Summary
Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.
Abstract
Zebravis is naar voren gekomen als een belangrijk diermodel om menselijke ziekten, met name kanker, te bestuderen. Samen met de robuuste transgene en genoombewerkingstechnologieën die worden toegepast bij zebravismodellering, maken het onderhoudsgemak, de productiviteit met hoge opbrengst en krachtige live beeldvorming de zebravis een waardevol modelsysteem om metastase en cellulaire en moleculaire bases te bestuderen die ten grondslag liggen aan dit proces in vivo. Het eerste zebravis neuroblastoom (NB) model van metastase werd ontwikkeld door overexpressie van twee oncogenen, MYCN en LMO1, onder controle van de dopamine-beta-hydroxylase (dβh) promotor. Co-overexpressie van MYCN en LMO1 leidde tot de verminderde latentie en verhoogde penetrantie van neuroblastomagenese, evenals versnelde metastase op afstand van tumorcellen. Dit nieuwe model herhaalt op betrouwbare wijze veel belangrijke kenmerken van human metastatische NB, waaronder betrokkenheid van klinisch relevante en metastase-geassocieerde genetische veranderingen; natuurlijke en spontane ontwikkeling van metastase in vivo; en geconserveerde plaatsen van metastasen. Daarom heeft het zebravismodel unieke voordelen om het complexe proces van tumormetastase in vivo te ontleden.
Introduction
Zebravis is op grote schaal gebruikt en toegepast op verschillende onderzoeksgebieden, vooral bij kanker. Dit model biedt vele voordelen - zoals de robuuste reproductie, kosteneffectief onderhoud en veelzijdige visualisatie van tumorgroei en metastase - die zebravissen allemaal een krachtig hulpmiddel maken om de cellulaire en moleculaire bases van tumorigenese en metastase te bestuderen en te onderzoeken. Nieuwe technieken voor grootschalige genoomkartering, transgenese, overexpressie of knock-out van genen, celtransplantatie en chemische schermen hebben de kracht van het zebravismodel enorm vergroot1. In de afgelopen jaren zijn veel zebravislijnen ontwikkeld om tumorigenese en metastase van een verscheidenheid aan menselijke kankers te bestuderen, waaronder maar niet beperkt tot leukemie, melanoom, rabdomyosarcoom en hepatocellulair carcinoom2,3,4,5. Bovendien werd het eerste zebravismodel van neuroblastoom (NB) gegenereerd door overexpressie van MYCN, een oncogen, in het perifere sympathische zenuwstelsel (PSNS) onder controle van de dopamine-bèta-hydroxylase (dβh) promotor. Met dit model werd verder aangetoond dat geactiveerde ALK kan samenwerken met MYCN om het begin van de tumor te versnellen en de tumorpenetratie in vivo6 te verhogen.
NB is afgeleid van de sympathoadrenale afstamming van de neurale kamcellen en is een sterk gemetastaseerde kanker bij kinderen7. Het is verantwoordelijk voor 10% van de pediatrische kankergerelateerde sterfgevallen8. Nb is op grote schaal uitgezaaid bij de diagnose en kan klinisch worden gepresenteerd als tumoren die voornamelijk afkomstig zijn langs de keten van de sympathische ganglia en het bijniermerg van PSNS9,10. MYCN-amplificatie wordt vaak geassocieerd met slechte resultaten bij NB-patiënten11,12. Bovendien is LMO1 geïdentificeerd als een kritisch NB-gevoeligheidsgen in gevallen met een hoog risico13,14. Studies hebben aangetoond dat de transgene coexpressie van MYCN en LMO1 in het PSNS van het zebravismodel niet alleen een eerder begin van NB bevordert, maar ook wijdverspreide metastase induceert voor de weefsels en organen die vergelijkbaar zijn met plaatsen die vaak worden gezien bij patiënten met een hoog risico NB13. Zeer recent is een ander gemetastaseerd fenotype van NB ook waargenomen in een nieuwer zebravismodel van NB, waarin zowel MYCN als Lin28B, coderend voor een RNA-bindend eiwit, overexpressie hebben onder controle van de dβh-promotor16.
De stabiele transgene benadering bij zebravissen wordt vaak gebruikt om te bestuderen of overexpressie van een interessant gen kan bijdragen aan de normale ontwikkeling en ziektepathogenese14,15. Deze techniek is met succes gebruikt om het belang van meerdere genen en routes naar NB tumorigenese6,16,17,18,19,20 aan te tonen. Dit artikel zal introduceren hoe de transgene vislijn die zowel MYCN als LMO1 in het PSNS overexpresseert, werd gecreëerd en hoe werd aangetoond dat de samenwerking van deze twee oncogenen het begin van NB-tumorigenese en metastase versnelt13. Ten eerste werd de transgene lijn die EGFP-MYCN onder controle van de dβh-promotor (aangeduid als MYCN-lijn) overexpressie geeft, ontwikkeld door de dβh-EGFP-MYCN-constructie te injecteren in eencellig stadium van wild-type (WT) AB-embryo's, zoals eerder beschreven6,17. Een afzonderlijke transgene lijn die LMO1 overexpressie geeft in de PSNS (aangeduid als LMO1-lijn) werd ontwikkeld door twee DNA-constructen, dβh-LMO1 en dβh-mCherry, samen te voegen in WT-embryo's in het eencellige stadium13. Eerder is aangetoond dat co-geïnjecteerde dubbele DNA-constructies kunnen worden gecoïntegreerd in het visgenoom; daarom worden LMO1 en mCherry co-expressie gebracht in de PSNS-cellen van de transgene dieren. Zodra de geïnjecteerde F0-embryo's geslachtsrijp waren, werden ze vervolgens gekruist met WT-vissen voor de identificatie van positieve vissen met transgen (s) integratie. Kortom, de F1-nakomelingen werden eerst gescreend door fluorescerende microscopie op mCherry-expressie in de PSNS-cellen. De kiembaanintegratie van LMO1 in mCherry-positieve vissen werd verder bevestigd door genomische PCR en sequencing. Na succesvolle identificatie van elke transgene lijn werden de nakomelingen van heterozygote MYCN- en LMO1-transgene vissen gekruist om een samengestelde vislijn te genereren die zowel MYCN als LMO1 (aangeduid als MYCN; LMO1 lijn). Tumordragende MYCN; LMO1-vissen werden tweewekelijks door fluorescerende microscopie gecontroleerd op het bewijs van gemetastaseerde tumoren in de regio's ver weg van de primaire locatie, interrenaal kliergebied (IRG, zebravisequivalent van menselijke bijnier)13. Om de metastase van tumoren in MYCN te bevestigen; LMO1-vis, histologische en immunohistochemische analyses werden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderzoeksmethoden met behulp van zebravissen en dierverzorging / onderhoud werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Mayo Clinic.
1. Voorbereiding en micro-injectie van transgenconstructies voor de ontwikkeling van LMO1 transgene zebravislijn met overexpressie in PSNS
- Om de LMO1-pDONR221-instapkloon te ontwikkelen, versterkt u het coderende gebied van menselijk LMO1 uit cDNA verkregen uit menselijke cellijn met behulp van PCR.
- Maak een reactie van 25 μL zoals hier beschreven: 2,5 μL 10x standaard Taq-reactiebuffer, 0,125 μL Taq DNA-polymerase, 0,5 μL 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA-sjabloon, 0,5 μL 10 μM voorwaartse LMO1 ATTB1-primer, 0,5 μL 10 μM omgekeerde LMO1 ATTB2-primer en 18,875 μL water.
OPMERKING: Gebruik forward LMO1 ATTB1 primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' en omgekeerdE LMO1 ATTB2 primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-3' - Versterken met behulp van het volgende programma: 1 cyclus van 94 °C, 2 min; gevolgd door 30 cycli van (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) en 72 °C, 7 min.
- Maak een reactie van 25 μL zoals hier beschreven: 2,5 μL 10x standaard Taq-reactiebuffer, 0,125 μL Taq DNA-polymerase, 0,5 μL 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA-sjabloon, 0,5 μL 10 μM voorwaartse LMO1 ATTB1-primer, 0,5 μL 10 μM omgekeerde LMO1 ATTB2-primer en 18,875 μL water.
- Kloon LMO1 PCR-product in de pDONR221 gateway donor vector door BP recombinase reaction6,13 (PCR fragment + Donor vector = Entry Clone).
- Meng voor een reactie van 10 μL 1 μL gezuiverd LMO1 PCR-product (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 donorvector en 6 μL TE-buffer (pH 8,0) met 2 μL BP-enzymmix, incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C en transformeer tot TOP10 competente E. coli met behulp van het protocol van de fabrikant.
- Verdeel vervolgens 50-200 μL uit de transformatieflacon op een Luria Bouillon (LB) agarplaat met 50 μg/ml kanamycine en incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Selecteer klonen door een enkele kolonie in te enten in 2-5 ml LB met 50 μg / ml kanamycine en 's nachts (16-18 uur) bij 37 °C te kweken.
- Gebruik 2 ml nachtelijke bacteriekweek voor plasmide-isolatie volgens het protocol van de fabrikant. Om het LMO1-plasmide te verifiëren, stuurt u plasmidemonsters uit voor sequencing met M13-F primer (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
- Om een dβh-pDONRP4-P1R-invoerkloon te genereren, verkrijgt u dβh PCR-product6,13 door het promotorgebied van 5,2 kb te versterken met behulp van de CH211-270H11 BAC-kloon als sjabloon om een 20 μL-reactie voor te bereiden zoals eerder beschreven in stap 1.1.1. Gebruik de volgende PCR-programmaparameters: 94 °C, 2 min; 10 cycli van 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 cycli van 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (met voorwaartse primer 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
CCCCTTTTTAGG-3' en omgekeerde primer 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
TCGTCTTTTGA-3').
OPMERKING: Vanwege de lange DNA-sjablonen in deze stap, zorg voor het gebruik van een geschikt PCR-systeem voor nauwkeurige PCR-versterking. - Kloon dβh PCR-product in de pDONRP4-P1R gateway donor vector door BP recombinase reaction6,13 (PCR fragment + Donor vector = Entry Clone).
- Meng 1 μL gezuiverd dβh PCR-product (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R donorvector en 6 μL TE-buffer (pH 8,0) met 2 μL BP-enzymmengsel in een totaal van 10 μL reactie, incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C.
- Transformeer naar TOP10 competente E. coli volgens het protocol van de fabrikant. Isoleer het plasmide zoals beschreven in stappen 1.2.2-1.2.4 en controleer het plasmide door sequencing met M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') en M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') primers.
- Genereer de expressieconstructie dβh:LMO1 .
- Combineer 1 μL van elke instapkloon (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 en p3E-polyA11) (elk 20 fmole), 1 μL (60 ng/μL) gemodificeerde bestemmingsvector met I-SceI-herkenningsplaatsen en 4 μL TE-buffer (pH 8,0) met 2 μL van het LR-recombinase-enzymmengsel. Incubeer dit mengsel gedurende 1 uur bij 25 °C.
- Terwijl u het protocol van de fabrikant volgt, transformeert u bacteriën in chemisch competente TOP10 E. coli. Isoleer plasmide zoals beschreven in stap 1.2.2-1.2.4 en controleer plasmide door sequencing met DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') en LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') primers.
- Genereer dβh:mCherry DNA-construct met een gateway-systeem door entry-klonen van een 5,2-kb dβh-promotor, pME-mCherry en p3E-polyA te combineren in de gemodificeerde bestemmingsvector die I-SceI-herkenningsplaatsen bevat, zoals eerder vermeld in stap 1.5.16. Isoleer plasmide zoals beschreven in stap 1.2.2-1.2.4 en controleer plasmide door sequencing met DBH Forward primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
- Lineariseer dβh:LMO1 DNA-construct en dβh:mCherry DNA-construct (in een verhouding van respectievelijk 3:1) in een totaal van 15 μL reactievolume met 1 μL I-SceI-enzym (5 U/μL) en 0,75 μL buffer (10x), en incubeer bij kamertemperatuur gedurende minimaal 4 uur of 's nachts. Zorg ervoor dat de DNA-concentratie niet hoger is dan 750 ng in reactie.
- Voeg de volgende dag en na linearisatie van constructen 0,5 μL vers I-SceI-enzym (5 U / μL) en 0,5 μL van 0,5% fenolrood toe aan 5 μL totaal DNA-mengsel uit de vorige stap van 1,7. Micro-jecteer de totale oplossing (van 50-80 pg gelineariseerd DNA) in eencellige fase wild-type AB-embryo's (en maar liefst 500 embryo's) met behulp van glazen micropipettenaald met een diameter van 1,0 mm, zoals eerder beschreven17. Bewaar het resterende DNA-mengsel bij -20 °C voor toekomstige injecties.
2. Screen en verifieer LMO1 transgene vislijn op kiembaanoverdracht van LMO1 en mCherry
- Verdoven 3-4 dagen na de bevruchting (dpf) geïnjecteerde embryo's met 0,02% tricaïne en screen ze op fluorescerende mCherry-expressie, die zich overal in het vislichaam presenteert als gevolg van de mozaïektransgenese. Breng mCherry-positieve embryo's over in een petrischaaltje met vers eiwater en breng embryo's tot geslachtsrijpheid in overeenstemming met het zebravisboek21.
OPMERKING: Verwacht dat de verhouding van positieve vissen varieert, afhankelijk van de expertise en ervaring van onderzoekspersoneel. Beginnende amateurs kunnen bijvoorbeeld een lage integratiegraad van 10% hebben, vergeleken met die van een expert van ≥50%. - Om de stichtervis te bepalen met dβh:LMO1 en dβh:mCherry transgenen geïntegreerd in geslachtscellen, kruisen enkele paren geïnjecteerde mCherry-positieve F0 geslachtsrijpe vissen uit de vorige stap (2.1) met WT AB-vis. Screen de F1-generatie op mCherry-positieve embryo's met 3-4 dpf.
- Om te bevestigen dat de mCherry-positieve vissen LMO1-transgen dragen, isoleert u het gDNA van F1 mCherry-positief enkel embryo met behulp van de gDNA-extractiebuffer, die bevat: 12,5 μL 4x lysisbuffer (500 μL van 1 M Tris met een pH van 8,4, 2,5 ml 1 M kaliumchloride en 47 ml gezuiverd water), 35 μL gezuiverd water, en 2,5 μL proteïnase K bij 10 mg/ml. Incubeer het monster gedurende 16 uur bij 55 °C, gevolgd door 10 min bij 98 °C.
- Gebruik het geëxtraheerde gDNA (2 μL) als sjabloon voor de genotypering PCR met primers: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' en LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', en het volgende PCR-programma: 1 cyclus van 94 °C, 10 min; 35 cycli van (94 °C voor 30 s, 60 °C voor 30 s; 68 °C, 30 s); en 68 °C gedurende 7 min. Bevestig het versterkte 182 bp-fragment door te sequencen.
- Na bevestiging van het genotype, breng de resterende mCherry-positieve F1-embryo's tot volwassenheid in overeenstemming met de standaardrichtlijnen van het zebravisboek21. Vin clip en genotype ze op de leeftijd van 2-3 maanden met behulp van stappen 2.3-2.4 uit het bovenstaande protocol om de integratie van het LMO1-transgen in de vis verder te bevestigen.
OPMERKING: De LMO1-positieve F1-vis is de stabiele transgene vis [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (aangeduid als LMO1-lijn ). - Fok F1 LMO1 stabiele transgene vissen met WT-vissen en herhaal indien nodig om deze lijn te vermeerderen.
3. Outcross van LMO1 - en MYCN-transgene lijnen om een metastatisch model te creëren
- Zodra de LMO1 transgene zebravislijn is gegenereerd, gekruist met MYCN-lijn6,17 om heterozygote transgene vislijn te ontwikkelen die zowel MYCN als LMO1 overexpressie geeft.
- Sorteer bij 1 dpf het nageslacht van outcross voor EGFP-expressie met stereoscopische fluorescentiemicroscoop, die zich presenteert als EGFP-positieve punten in het achterhersenengebied.
OPMERKING: Als alternatief, zo niet alle embryo's worden gesorteerd voor MYCN met 1 dpf, verhoog de embryo's tot volwassenheid en genotype door het knippen van de vin en met behulp van eerder vermelde richtlijnen uit stap 2.3-2.4 voor gDNA-isolatie en PCR-genotypering, met primers: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', en het volgende programma met standaard Taq polymerase: 1 cyclus van 94 °C gedurende 3 minuten, 35 cycli van (94 °C voor 30 s, 60 °C voor 30 s en 68 °C gedurende 3 minuten) en 68 °C voor 7 minuten met een verwachte amplicongrootte van 145 bp. - Na sortering voor EGFP bij 1 dpf, isoleer gescreende embryo's in afzonderlijke petrischalen en labelschalen als: MYCN+ (EGFP-positief) of MYCN- (EGFP-negatief).
- Visualiseer en sorteer bij 3-4 dpf embryo's van beide groepen (stap 3.3) voor LMO1-expressie met een stereoscopische fluorescentiemicroscoop. Zoek naar rode fluorescerende eiwitexpressie als vlekken in zowel het superieure cervicale ganglion als niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen in het hoofdgebied, vooral in oblongata medulla van de achterhersenen6,13.
OPMERKING: Screen op mCherry /LMO1 voordat embryo's 5 dpf bereiken, omdat met lucht gevulde zwemblazen zich tegen die tijd volledig ontwikkelen en ervoor zorgen dat de embryo's drijven, wat resulteert in een moeilijke microscopische focussering van de PSNS-cellen tijdens het sorteerproces. - Zodra het sorteren is voltooid, isoleert u gesorteerde vis in vier groepen van verschillende genotypen en labelt u zoals hieronder. Kweek de gesorteerde vis in identieke omstandigheden volgens de standaardprotocollen uit het zebravisboek21.
- Alleen MYCN (EGFP-positief),
- Alleen LMO1 (mCherry-positief),
- Mycn; LMO1 (EGFP en mCherry dubbel positief),
- WT (EGFP en mCherry dubbel negatief).
4. Visualiseren van tumorbelasting in transgene zebravislijnen
- Bij 4 weken-na-bevruchting (wpf) sorteerde anesthetize gesorteerde vis uit stap 3.5 met 0,02% tricaïne in een petrischaaltje.
- Visualiseer tumoren met een stereoscopische fluorescentiemicroscoop door vissen voorzichtig om te draaien met een metalen spatel aan beide laterale zijden om de tumor te bekijken. Verwacht dat tumoren zich presenteren als enkele EGFP-, enkele mCherry- of dubbele EGFP-en-mCherry-positieve massa's die voortkomen uit het interrenale kliergebied (in de buurt van hoofd en nier).
OPMERKING: Het is mogelijk dat het initiële tumorbegin meestal wordt gepresenteerd met een helderdere en grotere fluorescentiepositieve massa aan één kant van de interrenale klier, daarom is het cruciaal om beide zijden van vissen te visualiseren om te voorkomen dat een vroege tumor begint te missen. - Na identificatie van de mogelijke tumordragende vissen, isoleer de vis in een aparte tank met de juiste labels, waaronder geboortedatum, datum waarop de tumor is gescreend en genotype.
- Herhaal bij 6 wpf eerdere stappen 4.1-4.3 om tumordragende vissen en niet-tumordragende vissen opnieuw te screenen om de aanwezigheid van tumoren voor eerder gescreende tumordragende vissen te bevestigen of nieuwe mogelijke tumordragende vissen te identificeren. Zoek naar aanhoudende of verhoogde grootte van fluorescentie-positieve massa in bevestigde tumordragende vissen.
- Na het identificeren van tumordragende vissen, controleert u ze tweewekelijks op bewijs van tumorcelmigratie, die zich presenteert als kleine EGFP- en / of mCherry-positieve tumormassa's ver van de primaire plaats van tumorgenese (interrenaal kliergebied). Isoleer deze vissen indien nodig in afzonderlijke tanks en label op de juiste manier om mogelijke metastase aan te geven.
- Om de metastase verder te bevestigen, blijft u deze vissen regelmatig (om de twee weken) volgen totdat de verre fluorescentiepositieve tumormassa's duidelijk toegenomen omvang vertonen, wat wijst op groei van tumoren op de metastatische plaatsen.
5. Weefselverwerking en paraffinesectie van tumordragende vissen
OPMERKING: Voer deze stap uit om de spontaan ontwikkelde primaire en/of gemetastaseerde tumoren in MYCN en MYCN te karakteriseren; LMO1 transgene vis.
- Na identificatie en verificatie van tumordragende vissen, offert u vis vanaf stap 4.6 in een petrischaal door vis onder te dompelen in 0,02% tricaine om eerst te verdoven en vervolgens de tricaïnedosering te verhogen totdat de vis niet langer respirateert. Snijd de vis in twee stukken - met één stuk met de kop en een deel van het middengedeelte van het lichaam (inclusief tumor), en een ander stuk met de rest van het middengedeelte en de staart van de vis.
- Bevestig beide vissecties met 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rocker. Om de fixatie-efficiëntie te verbeteren, vervangt u de buffer door verse 4% PFA om de penetrantie naar de interne organen effectief en snel te verhogen. Laat vis met verse bevestigingsbuffer op een wip bij 4 °C 's nachts of gedurende 48 uur staan.
LET OP: PFA is giftig. Aangezien voorzorgsprocedures en de juiste verwijdering van reagens afhankelijk zijn van de voorschriften van uw instelling, moet u de juiste richtlijnen zoeken voordat u reagens gebruikt en verwijdert. - Plaats voorafgaand aan de verwerking monster(s) gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur in een 100% snelle ontkalkingsoplossing. Zorg ervoor dat u een niet-metalen container gebruikt en controleer monster (s) tijdens de incubatie om overontkalking te voorkomen. Als het monsterweefsel er sterk afgebroken uitziet, plaatst u het monster in water of bij 4 °C om het ontkalkingsproces te vertragen.
- Eenmaal gefixeerd en ontkalkt, wast u vismonster(s) gedurende 1 uur met stromend leidingwater en plaatst u het in processorcassette(s). Als er meer dan één monster is, scheidt u elk in een eigen cassette.
- Droog het weefsel uit en bereid het voor op inbedding van paraffine door cassette(s) met vis in de weefselverwerker te plaatsen, waar de monsters worden ondergedompeld in verschillende oplossingen, respectievelijk als volgt: 70% ethanol (60 min, 40 °C), 85% ethanol (50 min, 40 °C), 95% ethanol (40 min, 40 °C) tweemaal, 100% ethanol (30 min, 40 °C), een andere verse oplossing van 100% ethanol (50 min, 40 °C) tweemaal, xyleen (30 min, 40 °C), een andere verse oplossing van xyleen (50 min, 40 °C), een andere verse xyleen (50 min, 45 °C), paraffine (30 min, 45 °C), paraffine (20 min, 58 °C) driemaal.
- Nadat het weefsel is verwerkt, verwijdert u de cassette(s) uit de processormachine met behoud van de organisatie van elke cassette en zorgt u ervoor dat de vismonsters niet worden gemengd.
- Kies de juiste maat mal op basis van de grootte van de vis en zorg ervoor dat de mal de hele cassette met het vismonster past. Bedek de bodem van de mal met vloeibare paraffine bij 60 °C.
- Plaats onmiddellijk cassette met de vis bovenop de mal (zorg ervoor dat de vis op zijn platte zijde wordt gelegd voor sagittale secties) met vloeibare paraffine en vul af met paraffine aan de bovenkant van de mal om de vis volledig in te bedden.
- Plaats de voltooide vorm op de koude plaat van de sectiemicrotoom totdat de paraffine is uitgehard.
- Zodra het paraffineblok hard is, wat kan worden beoordeeld door visueel een hogere opaciteit en een stevige aanraking van het blok te observeren, verwijdert u het blok voorzichtig uit de mal. Schraap eventuele overtollige paraffine voorzichtig van de zijkanten van de cassette af.
- Sectie het in paraffine ingebedde visblokagittaal op 4 micron op de microtoom en drijf de secties op een warmwaterbad bij 40 °C met gedestilleerd water.
- Breng de secties voorzichtig over op positief geladen dia's en bak ze in de oven op 60 °C gedurende 30 minuten voordat u gaat vlekken voordat u doorgaat naar stap 6, 7 of 8.
6. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van paraffine secties voor pathologie review
- Plaats dia's met paraffinesecties uit stap 5.12 in een diahouder. In een chemische zuurkast, deparaffiniseren met xyleen 3 keer, 5 min elk. Gooi de oplossing na elk gebruik weg.
- Rehydrateer secties met 100% ethanol gedurende 3 minuten en herhaal tweemaal met verse 100% ethanol. Vervang 100% ethanol door 95% ethanol gedurende 3 minuten en vervolgens 80% ethanol gedurende 3 minuten.
- Spoel secties met gedestilleerd water gedurende 5 min. Terwijl de secties in water wassen, moet u geoxideerde deeltjes uit hematoxyline verwijderen door het oppervlak van hematoxyline te filteren of af te romen met een pluisvrij doekje.
- Dep het overtollige water uit de diahouder met pluisvrije doekjes van professionele kwaliteit en bevlekglijdt 50% hematoxyline (1:1 verdunning met gedestilleerd water) gedurende 2-5 minuten, afhankelijk van de gewenste kleuringsvoorkeur en reagensverslechtering. Gooi hematoxyline weg wanneer de kleur van de oplossing verandert van pruim naar blauw / bruin of wanneer de kleuringstijd overmatig wordt. Spoel de glaasjes gedurende 20 min af met stromend kraanwater.
- Ontkleur de secties in 1% zure ethanol (3,3 ml zoutzuur met 50 ml 70% ethanol) door de dia's snel meerdere keren te dopen. Dia's kunnen tot 3 s worden ondergedompeld, maar hoe langer de dia's worden gedompeld, hoe lichter de secties worden.
- Spoel de glaasjes twee keer in leidingwater gedurende 1 minuut elk, en één keer met gedeïoniseerd water. Als optie kunnen dia's in dit stadium 's nachts worden achtergelaten, wekend in water.
- Dompel de secties gedurende 3 s onder in 1,36% lithiumcarbonaatoplossing (47 g lithiumcarbonaat, 3500 ml water). Zorg ervoor dat u de secties niet te veel incubeert, want hoe langer de tijd in lithiumcarbonaatoplossing, hoe groter de kans dat het weefsel zal drijven.
- Spoel de secties gedurende 5 minuten in leidingwater en dep het overtollige water uit de diahouder met pluisvrije doekjes van professionele kwaliteit.
- Houd de glaasjes in 100% gebruiksklare eosine gedurende 15-30 s en droog onmiddellijk uit met 95% ethanol tweemaal gedurende 5 minuten elk. Vervang tweemaal door 100% ethanol gedurende elk 5 minuten en gooi de oplossingen na elk gebruik weg.
- Verwijder de secties in xyleen gedurende 15 minuten en herhaal tweemaal gedurende 3 keer in totaal. Optioneel kunnen de dia's 's nachts bij kamertemperatuur in xyleen worden gelaten om overtollig water beter te zuiveren.
- Laat de glijden aan de lucht drogen in de chemische zuurkast en monteer vervolgens een afdekslip met behulp van montagemedium om weefselmonster af te dichten.
- Visualiseer en beeld de gekleurde weefselsecties in onder microscopie. Onderzoek zorgvuldig de tumoren op de primaire plaats (het interrenale kliergebied in de hoofdnier) en de verre sporadische metastasen in andere weefsels en organen van de vis. Stuur bevlekte dia's voor weefselsecties die door pathologen moeten worden beoordeeld. Op basis van de vergelijkbare pathologische kenmerken van het vismodel als menselijk neuroblastoom, verwacht de tumoren die zijn ontstaan in MYCN-only of MYCN; LMO1-vissen worden voor het eerst gediagnosticeerd als neuroblastoom door pathologen.
7. Immunohistochemische analyse (IHC) met antilichamen tegen NB-marker en overexpressie transgenen om de verspreiding van tumor en hun sympathoadrenale afstammingseigenschap verder te bevestigen
- Beitsen met volautomatisch beitssysteem
- Om het IHC-resultaat beter te vergelijken met dat van H&E-kleuring, selecteert u aangrenzende dia's uit stap 5.12 voor IHC-kleuring.
OPMERKING: Hoewel een geautomatiseerd kleuringssysteem snellere en minder bewerkelijke resultaten mogelijk maakt, kan een handmatig protocol voor IHC-kleuring worden gebruikt in afwezigheid van dergelijke door te verwijzen naar stappen van subsectie 7.2. - Verdun het primaire antilichaam tegen tyrosinehydroxylase (TH) (1:500), een neuroblastoommarker, op basis van de gewenste concentratie en de totale benodigde hoeveelheid met het overeenkomstige primaire antilichaamverdunningsmiddel van het geautomatiseerde systeem.
OPMERKING: Optimale antilichaamconcentraties kunnen variëren afhankelijk van antilichaam en weefsel. - Aangezien het geautomatiseerde systeem gebruik maakt van warmte-geïnduceerde antigeenrecuperatie aan boord met epitoop-ophaaloplossing gedurende 20 minuten en het bijbehorende detectiereagens van het systeem, moet u ervoor zorgen dat de parameters voor de machine zijn ingesteld als: Peroxidaseblokkering, 5 min; Primair antilichaam met gewenste concentratie, 15 min; gebiotinyleerd anti-konijn IgG secundair antilichaam (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; gemengd DAB intens substraat, 5 min; en Hematoxyline, 5 min.
- Zodra de instellingen zijn ingesteld, plaatst u de antilichaamlade in het apparaat. Stel de dia's in door een nieuwe case te maken, die de dia's labelt. De machine is nu geladen en klaar om te draaien (wassen, vlekken en counterstaining).
- Zodra de dia's zijn ontdaan, gekleurd en verzinkt met behulp van de geautomatiseerde machine, droogt u de dia's uit in ethanolgradiënten van 70%, 95% en 100% gedurende elk 5 minuten. Dompel dia's van secties opnieuw onder in 100% verse ethanol gedurende 5 minuten.
- Verwijder de secties in xyleen gedurende 5 minuten, twee keer, of laat dia's een nacht in xyleen glijden om overtollig water beter te zuiveren.
- Laat de schuiven aan de lucht drogen in de chemische zuurkast en monteer vervolgens een afdekslip met behulp van een bevestigingsmedium. Visualiseer en beeld de gekleurde weefselsecties in met microscopie.
- Om metastase in het vismodel stevig te bevestigen, vergelijkt u de dia's gekleurd met antilichamen tegen neuroblastoommarker uit stap 7 met die gekleurd door H & E uit stap 6.
OPMERKING: Verwacht positieve kleuring te zien voor neuroblastoommarker, TH, in alle tumorcellen geïdentificeerd door H & E-kleuring. Verwacht ook geen positieve kleuring voor TH in aangrenzende weefsels waar de gemetastaseerde tumoren werden geïdentificeerd in LMO1; MYCN vis. Zorg ervoor dat u alleen-WT- en MYCN-vissen selecteert die van dezelfde leeftijd zijn als MYCN; LMO1 vist voor deze analyse om de mogelijkheid uit te sluiten dat de gemetastaseerde tumoren multifocale primaire tumoren zijn.
- Om het IHC-resultaat beter te vergelijken met dat van H&E-kleuring, selecteert u aangrenzende dia's uit stap 5.12 voor IHC-kleuring.
- Handmatig beitsen zonder geautomatiseerd IHC-kleuringssysteem
- Nadat de dia's zijn gebakken, selecteert u aangrenzende dia's uit stap 5.12 om een betere vergelijking tussen H & E- en IHC-kleuring mogelijk te maken om te deparaffiniseren. In een chemische zuurkast ontwas en rehydrateer de glaasjes met xyleen met behulp van respectievelijk de vorige stappen 6.1 en 6.2.
- Na deparaffinisatie en rehydratatie, week glaasjes in endogene peroxideblokkerende oplossing (1x PBS met 0,1% natriumazide en 0,3% waterstofperoxide) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was glijden in verse 1x PBS gedurende 3 minuten en herhaal tweemaal voor een totaal van 3 keer.
LET OP: Natriumazide is acuut giftig. Zorg ervoor dat u voorzorgsprocedures en de juiste verwijdering van reagens toepast, afhankelijk van de voorschriften van uw instelling. - Haal antigeen op door dia's in oplossing te incuberen met proteïnase K (1:500 in 1x PBS) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was dia's 3 keer met 1x PBS gedurende 3 minuten elk.
- Blokglijden door te broeden met 5% geitenserum in 1x PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur op rocker. Was dia's met verse 1x PBS tweemaal gedurende 3 minuten elk.
- Voeg 4 druppels Avidin-blokkeringsoplossing direct toe aan de dia en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van glijden met verse 1x PBS tweemaal gedurende 3 minuten elk, voeg 4 druppels Biotine blokkerende oplossing toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Na het blokkeren van dia's, incuberen in primair antilichaam van tyrosinehydroxylase (TH) (1:500) gedurende 45-60 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: Kleuring met extra antilichamen tegen transgenen en andere relevante markers om de fysiologie en activiteit van primaire tumor en andere gemetastaseerde plaatsen aan te pakken. Optimale antilichaamconcentraties kunnen variëren afhankelijk van antilichaam en weefsel. - Was glijden met verse 1x PBS gedurende 3 minuten, herhaal tweemaal met een totaal van 3 keer.
- Incubaatglaasjes in secundair antilichaam van gebiotinyleerd antikonijn IgG secundair antilichaam (1:500) verdund in blokkerende oplossing gedurende 45-60 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de vorige wasstap 7.2.7.
- Voeg HRP geconjugeerde Avidin toe (1:300 in 1x PBS) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was dia's 3 keer met verse 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
- Bereid 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) oplossing (2,5 ml gedestilleerd water, 1 druppel kitbuffer, 1 druppel waterstofperoxide en 2 druppels DAB uit de kit) en plaats druppels DAB rechtstreeks op dia's in de buurt van een microscoop. Na het toevoegen van DAB, observeer de kleurveranderingsreactie op de dia's onder microscoop. Zodra de gewenste kleurintensiteit is bereikt, stopt u de reactie door schuifsecties in koud gedestilleerd water te plaatsen.
- Counterstain de dia's met verse 50% hematoxyline door monsters gedurende een paar korte seconden onder te dompelen of te dopen en terug te plaatsen in gedestilleerd water. Herhaal dit naar wens, maar normaal gesproken zou één keer voldoende moeten zijn, omdat weefselsecties dun zijn.
- Droog weefselmonsters uit op dia's in alcoholgradiënt zoals eerder beschreven in stap 7.1.5 en ga verder met de resterende stappen (met de laatste stap als 7.1.8) om de IHC-analyse te voltooien.
8. Picrosirius rode kleuring van paraffineglaasjes voor collageenaccumulatie in tumoren als mechanismestudie
- Herhaal stap 6.1-6.3 om paraffinesecties op dia's af te wassen, te hydrateren en te wassen.
- Na het deppen van het overtollige water uit de diahouder met pluisvrije doekjes van professionele kwaliteit, beits je gedurende 10 minuten 50% hematoxyline in. Spoel de glaasjes gedurende 10 min af met stromend kraanwater.
- Breng de glaasjes over in Picrosirius Red en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de glaasjes tweemaal in aangezuurd water (5 ml ijsazijn in 1 l kraan- of gedestilleerd water) en broed gedurende 5 minuten op shaker.
- Decanteer eerst het grootste deel van het water van glijbanen voordat u secties op dia's fysiek schudt en dept om zoveel mogelijk water te verwijderen.
- Plaats snel glijden in drie wisselingen van 100% ethanol om paraffinesecties uit te drogen.
- Herhaal stap 6.10 en 6.11 om dia's in xyleen te verwijderen en het monster te monteren. Vervolgens beeld met samengestelde microscoop die is uitgerust met een camera.
- Tel met Behulp van ImageJ de picrosirius rood-positieve collageenvezels in ten minste drie willekeurige velden voor elke sectie. Vergelijk tussen dia's van MYCN en MYCN; LMO1 vissecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen of LMO1 synergetisch werkt met MYCN om de NB-pathogenese te beïnvloeden, werden transgene constructies die de expressie van LMO1 (dβh:LMO1 en dβh:mCherry) of MYCN (dβh:EGFP-MYCN) in de PSNS-cellen onder controle van de dβh-promotor stimuleren, geïnjecteerd in zebravisembryo's13. Zoals geïllustreerd in figuur 1A, werden na de ontwikkeling van stabiele transgene lijnen en validatie van hun genotypen, heterozygote MYCN- en LMO1-vissen gekruist. Hun nakomelingen werden gesorteerd op MYCN (EGFP+) of LMO1 (mCherry+) expressie bij respectievelijk 1 dpf of 3-4 dpf. Van MYCN-overexpressie is aangetoond dat het de ontwikkeling van PSNS onderdrukt6. De EGFP-MYCN-expressie is dus prominenter aanwezig in de niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen bij 1 dpf6, zoals de craniale ganglia (CA), arch-associated catecholaminergic neurons (AAC) en medulla oblongata (MO). Door de instabiliteit van EGFP-MYCN eiwit wordt het EGFP signaal na 2 dagen dimmer. Daarentegen is de mCherry-expressie prominent aanwezig in beide PSNS-cellen, zoals het superieure cervicale ganglion en niet-PSNS dopaminerge neuronale cellen, waaronder CA, AAC en MO, vanaf 3 dpf en verder6. Vandaar dat de nakomelingen van MYCN en LMO1 paring worden gesorteerd op 1 dpf voor MYCN (EGFP+) en op 3 dpf voor LMO1 (mCherry+). De gesorteerde vis werd als volgt onderverdeeld in verschillende genotypische groepen: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1, en iv) WT, en verhoogd in dezelfde omstandigheden. Vanaf 4 wpf werden de nakomelingen tweewekelijks gescreend op het bewijs van tumoren door fluorescerende microscopie. Fluorescerende positieve tumormassa's werden gedetecteerd in de weefsels en organen ver van de primaire tumorplaats in de samengestelde transgene vis met overexpressie van zowel MYCN als LMO1, maar niet in de transgene vissen met expressie van MYCN alleen (figuur 1B).
Om de metastase bij deze transgene dieren verder te verifiëren, tumordragende MYCN en MYCN; LMO1 transgene vissen op de leeftijd van 5 tot 9 maanden werden onderworpen aan paraffinesectie en immunohistochemische analyses met een antilichaam tegen de neuroblastoommarker, TH. De representatieve resultaten voor een MYCN; LMO1-vis is weergegeven in figuur 2. H&E-kleuring van de sagittale secties toonde aan dat de primaire tumor ontstond uit het interrenale kliergebied, het zebravisequivalent van de menselijke bijnier, de meest voorkomende plaats van primaire ziekte bij neuroblastoompatiënt12,22 (figuren 2A,B). Samengesteld uit kleine, ongedifferentieerde en ronde kankercellen met hyperchromatische kernen, vormde de tumor vaak lagen die histologisch vergelijkbaar waren met de menselijke neuroblastomen zoals eerder beschreven6 (figuren 2A, B). In overeenstemming met de waarneming met fluorescentiemicroscopie (figuur 1B) werden wijdverspreide tumormassa's op afstand van de interhalue klier gedetecteerd in meerdere regio's, waaronder: distale deel van de nier (de primaire volwassen hematopoietische niche van zebravissen en vergelijkbaar met het beenmerg van zoogdieren23) (figuur 2A,C), baan (figuren 2A,D), kieuw (analoog aan de zoogdierlong24) (figuren 2A, E), milt (analoog aan de zoogdierlymfeklier25) (figuur 2A en 2F) en binnenwand van de atriale hartkamer (figuren 2G). Veel van deze metastasen recapituleren de gemeenschappelijke plaatsen van metastasen die worden gezien bij patiënten met een hoog risico neuroblastoom, waaronder het beenmerg, de lymfeklier, het baangebied en de long13,23,24,25. Verdere immunohistochemie met het antilichaam tegen TH bevestigde de PSNS neuroblastlijn van tumorcellen op de primaire tumor en alle metastatische plaatsen (figuren 2H-M).
In een poging om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de synergie tussen MYCN en LMO1 bij het versnellen van tumor gemetastaseerde verspreiding beter te begrijpen, werd ontdekt dat de expressieniveaus van een panel van genen die betrokken zijn bij tumorcel-extracellulaire matrixinteractie significant verhoogd waren in de vistumoren met overexpressie van zowel MYCN als LMO113. Om te onderzoeken of de extracellulaire matrix inderdaad werd beïnvloed door de veranderde genexpressie in LMO1-overexpressie tumoren die leidden tot verbeterde tumorverspreiding of -migratie, de paraffinesecties van MYCN-only en MYCN; LMO1-tumoren werden gekleurd met Picrosirius-rood (PSR), een zeer selectieve kleuring voor collageenvezels, om collageenafzetting en extracellulaire matrix (ECM) stijfheid te beoordelen26,27. Zoals aangetoond in figuur 3A-E, waren er aanzienlijk versterkte hoeveelheden en verhoogde dikte van PSR-gekleurde collageenvezels gevonden in MYCN; LMO1-tumoren, in vergelijking met de tumoren die alleen MYCN tot expressie brengen. Samen tonen deze resultaten aan dat de overexpressie van LMO1 de tumor-ECM kan hermodelleren om de stijfheid te verhogen en daarom de verspreiding van tumorcellen te vergemakkelijken.
Figuur 1: Illustratie van de tumorscreeningstest op nakomelingen uit de fokkerij van MYCN - en LMO1-transgene zebravislijnen. (A) Schematische illustratie van sortering en tumorscreening van MYCN en/of LMO1-overexpressie stabiele transgene vissen voor neuroblastoomstudie. Bovenste panelen: representatieve foto's van EGFP-MYCN+ embryo's op 1 dag na defertilisatie (dpf) (dorsale weergave aan de linkerkant en laterale weergave aan de rechterkant). Onderste panelen: Representatieve foto's van mCherry-LMO1+ embryo's met 3 dpf (zijdelingse weergave links en ventrale weergave rechts). OC, arch-geassocieerde catecholaminerge neuronen; CA, craniale ganglia; en MO, medulla oblongata. Schaalbalk, 100 μm. Gemaakt met BioRender.com (B) Coexpressie van LMO1 en MYCN bevordert neuroblastoommetastase. Links: Transgene vissen die alleen MYCN (MYCN) overexpressie geven met EGFP-expresserende tumor (witte pijl) op de leeftijd van 36 maanden. Rechts: Transgene vis overexpressie zowel MYCN als LMO1 (MYCN; LMO1) met een mCherry-positieve tumormassa op de primaire plaats (IRG, witte pijl) en meerdere gemetastaseerde plaatsen (vaste pijlpunten) op de leeftijd van 36 maanden. Schaalbalk, 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Co-overexpressie van MYCN en LMO1 bevordert metastasen van neuroblastoom op afstand in transgene zebravismodellen. (A-G) H&E-gekleurde sagittale secties van MYCN; LMO1 transgene vis op de leeftijd van 6 maanden. (H-M) Vergrote weergaven van immunohistochemische analyses van MYCN; LMO1 transgene vissen in sagittale weefselsecties, met behulp van tyrosinehydroxylase (TH) antilichaam. Witte doos schetst de interrenale klier (b, h), met vergrote weergaven in panelen B en H. Gedissemineerde tumorcellen werden gevonden in niermerg (c, i, C en I met effen zwarte pijlpunten), de sclera van het oog (d, j, D en J met zwart omlijnd en wit gevulde open pijlen), de kieuw (e, k, E en K met zwart omlijnde en wit gevulde open pijlpunten), de milt (f, l, F en L met effen zwarte pijlen), en de hartkamer (G en M met zwart omlijnde en wit gevulde dubbele pijlpunten). Schaalstaven, 100 μm (A) en 50 μm (B-M). Dit cijfer is aangepast van Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes met MYCN om neuroblastoom initiatie en metastase te bevorderen. Kankercel. 32, 310-323 (2017)13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verhoogde LMO1-expressie bevordert collageenafzetting en ECM-stijfheid, wat leidt tot gemakkelijkere verspreiding van tumorcellen in zebravismodellen. (A-D) Representatieve lichtmicroscopiebeelden van collageenvezels gekleurd door Picrosirius-rood (PSR) alleen in MYCN (A, B) of MYCN; LMO1 (C,D) transgene zebravis. (B) en (D) worden vergroot uit de ingepakte gebieden van (A) en (C), met behulp van pijlen (A en B) en pijlpunten (C en D) om respectievelijk de PSR-positieve collageenvezels aan te geven. Schaalstaven, 100 μm (A en C) en 50 μm (B en D). (E) Kwantificering van met PSR bevlekte gebieden op tumorsecties van alleen MYCN of MYCN; LMO1 transgene vis. De resultaten werden genormaliseerd tot het gemiddelde van PSR-gekleurde gebieden in tumoren die alleen mycn bevatten. De statistieken presenteren zich als de gemiddelde ± SD van drie MYCN-only of drie MYCN; LMO1 tumoren; p = 0,02 bij tweezijdige t-test. Dit cijfer is aangepast van Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes met MYCN om neuroblastoom initiatie en metastase te bevorderen. Kankercel. 32, 310-323 (2017)13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis is de afgelopen decennia vaak gebruikt in onderzoek, vooral in kankeronderzoek, om voor de hand liggende redenen, zoals het onderhoudsgemak, robuuste reproductie en duidelijke voordelen voor in vivo beeldvorming1,28. Het zebravismodel kan gemakkelijk embryonaal worden gemanipuleerd vanwege hun externe bevruchting en ontwikkeling, die goed complementair is aan zoogdiermodelorganismen, zoals ratten en muizen, voor grootschalige genetische studies1,2,3. Bovendien vertoont het zebravisgenoom op hoge niveaus overeenkomsten met het menselijk genoom. Door de gedetailleerde annotaties van het zebravisgenoom te vergelijken met het menselijke referentiegenoom, is aangetoond dat ongeveer 70% van de menselijke genen een zebravisortholoog verkrijgen29. Bovendien zijn andere toepassingen van zebravissen in onderzoek uitgebreid tot medicijnontdekking en patiëntavatars voor geïndividualiseerde kankertherapie30,31. Accumulerende studies hebben aangetoond dat tumoren geïnduceerd in zebravissen vergelijkbaar zijn met menselijke tumoren op histologisch en moleculair niveau, wat kan helpen bij dissectie van tumorinitiatie, progressie en heterogeniteit32,33. Samen toont de zebravis een enorm potentieel als een waardevol diermodel dat kan worden gebruikt om metastase te bestuderen en mogelijke oncogene routes die betrokken zijn bij ziektepathogenese op te helderen.
Met behulp van het transgene zebravismodel met overexpressie van zowel LMO1 als MYCN is de samenwerking tussen deze twee oncogenen in NB tumorigenese en metastase duidelijk aangetoond. Met de huidige beschikbaarheid van krachtige live beeldvormingstechnieken kunnen tumorscreenings gemakkelijk tweewekelijks worden uitgevoerd en kunnen metastases in de loop van de tijd worden getraceerd. De wijdverspreide metastase kan ook verder worden bevestigd door paraffinesectie en antilichaamkleuring. Opvallend is de uitzaaiingen die in de MYCN zijn gedetecteerd; LMO1-zebravissen correleren goed met de veel voorkomende plaatsen van metastase die worden gezien in nb-gevallen met een hoog risico, zoals in het beenmerg, lymfeklieren, baan en long34,35, waardoor zebravissen verder worden ondersteund als een haalbaar en gunstig model voor metastasestudie.
Bovendien kan de hele zebravis vanwege de relatief kleine lichaamsgrootte volledig worden gesneden, wat nog een ander duidelijk voordeel van dit model is, waardoor een grondige karakterisering van de primaire tumor mogelijk is, samen met de metastasen in andere delen van het lichaam. De picrosirius rode kleuring van tumorsecties heeft duidelijk de collageennetwerken in vistumoren benadrukt en toont de verhoogde stijfheid van extracellulaire matrix in tumoren met LMO1-overexpressie . Hoewel deze techniek niet uniek is voor zebravissen, kan de toepassing ervan samen met de high-throughput compound screening op zebravisembryo's die genetisch gemodificeerd zijn of getransplanteerd met tumorcellen een nieuw middel bieden bij het screenen op effectieve verbindingen die zich kunnen richten op extracellulaire matrixremodellering, wat een kritisch proces is dat betrokken is bij tumorcelmetastase.
Stabiele transgene zebravismodellen zijn zeer nuttig voor ons om de bijdrage van kandidaat-oncogenen aan tumorontwikkeling in vivo te begrijpen, hoewel het uitdagend en bewerkelijk kan zijn om deze lijnen te ontwikkelen. Het creëren van een stabiele transgene lijn vereist een lange periode, omdat meerdere generaties moeten worden verworven voordat de lijn zich voortplant. Bovendien kan het propageren van deze lijnen vervelend zijn en kunnen strategische paringsplannen nodig zijn. De productiviteit van een MYCN transgene vis wordt bijvoorbeeld vaak aanzienlijk verminderd zodra de tumor zich heeft ontwikkeld, en homozygote MYCN transgene vissen overleven niet tot ver in de volwassenheid. Om de TRANSGENE VISLIJN VAN MYCN beter te onderhouden, wordt daarom aanbevolen om de heterozygote niet-tumordragende MYCN transgene vis op jongere leeftijd te oversteken met WT of andere genetisch gemanipuleerde vislijnen, zoals de LMO1 transgene vislijn. Om de uitdagingen bij het ontwikkelen en onderhouden van stabiele transgene vislijnen te overwinnen, kan mozaïektransiënte transgenese een alternatieve benadering zijn om snel en effectief de bijdrage van een enkel gen of combinatie van genen aan de tumorinitiatie en progressie in voornamelijk geïnjecteerde vissen te beoordelen. Bovendien kan het mozaïekpatroon van transgene integratie in de primaire geïnjecteerde vis de pathogenese van de ziekte beter nabootsen, vooral die geïnduceerd door somatische gebeurtenissen36.
Net als elk ander diermodel dat in onderzoek wordt gebruikt om kanker te bestuderen, heeft de zebravis echter ook zijn nadelen. Antilichamen specifiek tegen zebraviseiwitten blijven bijvoorbeeld grotendeels onderontwikkeld, hoewel verschillende antilichamen tegen neuroblastoommarkergenen - zoals tyrosinehydroxylase, synaptophysine en HuC - gelukkig goed werken bij zebravissen6,13. Om dit probleem te bestrijden, zijn veel leveranciers begonnen met het testen van hun producten en het voorspellen van het potentieel van hun antilichamen bij kruisreactie met zebraviseiwitten. Meer informatie over gevalideerde antilichamen is ook te vinden in het zebravisinformatienetwerk (ZFIN). Met deze inspanningen zullen steeds meer antilichamen die specifiek zebraviseiwitten kunnen detecteren binnenkort beschikbaar komen voor de zebravisgemeenschap. Een andere uitdaging van het gebruik van zebravissen als een genetisch model om het samenspel van complexe signaalroutes in NB pathogenese te ontleden, is het gedeeltelijk gedupliceerde genoom. Dergelijke genoomduplicatie, die voorkwam in de natuurlijke afkomst van zebravissen37,38, kan vaak leiden tot meer dan één variant van zebravishomologen voor mensen. Dit kan leiden tot een geëvolueerde toename van nieuwe genfuncties of unieke expressiepatronen in het diermodel39. Daarom kan het bij het bestuderen van genen met mogelijke rollen in tumorsuppressie nodig zijn dat meerdere allelen van de gedupliceerde genen tegelijkertijd worden uitgeschakeld om hun tumoronderdrukkingsfunctie aan te tonen, wat een potentieel tijdrovende en technisch uitdagende onderneming kan zijn.
Niettemin kan het transgene zebravismodel alle stadia van tumormetastase in vivo getrouw samenvatten en beschikt het over duidelijke voordelen voor genetische analyse en real-time beeldvorming van tumorverspreiding. Dit modelsysteem biedt daarom een uniek hulpmiddel voor ons om veel ontmoedigende vragen in het veld aan te pakken, zoals wat de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen zijn die ten grondslag liggen aan het meerstappenproces van tumorverspreiding en metastase in vivo , wanneer de NB-cellen zich verspreiden vanuit primaire tumoren, en hoe de tumormicro-omgeving bijdraagt aan NB-metastase. Met de robuustheid van zebravissen voor het screenen en testen van geneesmiddelen, zou het vismodel ook een waardevol middel zijn voor de evaluatie van de werkzaamheid van nieuwe middelen en remmers om gemetastaseerde NB te voorkomen of te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie R01 CA240323 (S.Z.) van het National Cancer Institute; een subsidie W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) van het Amerikaanse ministerie van Defensie (DoD); een V Scholar award van de V Foundation for Cancer Research (S.Z.) en een Platform Grant van het Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); en ondersteuning van het Mayo Clinic Cancer Center en Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
