av vesiklar som är mindre än en pixels bredd kan detekteras exakt om händelsens intensitet uppfyller signal-till-brus-kriterierna på 2x standardavvikelsen för den genomsnittliga bakgrundssignalen när fluorescensdiffraktionen expanderar över flera pixlar.
Detta program utvecklades för att upptäcka exocytic händelser i utveckla nervceller. Programvaran har dock utnyttjats för att framgångsrikt upptäcka exocytiska händelser i andra cellinjer2, vilket indikerar att identifieringsalgoritmen är robust. Även om vi har använt programvaran för att upptäcka exocytiska händelser i icke-neuronala celltyper, indikerar skillnader i exocytiskt händelseläge mellancelltyper 14 att klassificeringsalgoritmen kanske inte är lämplig för andra celltyper. Exocytiska händelser i att utveckla nervceller klassificerades ursprungligen med tre olika metoder: Hierarkisk klustring, Dynamic Time Warping och Principal Component Analysis (PCA), avslöjar fyra olika klasser3. Här används alla tre klassificerarna i GUI för att kategorisera exocytiska händelser i en av dessa etablerade fyra klasser. För varje exocytisk händelse tilldelas en sannolikhetspoäng mellan 0-1 för var och en av de fyra möjliga klasserna. Alla klasser med sannolikhetspoäng > 0,5 anses vara av den klassen. Denna klassificering har endast använts för att utveckla nervceller hittills. Huruvida dessa klasser finns i andra celltyper eller vid senare utvecklingsmässiga tidpunkter i nervceller är inte känt. Ett stort antal händelser med sannolikhetspoäng på <0,5 för någon av klasserna tyder på att klassificeringsförfarandet kanske inte är lämpligt för de exocytiska händelser som för närvarande utvärderas. Om låg sannolikhet poäng tilldelas exocytic händelser av olika cell typer, detta tyder på att de novo klassificering behövs som nya eller alternativa lägen av exocytos kan existera. Samma klassificeringsmetoder som används här måste tillämpas på de automatiskt upptäckta exocytiska händelserna.
För att utforska den rumsliga och tidsmässiga klustring av exocytiska händelser utnyttjas RipleysK-analys 15. Att analysera kluster för nervceller innebär tre separata analyser: En för soma, en för neuriterna och en för tid. Anledningen till att soma och neuriter delas är att redogöra för neuritens extrema morfologi, som ofta är tillräckligt tunna för att de ska kunna behandlas som ett 2D-nätverk och tillämpa en 2D-variant av Ripleys K-analys. För tid implementeras en 1D Ripleys K-analys för temporal klustring. Ripleys K-analys är en robust metod för att upptäcka kluster av punktprocesser och colocalization. Diagrammet i Ripleys K kan tolkas som sådant: Ripleys K-värde + konfidensintervall har 5% chans att falla utanför linjen för fullständig rumslig slumpmässighet när som helst, analogt med ett p-värde på 0,05. Om värdet faller utanför linjen fullständig rumslig slumpmässighet grupperas exocytiska händelser (över CSR) eller separeras med jämna mellanrum (under CSR) på dessa avstånd (x-axel).
Skapandet av maskfilen bygger på en hög initial signal-till-brus i cellen. pH-känsliga markörer kanske inte alltid fungerar bra vid belysning av en cell, beroende på vilket protein sonden är fäst vid. Ett annat alternativ för att göra maskfiler om signalen till bruset från exocytic markören inte tillräckligt belyser cellkanten är att använda en andra fluorescerande kanal / bild för att skapa mask. Om du använder en annan fluorescensmarkör (till exempel tagRFP-CAAX) för att göra masker navigerar du först till mappen med bilderna för att göra masker från (till exempel en mapp som innehåller tagRFP-CAAX-bilderna) när du väljer en datauppsättning). Använd maskskaparknappen här. Viktigt, kom ihåg att byta namn på maskfilerna för att matcha den exocytiska datafilen som ska analyseras med ovanstående namnschema (enligt exemplet ovan måste maskfilerna med namnet "CAAX_1_mask_file.tif" byta namn till "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" för att matcha VAMP2-bilduppsättningen som ska analyseras). När maskfilerna har fått rätt namn återgår du till knappen Välj datauppsättning igen för att navigera till exocytiska datauppsättningsfiler för analys.
Detektion av exocytos är anmärkningsvärt känslig, och exocytic händelser upptäcktes noggrant vid signal-till-buller förhållanden så låga som en ΔF/F av 0,01. Känsligheten för detektion beror delvis på variansen hos bakgrundsfluorescensen, och händelser mindre än 4 standardavvikelser ovanför bakgrundssignalen kommer inte att upptäckas.
Upptäckten av exocytic händelser förlitar sig på deras övergående natur. Som en funktion i analysen av tillfälliga händelser utforskar vår detekteringskod ett 20-sekunders fönster runt den exocytiska händelsen. I vissa celltyper kan kyss-och-stanna exocytos "stanna" för ett mycket längre tidsfönster än i att utveckla nervceller, och den automatiserade detektionen kanske inte robust fånga dessa mindre övergående händelser. Denna funktion är en lätt modifierbar variabel för dem som är bekväma med MATLAB. I likhet med begränsningen av 20 sekunders ROI kan exocytiska händelser som uppträder men inte försvinner före videons sista tidsram inte räknas som sann exocytos, vilket kan påverka frekvensen, som beräknas baserat på hela tidsseriens längd.
Masktillverkaren som ingår är automatiserad genom design och fungerar bra på att segmentera komplexa former från bakgrunden; Den helautomatiska designen begränsar dock intervallet för signal-till-brus och signaltyp som kan användas för att generera en mask automatiskt. Om användaren inte kan inkludera en fluorescerande cellmarkör som är enhetlig och med ett betydande signal-till-brus-förhållande måste cellmasken ritas manuellt.
Användarbaserad analys av exocytos är en tidskrävande process och föremål för personlig partiskhet, eftersom händelser inte alltid är tydligt separerade från annan fluorescens. Användningen av ett automatiserat analysprogram för att korrekt identifiera och analysera exocytiska händelser på ett opartiskt sätt ökar analyseffektiviteten och förbättrar reproducerbarhet och stringens.
Detta exocytiska händelsedetektering fungerar inte bara för att noggrant fånga pH-känslig fluorescens vid utveckling av nervceller utan även andra celltyper (Urbina et al., 2018). Om klassificeringen fungerar för andra celltyper kräver bestämning. Framtida tillämpningar av denna teknik kan vara användbara vid synapser, i icke-neuronala celltyper eller med nya markörer för exocytisk vesikel dockning och fusion, såsom nyligen beskrivna pHmScarlet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dustin Revell och Reginald Edwards för testkoden och GUI. Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health stödde denna forskning: inklusive R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) och F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
