Summary
Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.
Abstract
Ziel dieser Studie ist es, einen modifizierten chirurgischen Ansatz zur Induktion einer akuten Ischämie bei Mäusen einzuführen und zu bewerten, der in den meisten Tierlabors eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz für die Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) wurde ein kleinerer Schnitt an der rechten Leistenregion vorgenommen, um die proximale Oberschenkelarterie (FA) für die Durchführung von DLFA freizusetzen. Dann wurde der Schnitt mit einer 7-0-Naht in die Knieregion gezogen, um den distalen FA freizulegen. Magnetresonanztomographie (MRT) an bilateralen Hintergliedmaßen wurde verwendet, um FA-Okklusion nach der Operation zu erkennen. 0, 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation wurde die funktionelle Erholung der Hintergliedmaßen visuell beurteilt und mit der Tarlov-Skala bewertet. Die histologische Untersuchung wurde nach der Einschläferung der Tiere 7 Tage nach DLFA durchgeführt. Die Eingriffe wurden bei zehnApoE-/- Mäusen erfolgreich am rechten Bein durchgeführt, und bei der anschließenden Beobachtung starben keine Mäuse. Die Schnittgrößen bei allen 10 Mäusen betrugen weniger als 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRT-Ergebnisse zeigten, dass der FA-Blutfluss auf der ischämischen Seite deutlich blockiert war. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala zeigten, dass die Hintergliedmaßenfunktion nach dem Eingriff signifikant abnahm und sich in den folgenden 7 Tagen langsam erholte. Die histologische Untersuchung zeigte eine signifikante Entzündungsreaktion auf der ischämischen Seite und eine reduzierte mikrovaskuläre Dichte in der ischämischen Hintergliedmaße. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine modifizierte Technik mit einem Miniaturschnitt einführt, um eine Hintergliedmaßenischämie (HLI) unter Verwendung von DLFA durchzuführen.
Introduction
Es besteht ein ungedeckter Bedarf an präklinischen Tiermodellen für die Erforschung von Gefäßerkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (PAVK). Trotz der fortgeschrittenen Entwicklungen in Diagnose und Behandlung gab es im Jahr 2018 mehr als 200 Millionen Patienten mit PAD1, und ihre Zahl steigt ständig. Obwohl mehrere neuartige Therapieansätze2,3,4,5,6,7 beschrieben wurden, bleibt die erfolgreiche Translation dieser therapeutischen Modalitäten in die klinische Anwendung eine gewaltige Aufgabe. Daher sind zuverlässige und relevante experimentelle In-vivo-Modelle erforderlich, die den menschlichen Krankheitszustand simulieren, um den potenziellen Mechanismus und die Effizienz dieser neuen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von PAD6zu untersuchen,7.
Hyperlipidämie und Atherosklerose (AS) sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von PAD. ApoE-/- Mäuse (auf einer fettreichen Diät) zeigen einen abnormalen Fettstoffwechsel und Hyperlipidämie und entwickeln anschließend atherosklerotische Plaques, was ApoE-/- Mäuse zur besten Wahl macht, um das klinisch relevante PAD zu simulieren. Präklinische HLI-Tiermodelle werden durch Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) erzeugt, was der am weitesten verbreitete Ansatz in Labors auf der ganzen Welt ist8,9,10,11,12,13,14,15 zur Simulation einer akuten chronischen Ischämie. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel einen relativ großen und invasiven Schnitt. Weiterhin führt es unweigerlich dazu, dass die Tiere (insbesondere Mäuse) unter vermehrten Schmerzverletzungen und Entzündungen leiden, was auch die nachfolgenden Experimentellen Ergebnissebeeinflusst 5,6,16,17. Diese Arbeit beschreibt ein akutes auf chronisches HLI-Modell in APOE-/- Mäusen unter Verwendung eines sehr kleinen Schnitts.
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Protocol
HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der EG-Richtlinie EG 2010/63/EU durchgeführt und sind durch die lokale deutsche Gesetzgebung (35-9185.81/G[1]239/18) zugelassen. Zehn männliche ApoE-/- Mäuse mit dem C57BL/6J-Hintergrund mit einem Gewicht von 29,6-38,0 g wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit einer westlichen Ernährung (1,25% Cholesterin und 21% Fett) und Wasser ad libitum für 12 Wochen ab dem Alter von 8 Wochen gefüttert. HLI wurde an 20 Wochen alten Mäusen durchgeführt, wie unten beschrieben.
1. Induktion von HLI in ApoE-/- Mäusen
- Bereiten Sie die erforderlichen Geräte und Werkzeuge für die Operation vor (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor Gebrauch durch Autoklavieren und verwenden Sie während der Operation einen Glasperlensterilisator.
- Betäuben Sie die Maus vor allen chirurgischen Eingriffen mit einer subkutanen Injektion (S.C.) einer Mischung aus Midazolam (5 mg/kg), Medetomidin (0,05 mg/ml/kg) und Fentanyl (0,5 mg/kg).
- Verwenden Sie nach Beginn der Anästhesie die Tiersalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern, und bestätigen Sie das Fehlen des Pedalentzugreflexes im Vorderbein und in der Hintergliedmaße.
- Anschließend die Maus auf ein Heizkissen legen, um die Körperkerntemperatur bei ca. 37 °C zu halten. Entfernen Sie mit Wattestäbchen und Haarentfernungscreme vorsichtig haare von der Hintergliedmaßenhaut auf der rechten Seite.
HINWEIS: Die Haarentfernungscreme sollte in ausreichender Menge verwendet werden, um den Hinterteil zu bedecken, insbesondere den Leistenbereich, in dem der Schnitt gemacht wird. Die Haarentfernungscreme sollte für eine Dauer von weniger als 3 Minuten verwendet werden und anschließend 2 bis 3 Mal mit angefeuchteten Wattestäbchen entfernt werden. - Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Seziermikroskop auf das Heizkissen. Verwenden Sie ein Hautantiseptikum (siehe Materialtabelle),um die Haut der Maus zu desinfizieren. Anschließend machen Sie mit einer spitzen Pinzette und einer chirurgischen Schere einen ca. 3-4 mm langen Schnitt in der Mitte der Leistengegend. In Abbildung 2 finden Sie ein Schema der Prozedur.
- Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe vorsichtig mit Hilfe einer feinen spitzen Pinzette, um das proximale neurovaskuläre Femoralbündel freizulegen. Verwenden Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren. Verwenden Sie ein mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um die Oberschenkelarterie (FA) vorsichtig vom Oberschenkelnerv (FN) und der Oberschenkelvene (FV) wegzubewegen.
- Führen Sie zwei resorbierbare 7-0-Nähte durch die proximale FA und machen Sie doppelte Knoten mit einer Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
- Um die distale FA freizulegen, führen Sie eine resorbierbare 7-0-Naht durch den unteren Rand des Schnitts und ziehen Sie den Schnitt vorsichtig in den Bereich der rechten Seite des Knies der Hintergliedmaße.
- Bewegen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig zur Seite, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren, und sezieren Sie die FA von FV und FN.
- Führen Sie zwei 7-0 resorbierbare Nähte durch die distale FA und machen Sie doppelte Knoten. Verwenden Sie eine Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
HINWEIS: Am linken Glied, das bei jeder Maus als Kontrolle diente, wurde keine Ligatur durchgeführt. - Verwenden Sie anschließend 6-0 resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu nähen. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig und überwachen Sie ihre Vitalparameter bis zur Genesung. Postoperative Analgetika: Buprenorphin s.c. (0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h). 48 h nach der Operation Metamizol im Trinkwasser verabreichen (24 mg/5 ml Wasser entsprechen einer Dosis von 200 mg/kg 4 mal täglich).
2. Magnetresonanztomographie
HINWEIS: Einen Tag nach DLFA müssen sich die Mäuse MRT-Scans unterziehen, um die FA-Blockade zu beurteilen.
- Legen Sie die Maus in eine transparente Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft bis zum Verlust des Aufrichtungsreflexes.
- Legen Sie die Maus auf ein beheiztes Tierbett, das mit einem Bisshalter ausgestattet ist und mit einem lasergesteuerten System zum Magneten hin positioniert ist. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37±1 °C.
- Halten Sie während der Bildaufnahme die Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft aufrecht und überwachen Sie die Atmung mit einer Drucksonde.
- Erfassen Sie Bilder in der Querschnittausrichtung mit einer dreidimensionalen (3D) Time of Flight (TOF) Angiographiesequenz mit Parameter Echozeit (TE)/Wiederholungszeit (TR)/Flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier Mittelwerten, einer Erfassungsmatrix von 178 x 144 rekonstruiert auf 256 x 192 und 121 Scheiben, was zu einer isotropen Auflösung von 0,15 mm3führt. Um das Signal von den Venen zu unterdrücken, legen Sie eine Sättigungsscheibe distal zu den Hintergliedmaßen.
3. Klinische Bewertung und Follow-up
- Schätzen Sie die funktionelle Erholung in den1.,3.,5.und7. Tagen nach der Operation unter Verwendung der funktionellen Scoring-Tarlov-Skala18,19 ( Tabelle1).
4. Histologische Bewertung
- Sieben Tage nach der Operation eine Pentobarbital-Injektion (115 mg/kg) anwenden, um die Mäuse einzuschläfern.
- Perfuse phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Paraformaldehyd (PFA) durch den linken Herzventrikel (100 ml pro Maus). Fixieren Sie den bilateralen Gastrocnemius (Gm) der Mäuse in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.
- Die Probe wird gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll 20 in Paraffineingebettet.
- Schneiden Sie 4-5 μm dicke Abschnitte des in Paraffin eingebetteten Gewebeblocks auf ein Mikrotom. Mit Hilfe eines runden Pinsels die geschnittenen Gewebeabschnitte in das bei 42°C gehaltene Wasserbad legen.
- Führen Sie den Objektträger in einem Winkel von 45° in das Wasser ein und positionieren Sie ihn vorsichtig unter der Gruppe der zu sammelnden Abschnitte.
- Heben Sie die Rutsche vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Abschnitte an der Rutsche befestigen und über Nacht im Tischinkubator bei 37 ° C trocknen.
- Führen Sie eine Hämatoxylin/ Eosin (HE) -Färbung der Paraffinabschnitte durch.
- Legen Sie die Dias, die die Schnitte enthalten, in Schieberhalter. Bereiten Sie 3 Behälter mit frischem Xylol vor und legen Sie die Folien für 5 Minuten in jeden Behälter, um die Abschnitte zu entparaffinisieren.
- Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% Ethanol und entionisiertes Wasser für jeweils 5 Minuten tauchen.
- Färben Sie in Hämatoxylinlösung für 10 min.
- Geben Sie die Scheiben in einen Behälter mit entionisiertem Wasser und spülen Sie sie ab, indem Sie sie 5 Minuten lang unter fließendes Leitungswasser legen.
- Überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Intensität der Hämatoxylinfärbung. Wenn die Färbung eine eindeutige Identifizierung der Zellkerne ermöglicht, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Färbeintensität die Identifizierung von Zellkernen nicht erleichtert oder wenn die Intensität der Färbung schwach ist, legen Sie den Objektträger für 1 Minute in die Hämatoxylinlösung, wiederholen Sie das Waschen mit Wasser (Schritt 4.4.4) und überprüfen Sie es dann erneut.
- Gegenfleck in Eosin-Y-Lösung für 5 min.
- Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander für eine Dauer von jeweils 10 s in Behälter mit entionisiertem Wasser und 30%, 50%, 70%, 80% und 96% Ethanol tauchen. Als nächstes legen Sie die Abschnitte nacheinander in drei Behälter mit frischem Xylol für jeweils 10 s.
- Platzieren Sie die Objektträger horizontal auf mikroskopischen Objektträger-Speicherkarten mit den Abschnitten nach oben. Fügen Sie genügend Montagemedium auf dem Dia hinzu und montieren Sie die Dias mit Deckgläsern.
- Führen Sie die immunhistochemische (IHC) Färbung der Paraffinabschnitte durch.
- Wiederholen Sie die Deparaffinisierungs- und Rehydratisierungsschritte 4.4.1-4.4.2. Tauchen Sie dann die Abschnitte in einen Behälter mit 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6, und bringen Sie die Probe in einer Mikrowelle zum Kochen.
HINWEIS: Da eine Über- oder Unterhitzung der Proben zu einer inkonsistenten Färbung führen kann, halten Sie die Temperatur 10 Minuten lang knapp unter dem Siedepunkt. - Als nächstes kühlen Sie die Abschnitte auf einer Tischplatte für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 min in PBS. Trocknen Sie den Bereich um die Probe sorgfältig ab und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen großen Kreis um die Probe. .
HINWEIS: Berühren Sie niemals die Probe. Die Markierung mit einem hydrophoben Pen bildet eine hydrophobe Grenze, die die Verwendung eines kleineren Volumens der Antikörperlösung erleichtert. - Abschreckung der endogenen Peroxidaseaktivität durch Platzieren des Abschnitts in 0,3%H2O2in PBS für 10 min. Blockschnitte mit 400 μL Blockpuffer (PBS enthalten 3% Rinderserumalbumin und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel) für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
- Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 5 min. Als nächstes fügen Sie 100-400 μL verdünnten Anti-CD31-Antikörper (1:250) hinzu, um den Abschnitt abzudecken. Anschließend brüten Sie Abschnitte über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer aus.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der Antikörperlösung bedeckt ist. - Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS für eine Dauer von jeweils 5 minuten.
- Bereiten Sie die 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) -Mischung vor, indem Sie 1 Tropfen des DAB-Konzentrats zu 1 ml des DAB-Verdünnungsmittels geben und gut mischen. Anschließend 100-400 μL DAB-Gemisch in die Schnitte geben und 2 min lang mit dem Auge genau überwachen, bis eine akzeptable Färbeintensität beobachtet wird.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der DAB-Mischung bedeckt ist. - Anschließend 5 min unter fließendem Leitungswasser abspülen. Führen Sie die Hämatoxylinfärbung wie in den Schritten 4.4.3-4.4.5 beschrieben durch.
- Führen Sie die in Schritt 4.4.6 beschriebene Eosin-Y-Färbung durch. Führen Sie die in Schritt 4.4.7 beschriebenen Dehydratisierungsschritte durch.
- Montage der Abschnitte mit Deckgläsern unter Verwendung des Montagemediums. Verwenden Sie ImageJ, um den Prozentsatz der positiven CD31-Fläche (%) in 5 zufällig ausgewählten Feldern (40x) zu schätzen, die wie zuvor beschrieben als mikrovaskuläre Dichte angesehen werden können21.
- Wiederholen Sie die Deparaffinisierungs- und Rehydratisierungsschritte 4.4.1-4.4.2. Tauchen Sie dann die Abschnitte in einen Behälter mit 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6, und bringen Sie die Probe in einer Mikrowelle zum Kochen.
5. Statistische Auswertung
- Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung auszudrücken und einen ungepaarten t-Testan den Vergleichen durchzuführen. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Eigenschaften von ApoE-/- Mäusen
DLFA-Operationen wurden erfolgreich an 10 Mäusen durchgeführt, um das HLI-Modell zu etablieren, und keine der Mäuse starb nach dem Eingriff. Um Veränderungen des Körpergewichts zu verfolgen, wurden Mäuse vor dem DLFA-Verfahren (Pre-DLFA) und 7 Tage nach der DLFA-Operation (Post-DLFA) gewogen. Die Gewichte vor DLFA lagen zwischen 29,6 und 38,0 g (Mittelwert 34,74 ± 2,47 g), und die Gewichte nach DLFA lagen zwischen 26,5 und 34,1 g (Mittelwert 30,77 ± 2,15 g), was deutlich unter den Gewichten vor DLFA lag (P < 0,05, Abbildung 3A). Die Zeit für die Operation reichte von 15 bis 47 min (Mittelwert 34,2 ± 8,82 min, ohne die Anästhesiezeit). Die Schnittgröße bei 10 Mäusen reichte von 3 bis 5 mm (Mittelwert 4,2 ± 0,63 mm).
MRT-Scan und funktionelle Wiederherstellung
Die MRT-Scans zeigten sehr deutlich, dass die proximalen und distalen Regionen des rechten FA keine Perfusion zeigten (Abbildung 3C), was auf den Erfolg dieser Methode hinweist. Einen Tag nach der Operation waren die Ergebnisse der Tarlov-Skala signifikant erniedrigt (P < 0,05). Obwohl die Ergebnisse in den folgenden Tagen langsam zunahmen, waren sie bis Tag 7 immer noch niedriger als der Ausgangswert (P < 0,05, Abbildung 3B). Diese Trends stehen im Einklang mit früheren Berichten20. Es wurden keine Nekrose oder Gangränöse Gewebeentwicklung in den bilateralen Seiten der Hinterbeine von Mäusen beobachtet. Die Pfoten der ischämischen Hinterbeine bei 7 Mäusen konnten sich jedoch im Vergleich zur kontralateralen Seite nicht auf natürliche Weise dehnen. Darüber hinaus zeigten die Pfoten der ischämischen Hinterbeine bei 4 Mäusen eine leichte Verfärbung im Vergleich zur kontralateralen Seite (Abbildung 3D).
Histologische Analyse
Bei der HE-Färbung des rechten Gm-Muskels zeigten Myofiber eine unregelmäßige ischämische Nekrose. Proliferierende Satellitenzellen hatten die nekrotischen Myofiber ersetzt und waren in einer Masse und/oder mit unregelmäßiger Dispersion verteilt. Myofiber zeigten eine entzündliche Infiltration durch mehrkernige Makrophagen. Myofiber in den entzündlichen Regionen hatten ihre normalen morphologischen Eigenschaften verloren, und es gab nur wenige regenerierte Myofiber. Transversale Abschnitte dieser regenerierten Myofiber waren rund, das Zytoplasma war rot gefärbt und ein kleiner Kern oder mehrere Kerne befanden sich in der Mitte. Im Gegensatz dazu wurde diese Art von Entzündungsmuster im linken Gm nicht beobachtet (Abbildung 4). Die CD31-Antikörperfärbung wurde durchgeführt, um Endothelzellen des Gefäßes in den Gm-Proben zu identifizieren, und ImageJ wurde verwendet, um den CD31-positiven Bereich - ein Surrogat für die mikrovaskuläre Dichte - in jedem der fünf Sichtfelder (40x) für jede Probe zu bewerten. Ischämische Hintergliedmaßen zeigten signifikant mehr mikrovaskuläre Dichte als die nicht-ischämische Seite (P < 0,05, Abbildung 5).
Abbildung 1: Für das Experiment erforderliche Ausrüstung und Werkzeuge. (A) Für die Operation erforderliche Seziermikroskop und Heizkissen. (B) Chirurgische Werkzeuge: 1. 7-0 und 6-0 resorbierbare Nähte, 2. Nadelhalter, 3. zahnlose Pinzette, 4. Federschere, 5. feine Spitzzange, 6. Spitzzange und 7. chirurgische Schere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Verfahrens. (A und D) Ein kleiner Schnitt wird an der Leistenregion vorgenommen, um den proximalen Femur A freizulegen, der ligatiert ist. (B und E) Eine 6-0-Naht wird verwendet, um den Schnitt in die Knieregion zu ziehen, um die distale Femoral A freizulegen, die ligatiert ist. (C, Fund G) Nähen des Schnitts. Abkürzungen: Femoral A = Oberschenkelarterie; Femoral N = Nervus femoralis; Femoral V = Oberschenkelvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Merkmale des PAD-Mausmodells. (A) Vergleich des Körpergewichts vor und 7 Tage nach DLFA. (B) Funktionelle Erholung, bewertet nach der Tarlov-Skala. (C) Die Magnetresonanzangiographie zeigt die proximale und distale FA in der linken Hintergliedmaße (weißer Pfeil) an, und auf der rechten Seite verschwinden die proximalen und distalen FA. ( D) Veränderungen im Aussehen der beidseitigen Hintergliedmaße der Mäuse Nr. 2 und Nr. 4, 1 und 7 Tage nach DLFA. Die angezeigten Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; ungepaarter t-Test. Abkürzungen: PAD = periphere arterielle Verschlusskrankheit; DLFA = Doppelligatur der Oberschenkelarterie; FA = Oberschenkelarterie; L = links; R = rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: HE-Färbung des Musculus gastrocnemius. (A) Bild mit geringer Vergrößerung, das die HE-Färbung des rechten Gm 7 Tage nach dem DLFA-Verfahren zeigt. Entzündung wurde im rechten Gm beobachtet. (B) Im rechten Gm zeigten nekrotische Myofiber eine entzündliche Infiltration durch Makrophagen (weißer Pfeil). Die Muskelfasern verlieren ihre normalen morphologischen Eigenschaften. Es gab nur sehr wenige regenerierte Myofiber (schwarzer Pfeil). (C) HE Färbung der normalen Myofiber des rechten Gm. (D) Der kontralaterale/linke Gm (nicht-ischämische) Muskel zeigt ein normales histologisches Muster. Maßstabsleisten: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Abkürzungen: HE = Hämatoxylin-Eosin; DLFA = Doppelligatur der Oberschenkelarterie; Gm = Gastrocnemius; L = links; R= rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleich der mikrovaskulären Dichte des bilateralen Gastrocnemius-Muskels. (A) CD31-IHC-Färbung des rechten Gm-Abschnitts (schwarze Pfeile). (B) CD31-IHC-Färbung des linken Gm-Abschnitts (schwarze Pfeile). (C) Quantifizierung der mikrovaskulären Dichte der rechten Seite, die viel geringer war als die auf der linken Seite. Die angezeigten Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung. P < 0,00001; ungepaarter t-Test. Maßstabsleisten: A, B = 20 μm. Abkürzungen: CD31 = Differenzierungscluster 31; IHC = immunhistochemisch; Gm = Gastrocnemius. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Tarlow Partitur | 0 | Keine Bewegung |
| 1 | Kaum wahrnehmbare Bewegung, nicht belastend | |
| 2 | Häufige Bewegung, nicht belastend | |
| 3 | Stützt Gewicht, teils gewichtstragend | |
| 4 | Spaziergänge mit leichtem Defizit | |
| 5 | Normales, aber langsames Gehen | |
| 6 | Volles und schnelles Gehen |
Tabelle 1: Funktionale Bewertung.
Ergänzende Tabelle S1: Zusammenfassung von 25 Arbeiten aus der aktuellen Literatur zur Etablierung des PAD-Modells. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Diese Studie berichtet über einen modifizierten, vereinfachten und chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells inApoE-/-Mäusen mit Doppeltligatur in den proximalen und distalen Regionen des FA durch einen 3-4 mm-Schnitt ohne erforderliche Labor-Upgrades. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die geringere Größe der Inzision im Vergleich zu zuvor berichteten Studien, die die Maus-HLI-Modelle8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 beschreiben.
In der Vergangenheit wurde ein Schnitt vom Knie zu den Medien eng, leistenförmig oder sogar dem Bauch für eine bessere Exposition gemacht, von 0,5 bis 2 cm oder mehr9,11,15,19,22,25,26 (zusammengefasst in Der Ergänzungstabelle S1). Dieser Artikel beschreibt eine chirurgische Technik zur Erreichung von DLFA und damit HLI bei Mäusen mit einem Schnitt < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Der FA wurde ligiert, bevor er sich in die Arteria poplitealis und die Arteria saphenaus verzweigt, was zu Ischämie in mehreren Muskelgruppen in der Hintergliedmaße und zu mäßigem Stress bei Mäusen führt. Obwohl sich die Mäuse bis zum7. Tag nach der Operation funktionell erholten (Tarlov-Score Tag vor der Operation 6 ± 0,1. Tag nach der Operation 3,9 ± 0,99vs. 7. Tag nach der Operation 5,2 ± 0,92), wurden ischämische Schäden bei Gm auf histologischer Ebene beobachtet. Erstens zeigte Gm in den ischämischen Beinmyofibern eine unregelmäßige ischämische Nekrose und wurde von mehrkernigen Makrophagen infiltriert, ähnlich dem, was bei PAD-Patienten berichtet wurde27,28. Trotz Myofiber-Atrophie wurden auch einige regenerierte Myofiber beobachtet, was einem früheren Berichtentspricht 29. Zweitens war die mikrovaskuläre Dichte im ischämischen Gm am7. Tag nach der Ligatur höher als im nicht-ischämischen Bein, was auch von Ministro et al.30berichtet wurde. Der jüngste Fokus in der PAD-Therapie beschränkt sich nicht nur auf die Erhöhung der mikrovaskulären Dichte im Vergleich zur nicht-ischämischen Seite, sondern auch auf die Wiederherstellung des ischämieinduzierten Verlustes von lebensfähigem Muskelgewebe, das die Bildung neuer Gefäße unterstützt, indem es eine Matrix von Wachstumsfaktoren und biomechanische Unterstützung bereitstellt31. Somit bietet dieses Modell auch ein breites Zeitfenster, um die Wirksamkeit neuer Therapien mit diesen Schwerpunkten zu testen. Darüber hinaus passt das Erreichen von HLI mit kleineren Schnitten zum 3R-Konzept des Tierversuchs als Verfeinerung des chirurgischen Verfahrens, d.h. die kleine Hautschnittgröße verringert das Trauma und die postoperativen Schmerzen.
Ein ideales Tiermodell bietet auch ein relativ langes therapeutisches Fenster. Verschiedene chirurgische Verfahren zur Feststellung einer Ischämie bei Mäusen wurden berichtet und angewendet, und sie üben unterschiedliche Auswirkungen auf die Wiederherstellung des Blutflusses aus21. Für die Induktion von HLI konzentrieren sich chirurgische Methoden normalerweise auf dieArteria iliaca 12,19,23,32, Arteria femoralis24,33,34, und ihre Äste11,35, einige einschließlich der Oberschenkelvene sowie36,37. Da das Niveau der Gefäßligatur keinen Einfluss auf die Wiederherstellung des Blutflusses hat, ist der entscheidende Faktor das Ausmaß der Verletzung imGefäßbaum 21. Für eine einzelne Ligatur der Oberschenkel- oder Beckenarterie wird ein kleiner Schnitt in der Leisten- oder Bauchregion gemacht, während die anderen Astinteraktionen noch aufrechterhalten werden, und die Perfusionswiederherstellung in der Hintergliedmaße der Maus erholt sich innerhalb von 7 Tagen vollständig21,38. Daher reicht eine einzelne Ligatur nicht aus, um ein geeignetes therapeutisches Fenster bereitzustellen, um die Wirkung verschiedener Behandlungen zu testen. Wenn auch Äste aus dem FA ligatiert werden müssen, muss der Hautschnitt noch größer gemacht werden, was die Operationszeit verlängert. Daher bietet HLI by DLFA in Mouse ein geeignetes therapeutisches Fenster, in dem die durch die Therapie induzierten Verbesserungen effizient überwacht werden können9,21,22,25.
Die Etablierung eines klinisch relevanten HLI-Tiermodells ist wichtig, um die Effizienz neuartiger Therapieansätze, d.h. Zell-, Stammzell- oder Gentherapie für PAD2,3,4,zu testen. Mehrere PAD-Modelle wurden bei Mäusen15,21,Ratten39und Kaninchen40,41entwickelt. Del Giudice und Kollegen etablierten ein Kaninchen-Hinterbeinischämie-Modell, das durch perkutane, transaurikuläre, distale Femurarterienembolisation mit kalibrierten Partikeln erstellt wurde, die einige der Einschränkungen bestehender Tiermodelle überwinden können40. Liddell et al.41 schufen auch ein Kaninchen-PAD-Modell, indem sie die oberflächliche FA durch einen endovaskulären Ansatz wickelten, was zu einer reduzierten Reperfusion der Hintergliedmaßen führte. Obwohl größere Tiere, wie Kaninchen, überzeugendere Ergebnisse liefern können40,41, wodurch die Therapien der klinischen Anwendung einen Schritt näher kommen, erfordern sie jedoch erhöhte Kosten und Zeit, um Ergebnisse zu erzielen.
Trotz des heterogenen Risikoprofils der meisten Patienten mit PAD, einschließlich erblicher und Verhaltensfaktoren42,zeigen ApoE-/- Mäuse abnormale Fettstoffwechsel- und Hyperlipidämiesymptome wie Gesamtcholesterin, Triglyceride, Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte und Lipoprotein mittlerer Dichte, die einige der Hauptmerkmale replizieren, die bei Patienten mit PAD beobachtet wurden. Darüber hinaus nehmen diese Indikatoren mit der fettreichen Diät signifikant zu. Lo Sasso et al. berichteten, dass bei diesen Mäusen die arterielle Fettansammlung im Alter von 3 Monaten im Alter von43Jahren auftritt und dass eine Zunahme der AS-Läsionen mit fortschreitendem Alter von43Jahren auftritt. Daher eignen sichApoE-/- Mäuse besonders gut für das Akut-auf-chronische Ischämie-PAD-Modell, da sie die bei Patienten mit PAVK häufig auftretende Hypercholesterinämie rekapitulieren und eine geeignete Plattform zur Bewertung verschiedener Therapien zur Förderung der Neovaskularisation ischämischer Gliedmaßen bieten. Darüber hinaus ist das Preis-Leistungs-Verhältnis der Erprobung neuartiger Therapien mitApoE-/- Mäusen unschlagbar.
Trotz der in den obigen Absätzen genannten Vorteile gibt es zwei Einschränkungen für dieses Modell. Erstens erfordert die Beherrschung dieser Methode, dass der Experimentator über ausreichende mikrochirurgische Erfahrung und Vertrautheit mit der Anatomie der Hintergliedmaße der Maus verfügt. Zweitens erhöhen die begrenzte chirurgische Exposition und die Menge an Subkutangewebe in der Hintergliedmaße von ApoE-/- Mäusen die chirurgische Schwierigkeit. Daher ist für die erfolgreiche Implementierung dieser Technik einige verwandte Übungen erforderlich. Zusammenfassend berichtet diese Studie über einen modifizierten und einfach zu implementierenden, chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells in ApoE-/- Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Der kleine Schnitt reduziert das Trauma des Tieres signifikant und kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass der Artikelinhalt in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen verfasst wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Viktoria Skude, Alexander Schlund und Felix Hörner für die hervorragende technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e1035 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
