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Cancer Research

ज़ेब्राफ़िश न्यूरोब्लास्टोमा मेटास्टेसिस का मॉडल

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62416
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

Summary

यह पेपर न्यूरोब्लास्टोमा के ज़ेब्राफ़िश मॉडल में ट्यूमर मेटास्टेसिस को वास्तविक समय में विकसित करने, विशेषता और ट्रैक करने की विधि का परिचय देता है, विशेष रूप से MYCN और LMO1 के ओवरएक्सप्रेशन के साथ ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन में, जो अनायास मेटास्टेसिस विकसित करता है।

Abstract

ज़ेबराफ़िश मानव रोगों, विशेष रूप से कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में उभरा है। ज़ेब्राफ़िश मॉडलिंग में लागू मजबूत ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के साथ- साथ, रखरखाव में आसानी, उच्च उपज उत्पादकता, और शक्तिशाली लाइव इमेजिंग पूरी तरह से जेब्राफ़िश को मेटास्टेसिस और सेलुलर और आणविक आधारों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली बनाती है जो विवो में इस प्रक्रिया को अंतर्निहित करती है। मेटास्टेसिस का पहला ज़ेब्राफ़िश न्यूरोब्लास्टोमा (एनबी) मॉडल डोपामाइन-बीटा-हाइड्रॉक्सिलेस (डीएच) प्रमोटर के नियंत्रण में दो ऑन्कोजीन, MYCN और LMO1 को अतिरंजित करके विकसित किया गया था। सह-overexpressed MYCN और LMO1 कम विलंबता और neuroblastomagenesis के penetrance में वृद्धि हुई, साथ ही साथ ट्यूमर कोशिकाओं के त्वरित दूर मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व किया। यह नया मॉडल मज़बूती से मानव मेटास्टैटिक एनबी की कई प्रमुख विशेषताओं को दोहराता है, जिसमें नैदानिक रूप से प्रासंगिक और मेटास्टेसिस से जुड़े आनुवंशिक परिवर्तनों की भागीदारी शामिल है; विवो में मेटास्टेसिस का प्राकृतिक और सहज विकास; और मेटास्टेसिस के संरक्षित स्थलों. इसलिए, जेब्राफ़िश मॉडल में विवो में ट्यूमर मेटास्टेसिस की जटिल प्रक्रिया को विच्छेदित करने के लिए अद्वितीय फायदे हैं।

Introduction

ज़ेबराफ़िश का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है और अनुसंधान के कई क्षेत्रों में लागू किया गया है, विशेष रूप से कैंसर में। यह मॉडल कई फायदे प्रदान करता है- जैसे कि इसके मजबूत प्रजनन, लागत प्रभावी रखरखाव, और ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस के बहुमुखी विज़ुअलाइज़ेशन- जिनमें से सभी ज़ेबराफ़िश को एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं जो जेब्राफ़िश को सेलुलर और आणविक आधारों का अध्ययन करने और जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं। बड़े पैमाने पर जीनोम मैपिंग, ट्रांसजेनेसिस, जीन ओवरएक्सप्रेशन या नॉकआउट, सेल प्रत्यारोपण और रासायनिक स्क्रीन के लिए नई तकनीकों ने ज़ेबराफ़िश मॉडल 1 की शक्ति को बेहद बढ़ाया है। पिछले कुछ वर्षों के दौरान, कई ज़ेबराफ़िश लाइनों को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर के मेटास्टेसिस और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जिसमें ल्यूकेमिया, मेलेनोमा, रैबडोमायोसारकोमा और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 2,3,4,5 शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, न्यूरोब्लास्टोमा (एनबी) का पहला ज़ेब्राफ़िश मॉडल डोपामाइन-बीटा-हाइड्रॉक्सिलेस (डीएच) प्रमोटर के नियंत्रण में परिधीय सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (पीएसएनएस) में एमवाईसीएन, एक ऑन्कोजीन को अतिरंजित करके उत्पन्न किया गया था। इस मॉडल के साथ, यह आगे प्रदर्शित किया गया था कि सक्रिय एएलके ट्यूमर की शुरुआत में तेजी लाने और विवो 6 में ट्यूमर पेनिट्रेंस को बढ़ाने के लिए MYCN के साथ तालमेल कर सकता है।

एनबी तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के sympathoadrenal वंश से व्युत्पन्न है, और बच्चों में एक अत्यधिक मेटास्टैटिक कैंसर है7. यह बाल चिकित्सा कैंसर से संबंधित मौतों के 10% के लिए जिम्मेदार है8। निदान पर व्यापक रूप से metastasized, एनबी को नैदानिक रूप से ट्यूमर के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है जो मुख्य रूप से सहानुभूति गैन्ग्लिया की श्रृंखला और PSNS9,10 के अधिवृक्क मज्जा के साथ उत्पन्न होता है। MYCN प्रवर्धन आमतौर पर NB रोगियों 11,12 में खराब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, LMO1 को उच्च जोखिम वाले मामलों में एक महत्वपूर्ण एनबी संवेदनशीलता जीन के रूप में पहचाना गया है13,14। अध्ययनों में पाया गया कि ज़ेब्राफ़िश मॉडल के पीएसएनएस में MYCN और LMO1 का ट्रांसजेनिक coexpression न केवल NB की पहले की शुरुआत को बढ़ावा देता है, बल्कि ऊतकों और अंगों के लिए व्यापक मेटास्टेसिस को भी प्रेरित करता है जो आमतौर पर उच्च जोखिम वाले NB13 वाले रोगियों में देखी जाने वाली साइटों के समान होते हैं। हाल ही में, एनबी के एक और मेटास्टैटिक फेनोटाइप को एनबी के एक नए ज़ेब्राफ़िश मॉडल में भी देखा गया है, जिसमें MYCN और Lin28B दोनों, एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन को एन्कोडिंग करते हैं, को डीएच प्रमोटर 16 के नियंत्रण में अतिरंजित किया जाता है।

ज़ेब्राफ़िश में स्थिर ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण का उपयोग अक्सर यह अध्ययन करने के लिए किया जाता है कि क्या ब्याज के जीन का ओवरएक्सप्रेशन सामान्य विकास और रोग रोगजनन में योगदान कर सकता है14,15। इस तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग कई जीनों और मार्गों के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है, जो एनबी के लिए 6,16,17,18,19,20 है। यह पेपर पेश करेगा कि कैसे ट्रांसजेनिक मछली लाइन जो पीएसएनएस में MYCN और LMO1 दोनों को अतिरंजित करती है, बनाई गई थी और यह कैसे प्रदर्शित किया गया था कि इन दो ऑन्कोजीन के सहयोग से एनबी और मेटास्टेसिस 13 की शुरुआत में तेजी आती है। सबसे पहले, ट्रांसजेनिक लाइन जो EGFP-MYCN को अतिरंजित करती है, जो dπh प्रमोटर (नामित MYCN लाइन) के नियंत्रण में है, को जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) एबी भ्रूण के एक-सेल चरण में dπh-EGFP-MYCN निर्माण को इंजेक्ट करके विकसित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित 6,17 था। एक अलग ट्रांसजेनिक लाइन जो PSNS (नामित LMO1 लाइन) में LMO1 को overexpresses करती है, को दो डीएनए निर्माणों, dπh-LMO1 और dπh-mCherry को एक-सेल चरण 13 पर डब्ल्यूटी भ्रूण में सह-इंजेक्शन द्वारा विकसित किया गया था। यह पहले प्रदर्शित किया गया है कि coinjected डबल डीएनए निर्माणों मछली जीनोम में cointegrated किया जा सकता है; इसलिए, LMO1 और mCherry ट्रांसजेनिक जानवरों के PSNS कोशिकाओं में coexpressed हैं। एक बार इंजेक्ट किए गए एफ 0 भ्रूण यौन परिपक्वता तक पहुंचने के बाद, उन्हें ट्रांसजीन (एस) एकीकरण के साथ सकारात्मक मछली की पहचान के लिए डब्ल्यूटी मछली के साथ आउट-क्रॉस किया गया था। संक्षेप में, F1 संतानों को पहली बार PSNS कोशिकाओं में mCherry अभिव्यक्ति के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जांचा गया था। mCherry-positive fish में LMO1 के germline integration को जीनोमिक PCR और sequencing द्वारा आगे की पुष्टि की गई थी। प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन की सफल पहचान के बाद, विषमयुग्मजी MYCN और LMO1 ट्रांसजेनिक मछली की संतानों को MYCN और LMO1 (नामित MYCN) दोनों को व्यक्त करने वाली एक यौगिक मछली लाइन उत्पन्न करने के लिए इंटरब्रीड किया गया था; एलएमओ 1 लाइन)। ट्यूमर असर MYCN; LMO1 मछली को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्विसाप्ताहिक रूप से प्राथमिक साइट, इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र (IRG, मानव अधिवृक्क ग्रंथि के बराबर ज़ेब्राफ़िश) से दूर के क्षेत्रों में मेटास्टैटिक ट्यूमर के सबूत के लिए निगरानी की गई थी। MYCN में ट्यूमर के मेटास्टेसिस की पुष्टि करने के लिए; LMO1 मछली, हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण लागू किए गए थे।

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Protocol

मेयो क्लिनिक में संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में ज़ेबराफ़िश और पशु देखभाल / रखरखाव का उपयोग करने वाले सभी शोध तरीकों का प्रदर्शन किया गया था।

1. तैयारी और TRANSGENE निर्माणों की microinjection PSNS में overexpression के साथ LMO1 ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन के विकास के लिए बनाता है

  1. LMO1-pDONR221 प्रविष्टि क्लोन विकसित करने के लिए, पीसीआर का उपयोग करके मानव सेल लाइन से प्राप्त cDNA से मानव LMO1 के कोडिंग क्षेत्र को बढ़ाएं।
    1. यहां विस्तृत रूप में एक 25 μL प्रतिक्रिया करें: 10x मानक Taq प्रतिक्रिया बफर के 2.5 μL, Taq DNA पोलीमरेज़ के 0.125 μL, 10 mM dNTPs के 0.5 μL, cDNA टेम्पलेट के 2 μL, 10 μM आगे LMO1 ATTB1 प्राइमर के 0.5 μL, 10 μM रिवर्स LMO1 ATTB2 प्राइमर के 0.5 μL, और 18.875 μL पानी का।
      नोट: आगे LMO1 ATTB1 प्राइमर का उपयोग करें: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGGAAGGGA-3 'और रिवर्स LMO1 ATTB2 प्राइमर: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके बढ़ाना: 94 डिग्री सेल्सियस का 1 चक्र, 2 मिनट; इसके बाद (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 मिनट) और 72 °C, 7 मिनट के 30 चक्र।
  2. क्लोन LMO1 PCR उत्पाद pDONR221 गेटवे दाता वेक्टर में BP recombinase reaction6,13 (PCR टुकड़ा + दाता वेक्टर = प्रविष्टि क्लोन) द्वारा।
    1. एक 10 μL प्रतिक्रिया के लिए, शुद्ध LMO1 PCR उत्पाद (150 ng / μL), 1 μL (150 ng / μL) pDONR221 दाता वेक्टर के 1 μL, और TE बफर (pH 8.0) के 6 μL को बीपी एंजाइम मिश्रण के 2 μL के साथ मिलाएं, 25 °C पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें, और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके TOP10 सक्षम ई कोलाई में परिवर्तित करें।
    2. इसके बाद, एक लूरिया शोरबा (एलबी) अगर प्लेट पर परिवर्तन की शीशी से 50-200 μL फैलता है जिसमें 50 μg / mL kanamycin होता है और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
    3. 50 μg / mL kanamycin के साथ LB के 2-5 mL में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाकर और 37 °C पर रात भर (16-18 h) culturing द्वारा क्लोन का चयन करें।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लास्मिड अलगाव के लिए रातभर बैक्टीरिया संस्कृति के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें। LMO1 प्लास्मिड को सत्यापित करने के लिए, M13-F प्राइमर (5- GTAAAACGACGGCCAG-3') के साथ अनुक्रमण के लिए प्लास्मिड नमूना भेजें।
  3. एक dπh-pDONRP4-P1R प्रविष्टि क्लोन जनरेट करने के लिए, CH211-270H11 BAC क्लोन का उपयोग करके 5.2-kb प्रोमोटर क्षेत्र को प्रवर्धित करके 20 μL प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए एक 20 μL प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए पहले चरण 1.1.1 में वर्णित है। निम्न पीसीआर प्रोग्राम पैरामीटर का उपयोग करें: 94 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट; 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 मिनट के 10 चक्र; 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 मिनट के 30 चक्र; 68 °C, 4 मिनट (आगे प्राइमर के साथ 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' और रिवर्स प्राइमर 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTGTGTTTTTTG
    TCGTCTTTTGA-3')।
    नोट: इस चरण में लंबे डीएनए टेम्पलेट्स के कारण, सटीक पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक उपयुक्त पीसीआर सिस्टम का उपयोग सुनिश्चित करें।
  4. क्लोन dπh पीसीआर उत्पाद pDONRP4-P1R गेटवे दाता वेक्टर में BP recombinase reaction6,13 (PCR टुकड़ा + दाता वेक्टर = प्रविष्टि क्लोन) द्वारा।
    1. शुद्ध dπh PCR उत्पाद (172 ng /uL), pDONRP4-P1R दाता वेक्टर के 1 μL (150 ng/μL) और TE बफर (pH 8.0) के 6 μL को बीपी एंजाइम मिश्रण के 2 μL के साथ कुल 10 μL प्रतिक्रिया में 2 μL मिश्रण के साथ मिलाएं, 25 °C पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार TOP10 सक्षम ई कोलाई में बदलें। चरण 1.2.2-1.2.4 में वर्णित के रूप में प्लास्मिड को अलग करें और M13-F (5'-GTAAAACACGACGGCCAG-3') और M13-R (5'-CAGGAAACCTATGAC-3') प्राइमरों के साथ अनुक्रमण द्वारा प्लास्मिड को सत्यापित करें।
  5. dπh: LMO1 अभिव्यक्ति निर्माण जनरेट करें।
    1. प्रत्येक प्रविष्टि क्लोन के 1 μL (dπh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 और p3E-polyA11) (20 fmole प्रत्येक), I-SceI मान्यता साइटों के साथ संशोधित गंतव्य वेक्टर के 1 μL (60 ng/ इस मिश्रण को 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते समय, बैक्टीरिया को रासायनिक रूप से सक्षम TOP10 ई कोलाई में बदल दें। 1.2.2-1.2.4 चरणों में वर्णित प्लास्मिड को अलग करें और डीबीएच फॉरवर्ड (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') और LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') प्राइमरों के साथ अनुक्रमण द्वारा प्लास्मिड को सत्यापित करें।
  6. एक 5.2-kb dπh प्रमोटर, pME-mCherry, और p3E-polyA के प्रवेश क्लोन को संशोधित गंतव्य वेक्टर में I-SceI मान्यता साइटों के संयोजन से एक गेटवे सिस्टम के साथ dπh:mCherry डीएनए निर्माण उत्पन्न करें जैसा कि पहले चरण 1.5.16 में उल्लेख किया गया है। चरण 1.2.2-1.2.4 में वर्णित के रूप में प्लास्मिड को अलग करें और डीबीएच फॉरवर्ड प्राइमर (5'-GAAGCTGTCACGGGGTTG-3') के साथ अनुक्रमण द्वारा प्लास्मिड को सत्यापित करें।
  7. Linearize dπh: LMO1 डीएनए निर्माण और dπh: mCherry डीएनए निर्माण (क्रमशः 3: 1 अनुपात पर) I-SceI एंजाइम (5 U / μL) के 1 μL और बफर (10x) के 0.75 μL के साथ 15 μL प्रतिक्रिया मात्रा के कुल में, और कमरे के तापमान पर कम से कम 4 घंटे या रात भर के लिए इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि डीएनए एकाग्रता प्रतिक्रिया में 750 एनजी से अधिक नहीं है।
  8. अगले दिन और निर्माणों के रैखिकीकरण के बाद, ताजा I-SceI एंजाइम (5 U / μL) के 0.5 μL और 0.5% फिनोल लाल के 0.5 μL को 1.7 के पिछले चरण से कुल डीएनए मिश्रण के 5 μL में जोड़ें। कुल समाधान (रैखिक डीएनए के 50-80 पीजी का) को एक-सेल-चरण जंगली-प्रकार एबी भ्रूण (और 500 भ्रूण के रूप में कई) में 1.0 मिमी व्यास ग्लास माइक्रोपिपेट सुई का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्ट करें जैसा कि पहले वर्णित 17 था। शेष डीएनए मिश्रण को भविष्य के इंजेक्शन के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. स्क्रीन और सत्यापित LMO1 और mCherry के जर्मलाइन संचरण के लिए LMO1 ट्रांसजेनिक मछली लाइन

  1. 3-4 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) पर, 0.02% ट्राइकेन के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण को एनेस्थेटिकाइज़ करें और फ्लोरोसेंट एमचेरी अभिव्यक्ति के लिए उन्हें स्क्रीन करें, जो मोज़ेक ट्रांसजेनेसिस के कारण मछली के शरीर में कहीं भी प्रस्तुत करता है। ताजे अंडे के पानी के साथ एक पेट्री डिश में एमचेरी-पॉजिटिव भ्रूण को स्थानांतरित करें और ज़ेबराफ़िश बुक 21 के अनुसार यौन परिपक्वता के लिए भ्रूण को उठाएं।
    नोट: सकारात्मक मछली के अनुपात की उम्मीद करने के लिए विशेषज्ञता और अनुसंधान कर्मियों के अनुभव के आधार पर अलग-अलग है। उदाहरण के लिए, शुरुआती एमेच्योर में 10% की कम एकीकरण दर हो सकती है, ≥50% के विशेषज्ञ की तुलना में।
  2. Dπh: LMO1 और dπh: mCherry transgenes रोगाणु कोशिकाओं में एकीकृत के साथ संस्थापक मछली का निर्धारण करने के लिए, WT AB मछली के साथ पिछले चरण (2.1) से इंजेक्ट किए गए mCherry-positive F0 यौन परिपक्व मछली के एकल जोड़े को आउटक्रॉस करें। 3-4 dpf पर mCherry-सकारात्मक भ्रूण के लिए F1 पीढ़ी स्क्रीन.
  3. यह पुष्टि करने के लिए कि mCherry-positive मछली LMO1 ट्रांसजीन ले जाती है, gDNA निष्कर्षण बफर का उपयोग करके F1 mCherry-positive single embryo से gDNA को अलग करें, जिसमें शामिल हैं: 4x lysis बफर का 12.5 μL (8.4 के pH के साथ 1 M Tris का 500 μL, 1 M पोटेशियम क्लोराइड का 2.5 mL, और शुद्ध पानी का 47 mL), शुद्ध पानी का 35 μL, 35 μL, और 10 मिलीग्राम / एमएल पर प्रोटीनेज के 2.5 μL। नमूने को 55 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, इसके बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
  4. प्राइमरों के साथ जीनोटाइपिंग पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में निकाले गए gDNA (2 μL) का उपयोग करें: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' और LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', और निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम: 94 डिग्री सेल्सियस का 1 चक्र, 10 मिनट; के 35 चक्र (30 s के लिए 94 °C, 30 s के लिए 60 °C; 68 °C, 30 s); और 7 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस। अनुक्रमण द्वारा प्रवर्धित 182 बीपी टुकड़े की पुष्टि करें।
  5. जीनोटाइप की पुष्टि के बाद, शेष mCherry-positive F1 भ्रूण को जेब्राफ़िश बुक 21 के मानक दिशानिर्देशों के अनुसार परिपक्वता तक बढ़ाएं। फिन क्लिप और जीनोटाइप उन्हें 2-3 महीने की उम्र में ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल से चरणों 2.3-2.4 का उपयोग करके मछली में LMO1 ट्रांसजीन के एकीकरण की पुष्टि करने के लिए।
    नोट: LMO1-सकारात्मक F1 मछली स्थिर ट्रांसजेनिक मछली [Tg (dπh:LMO1), Tg (dπh:mCherry)] ( LMO1 लाइन के रूप में नामित) होगी।
  6. नस्ल F1 LMO1 डब्ल्यूटी मछली के साथ स्थिर ट्रांसजेनिक मछली और इस लाइन का प्रचार करने के लिए आवश्यक के रूप में दोहराने के लिए।

3. मेटास्टैटिक मॉडल बनाने के लिए LMO1 और MYCN ट्रांसजेनिक लाइनों के Outcross

  1. एक बार जब LMO1 ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन उत्पन्न हो जाती है, तो MYCN line6,17 के साथ interbreed विषमयुग्मजी ट्रांसजेनिक मछली लाइन विकसित करने के लिए MYCN और LMO1 दोनों को अतिरंजित करता है।
  2. 1 डीपीएफ पर, स्टीरियोस्कोपिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ ईजीएफपी अभिव्यक्ति के लिए आउटक्रॉस की संतानों को सॉर्ट करें, जो हिंडब्रेन क्षेत्र में ईजीएफपी-सकारात्मक बिंदुओं के रूप में प्रस्तुत करता है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि सभी भ्रूण ों को 1 डीपीएफ पर MYCN के लिए क्रमबद्ध नहीं किया जाता है, तो भ्रूण को वयस्कता और जीनोटाइप के लिए फिन क्लिपिंग द्वारा बढ़ाएं और जीडीएनए अलगाव और पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए चरण 2.3-2.4 से पूर्व में बताए गए दिशानिर्देशों का उपयोग करके, प्राइमरों के साथ: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CTC CAC GTA-3', और मानक Taq पोलीमरेज़ के साथ निम्नलिखित कार्यक्रम: 3 मिनट के लिए 94 °C का 1 चक्र, 35 चक्र (30 s के लिए 94 °C, 30 s के लिए 60 °C, और 3 मिनट के लिए 68 °C), और 145 bp के अपेक्षित amplicon आकार के साथ 7 मिनट के लिए 68 °C।
  3. 1 डीपीएफ पर ईजीएफपी के लिए छंटाई करने के बाद, अलग-अलग पेट्री व्यंजनों और लेबल व्यंजनों में स्क्रीन किए गए भ्रूण को अलग-अलग करें: MYCN + (EGFP-positive) या MYCN- (EGFP-negative)।
  4. 3-4 dpf पर, एक स्टीरियोस्कोपिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ LMO1 अभिव्यक्ति के लिए दोनों समूहों (चरण 3.3) के भ्रूण की कल्पना और सॉर्ट करें। सिर क्षेत्र में बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंग्लियन और गैर-पीएसएनएस डोपामिनर्जिक न्यूरोनल कोशिकाओं दोनों में धब्बे के रूप में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की तलाश करें, विशेष रूप से हिंदब्रेन 6,13 के आयताकार मज्जा में।
    नोट: भ्रूण 5 डीपीएफ तक पहुंचने से पहले mCherry / LMO1 के लिए स्क्रीन, क्योंकि हवा से भरे तैरने वाले मूत्राशय तब तक पूरी तरह से विकसित होते हैं और भ्रूण को तैरने का कारण बनते हैं, जिसके परिणामस्वरूप छँटाई प्रक्रिया के दौरान पीएसएनएस कोशिकाओं का कठिन माइक्रोस्कोपिक फोकसिंग होता है।
  5. एक बार छँटाई पूरी हो जाने के बाद, सॉर्ट की गई मछली को अलग-अलग जीनोटाइप के चार समूहों में अलग करें और नीचे के रूप में लेबल करें। Zebrafish book21 से मानक प्रोटोकॉल के अनुसार समान परिस्थितियों में क्रमबद्ध मछली को उठाएं।
    1. MYCN-केवल (EGFP-सकारात्मक),
    2. LMO1-केवल (mCherry-positive),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP और mCherry डबल सकारात्मक),
    4. डब्ल्यूटी (ईजीएफपी और एमचेरी डबल नकारात्मक)।

4. ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों में ट्यूमर बोझ visualizing

  1. 4 सप्ताह-पोस्ट-निषेचन (डब्ल्यूपीएफ) में, एक पेट्री डिश में 0.02% ट्राइकेन के साथ चरण 3.5 से एनेस्थेटिक सॉर्ट की गई मछली को एनेस्थेटिक करें।
  2. ट्यूमर को देखने के लिए दोनों पार्श्व पक्षों पर एक धातु स्पैटुला के साथ मछली को धीरे से फ़्लिप करके एक स्टीरियोस्कोपिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ ट्यूमर की कल्पना करें। ट्यूमर को एकल ईजीएफपी-, एकल एमचेरी-, या डबल ईजीएफपी-और-एमचेरी-पॉजिटिव द्रव्यमान के रूप में प्रस्तुत करने की उम्मीद है जो इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र (सिर और गुर्दे के पास) से उत्पन्न होते हैं।
    नोट: यह संभव है कि प्रारंभिक ट्यूमर की शुरुआत आमतौर पर इंटररेनल ग्रंथि के एक तरफ एक उज्ज्वल और बड़े प्रतिदीप्ति सकारात्मक द्रव्यमान के साथ प्रस्तुत की जाती है, यही कारण है कि शुरुआती ट्यूमर की शुरुआत से बचने के लिए मछली के दोनों किनारों की कल्पना करना महत्वपूर्ण है।
  3. संभावित ट्यूमर-असर वाली मछली की पहचान के बाद, मछली को उचित लेबल के साथ एक अलग टैंक में अलग करें, जिसमें जन्म तिथि, ट्यूमर की जांच होने की तारीख और जीनोटाइप शामिल हैं।
  4. 6 wpf पर, पिछले चरणों को दोहराएं 4.1-4.3 ट्यूमर-असर मछली और गैर-ट्यूमर असर मछली को फिर से स्क्रीन करने के लिए पहले से जांच की गई ट्यूमर-असर मछली के लिए ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए या क्रमशः नए संभावित ट्यूमर-असर वाली मछली की पहचान करने के लिए। पुष्टि की गई ट्यूमर-असर मछली में प्रतिदीप्ति-सकारात्मक द्रव्यमान के निरंतर या बढ़े हुए आकार की तलाश करें।
  5. ट्यूमर-असर मछली की पहचान करने के बाद, ट्यूमर सेल माइग्रेशन के सबूत के लिए उन्हें द्विसाप्ताहिक रूप से मॉनिटर करें, जो छोटे ईजीएफपी- और / या एमचेरी-पॉजिटिव ट्यूमर द्रव्यमान के रूप में प्रस्तुत करता है जो ट्यूमरजेनेसिस (इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र) की प्राथमिक साइट से दूर है। आवश्यकतानुसार इन मछलियों को अलग-अलग टैंकों में अलग करें और संभावित मेटास्टेसिस को इंगित करने के लिए उचित रूप से लेबल करें।
  6. मेटास्टेसिस की पुष्टि करने के लिए, इन मछलियों को नियमित रूप से (हर दो सप्ताह) ट्रैक करना जारी रखें जब तक कि दूर के प्रतिदीप्ति-सकारात्मक ट्यूमर द्रव्यमान स्पष्ट रूप से बढ़े हुए आकार को नहीं दिखाते हैं, जो मेटास्टैटिक साइटों में ट्यूमर के विकास का संकेत देते हैं।

5. ऊतक प्रसंस्करण और ट्यूमर असर मछली के पैराफिन सेक्शनिंग

नोट: MYCN और MYCN में अनायास विकसित प्राथमिक और / या मेटास्टैटिक ट्यूमर को चिह्नित करने के लिए इस चरण को निष्पादित करें ; LMO1 ट्रांसजेनिक मछली.

  1. ट्यूमर-असर मछली की पहचान और सत्यापन के बाद, एक पेट्री डिश में चरण 4.6 से मछली की बलि 0.02% ट्राइकेन में मछली को डुबोकर पहले एनेस्थेटिक करने के लिए और फिर ट्राइकेन खुराक में वृद्धि जब तक कि मछली अब श्वसन नहीं कर रही है। मछली को दो टुकड़ों में काट लें- एक टुकड़े के साथ जिसमें सिर और शरीर के मध्य खंड (ट्यूमर सहित) का एक हिस्सा होता है, और मछली के मध्य खंड और पूंछ के बाकी हिस्सों के साथ एक और टुकड़ा होता है।
  2. एक रॉकर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1x PBS में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ दोनों मछली वर्गों को ठीक करें। निर्धारण दक्षता बढ़ाने के लिए, आंतरिक अंगों को प्रभावी ढंग से और जल्दी से पेनेट्रेंस बढ़ाने के लिए ताजा 4% पीएफए के साथ बफर को बदलें। रात भर या 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर ताजा फिक्सिंग बफर के साथ मछली छोड़ दें।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है। चूंकि एहतियाती प्रक्रियाएं और अभिकर्मक का उचित निपटान आपकी संस्था के नियमों पर निर्भर करता है, इसलिए अभिकर्मक का उपयोग करने और निपटान से पहले उचित दिशानिर्देशों की तलाश करें।
  3. प्रसंस्करण से पहले, कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए 100% रैपिड डिकैल्सिफायर समाधान में नमूना (ओं) को रखें। एक nonmetal कंटेनर का उपयोग करने के लिए और इनक्यूबेशन पर decalcification को रोकने के लिए नमूना (ओं) की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें। यदि नमूना ऊतक भारी रूप से अवक्रमित दिखता है, तो डीकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया को धीमा करने के लिए पानी में या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें।
  4. एक बार तय और decalcified, 1 ज के लिए चल नल के पानी के साथ मछली के नमूने (ओं) धोलें और यह प्रोसेसर कैसेट (ओं) में जगह है। यदि एक से अधिक नमूने हैं, तो प्रत्येक को अपने स्वयं के कैसेट में अलग करें।
  5. डिहाइड्रेट करें और ऊतक प्रोसेसर में मछली के साथ कैसेट (ओं) को रखकर पैराफिन एम्बेडिंग के लिए ऊतक तैयार करें, जहां नमूना (ओं) को विभिन्न समाधानों में डुबोया जाता है, क्रमशः, निम्नानुसार: 70% इथेनॉल (60 मिनट, 40 डिग्री सेल्सियस), 85% इथेनॉल (50 मिनट, 40 डिग्री सेल्सियस), 95% इथेनॉल (40 मिनट, 40 डिग्री सेल्सियस) दो बार, 100% इथेनॉल (30 मिनट, 40 डिग्री सेल्सियस), 100% इथेनॉल (30 मिनट, 40 डिग्री सेल्सियस) का एक और ताजा समाधान 40 °C) दो बार, xylene (30 मिनट, 40 °C), जाइलीन का एक और ताजा समाधान (50 मिनट, 40 °C), एक और ताजा जाइलीन (50 मिनट, 45 °C), पैराफिन (30 मिनट, 45 °C), पैराफिन (20 मिनट, 58 °C) तीन बार।
  6. ऊतक संसाधित होने के बाद, प्रत्येक कैसेट के संगठन को बनाए रखते हुए प्रोसेसर मशीन से कैसेट (ओं) को अनलोड करें और मछली के नमूनों को मिश्रण करने से रोकने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. मछली के आकार के आधार पर उपयुक्त आकार का मोल्ड चुनें, यह सुनिश्चित करें कि मोल्ड मछली के नमूने के साथ पूरे कैसेट को फिट करेगा। 60 डिग्री सेल्सियस पर तरल पैराफिन के साथ मोल्ड के नीचे कवर करें।
  8. तुरंत मोल्ड के शीर्ष पर मछली के साथ कैसेट रखें (यह सुनिश्चित करें कि मछली को सैगिटल वर्गों के लिए अपने फ्लैट पार्श्व पक्ष पर रखा गया है) तरल पैराफिन के साथ, और मछली को पूरी तरह से एम्बेड करने के लिए मोल्ड के शीर्ष पर पैराफिन के साथ भरना समाप्त करें।
  9. अनुभागिंग माइक्रोटोम की ठंडी प्लेट पर पूरा मोल्ड रखें जब तक कि पैराफिन कठोर न हो जाए।
  10. एक बार पैराफिन ब्लॉक कठिन हो जाता है, जिसे नेत्रहीन रूप से उच्च अस्पष्टता और ब्लॉक के लिए एक फर्म स्पर्श को देखकर आंका जा सकता है, धीरे से मोल्ड से ब्लॉक को हटा दें। कैसेट के किनारों से किसी भी अतिरिक्त पैराफिन को सावधानीपूर्वक स्क्रैप करें।
  11. पैराफिन-एम्बेडेड मछली ब्लॉक को माइक्रोटोम पर 4 माइक्रोन पर विभाजित करें और आसुत पानी वाले 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के स्नान पर वर्गों को फ्लोट करें।
  12. सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड्स पर अनुभागों को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और चरण 6, 7, या 8 पर आगे बढ़ने से पहले धुंधला होने से पहले 30 मिनट के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

6. हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) पैथोलॉजी समीक्षा के लिए पैराफिन वर्गों के धुंधला

  1. चरण 5.12 से पैराफिन अनुभागों वाली स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें. एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर, जाइलीन के साथ 3 बार deparaffinize, प्रत्येक 5 मिनट. प्रत्येक उपयोग के बाद समाधान छोड़ें.
  2. 3 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें, और ताजा 100% इथेनॉल के साथ दो बार दोहराएं। 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल के साथ 100% इथेनॉल को बदलें और फिर, 3 मिनट के लिए 80% इथेनॉल।
  3. 5 मिनट के लिए आसुत पानी के साथ वर्गों कुल्ला। जबकि अनुभाग पानी में धो रहे हैं, हेमेटोक्सिलिन से ऑक्सीकृत कणों को हटाने के लिए सुनिश्चित करें या तो एक लिंट-मुक्त पोंछे के साथ हेमेटोक्सिलिन की सतह को फ़िल्टर या स्किमिंग करके।
  4. लिंट-मुक्त पेशेवर ग्रेड पोंछे के साथ स्लाइड धारक से अतिरिक्त पानी को धब्बा, और वांछित धुंधला वरीयता और अभिकर्मक गिरावट के आधार पर 2-5 मिनट के लिए 50% हेमेटोक्सिलिन (आसुत पानी के साथ 1: 1 कमजोर पड़ने) में स्लाइड दाग। हेमेटोक्सिलिन को छोड़ दें जब समाधान का रंग बेर से नीले / भूरे रंग में बदल जाता है या जब धुंधला समय अत्यधिक हो जाता है। 20 मिनट के लिए बहते नल के पानी के साथ स्लाइड कुल्ला।
  5. स्लाइड को कई बार जल्दी से डुबोकर 1% एसिड इथेनॉल (70% इथेनॉल के 50 मिलीलीटर के साथ हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 3.3 मिलीलीटर) में वर्गों को डीकॉलाइज़ करें। स्लाइड को 3 सेकंड तक डुबोया जा सकता है, लेकिन जितनी देर तक स्लाइड्स डूबी होती हैं, अनुभाग उतने ही हल्के हो जाते हैं।
  6. नल के पानी में स्लाइड को दो बार 1 मिनट के लिए कुल्ला करें, और एक बार विआयनीकृत पानी के साथ। एक विकल्प के रूप में, स्लाइड को इस चरण में रात भर छोड़ दिया जा सकता है, पानी में भिगोया जा सकता है।
  7. 1.36% लिथियम कार्बोनेट समाधान (47 ग्राम लिथियम कार्बोनेट, 3500 एमएल पानी) में वर्गों को 3 एस के लिए विसर्जित करें। सुनिश्चित करें कि लिथियम कार्बोनेट समाधान में लंबे समय तक वर्गों को इनक्यूबेट न करें, ऊतक तैरने की अधिक संभावना है।
  8. 5 मिनट के लिए नल के पानी में वर्गों कुल्ला, और लिंट मुक्त पेशेवर ग्रेड पोंछे के साथ स्लाइड धारक से अतिरिक्त पानी धब्बा।
  9. 15-30 सेकंड के लिए 100% रेडी-टू-यूज ईोसिन में स्लाइड्स को काउंटरस्टेन करें, और तुरंत 5 मिनट के लिए दो बार 95% इथेनॉल के साथ निर्जलित करें। प्रत्येक उपयोग के बाद समाधानों को त्यागते हुए, प्रत्येक उपयोग के बाद समाधानों को छोड़कर, प्रत्येक मिनट के लिए दो बार 100% इथेनॉल के साथ बदलें।
  10. 15 मिनट के लिए xylene में वर्गों को साफ़ करें और कुल मिलाकर 3 बार के लिए दो बार दोहराएं। वैकल्पिक रूप से, स्लाइड को अतिरिक्त पानी को बेहतर ढंग से साफ करने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर जाइलीन में छोड़ा जा सकता है।
  11. स्लाइड्स को रासायनिक धुएं हुड में सूखने की अनुमति दें और फिर ऊतक के नमूने को सील करने के लिए बढ़ते माध्यम का उपयोग करके एक कवर स्लिप माउंट करें।
  12. कल्पना और माइक्रोस्कोपी के तहत दाग ऊतक वर्गों छवि. प्राथमिक साइट पर ट्यूमर (सिर गुर्दे में इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र) और मछली के अन्य ऊतकों और अंगों में दूर के छिटपुट मेटास्टेसिस की सावधानीपूर्वक जांच करें। रोगविज्ञानियों द्वारा समीक्षा किए जाने वाले ऊतक वर्गों के लिए दाग वाली स्लाइड्स भेजें। मानव न्यूरोब्लास्टोमा के लिए मछली मॉडल की समान रोग संबंधी विशेषताओं के आधार पर, एमवाईसीएन-केवल या एमवाईसीएन में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर की उम्मीद करें ; LMO1 मछली को पहले रोगविज्ञानियों द्वारा न्यूरोब्लास्टोमा के रूप में निदान किया जाना है।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल एनालिसिस (आईएचसी) एनबी मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ और ट्यूमर के प्रसार और उनके sympathoadrenal वंश संपत्ति की पुष्टि करने के लिए overexpressed transgenes

  1. पूरी तरह से स्वचालित धुंधला प्रणाली के साथ धुंधला
    1. एच एंड ई स्टेनिंग के साथ आईएचसी परिणाम की बेहतर तुलना करने के लिए, आईएचसी स्टेनिंग के लिए चरण 5.12 से आसन्न स्लाइड का चयन करें।
      नोट: हालांकि एक स्वचालित धुंधला प्रणाली तेजी से और कम श्रमसाध्य परिणामों के लिए अनुमति देता है, आईएचसी धुंधला करने के लिए एक मैनुअल प्रोटोकॉल का उपयोग उपधारा 7.2 के चरणों का उल्लेख करके इस तरह की अनुपस्थिति में किया जा सकता है।
    2. टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (टीएच) (1: 500) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें, एक न्यूरोब्लास्टोमा मार्कर, वांछित एकाग्रता और स्वचालित प्रणाली के संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी डिलुएंट के साथ आवश्यक कुल राशि के आधार पर।
      नोट: इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता एंटीबॉडी और ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकती है।
    3. चूंकि स्वचालित प्रणाली 20 मिनट के लिए एपिटोप पुनर्प्राप्ति समाधान और सिस्टम के संबंधित डिटेक्शन अभिकर्मक के साथ ऑनबोर्ड हीट-प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति का उपयोग करती है, इसलिए सुनिश्चित करें कि मशीन के लिए पैरामीटर सेट किए गए हैं: पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग, 5 मिनट; वांछित एकाग्रता के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी, 15 मिनट; biotinylated विरोधी खरगोश IgG माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500), 8 मिनट; स्ट्रेप्टाविडिन एचआरपी, 8 मिनट; मिश्रित डीएबी तीव्र सब्सट्रेट, 5 मिनट; और Hematoxylin, 5 मिनट.
    4. एक बार सेटिंग्स सेट होने के बाद, एंटीबॉडी ट्रे को मशीन में रखें। एक नया केस बनाकर स्लाइड्स सेट अप करें, जो स्लाइड्स को लेबल करेगा. मशीन अब भरी हुई है और चलाने के लिए तैयार है (डीवैक्सिंग, धुंधला, और काउंटरस्टेनिंग)।
    5. एक बार स्लाइड को स्वचालित मशीन का उपयोग करके डीवैक्स, दाग और काउंटरडेंटेड किया जाता है, तो स्लाइड को 70%, 95%, और 100% के इथेनॉल ग्रेडिएंट में 5 मिनट के लिए निर्जलित करें। 5 मिनट के लिए फिर से 100% ताजा इथेनॉल में वर्गों की स्लाइड को डुबोएं।
    6. 5 मिनट के लिए जाइलीन में वर्गों को साफ करें, दो बार, या अतिरिक्त पानी को बेहतर ढंग से साफ करने के लिए रात भर जाइलीन में स्लाइड छोड़ दें।
    7. स्लाइड्स को रासायनिक धुएं के हुड में सूखने की अनुमति दें और फिर एक बढ़ते माध्यम का उपयोग करके एक कवर स्लिप माउंट करें। कल्पना और माइक्रोस्कोपी के साथ दाग ऊतक वर्गों छवि.
    8. मछली मॉडल में मेटास्टेसिस की दृढ़ता से पुष्टि करने के लिए, चरण 7 से न्यूरोब्लास्टोमा मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दागे गए स्लाइड्स की तुलना चरण 6 से एच एंड ई द्वारा दागे गए लोगों से करें।
      नोट: एच एंड ई स्टेनिंग द्वारा पहचाने गए सभी ट्यूमर कोशिकाओं में न्यूरोब्लास्टोमा मार्कर, टीएच के लिए सकारात्मक धुंधला देखने की उम्मीद करें। इसके अलावा आसन्न ऊतकों में टीएच के लिए कोई सकारात्मक धुंधला होने की उम्मीद नहीं है जहां मेटास्टैटिक ट्यूमर की पहचान एलएमओ 1 में की गई थी ; MYCN मछली. नियंत्रण डब्ल्यूटी और MYCN-केवल मछली का चयन करना सुनिश्चित करें जो MYCN के समान उम्र के हैं ; इस विश्लेषण के लिए एलएमओ 1 मछली इस संभावना को खारिज करने के लिए कि मेटास्टैटिक ट्यूमर मल्टीफोकल प्राथमिक ट्यूमर हैं।
  2. स्वचालित आईएचसी धुंधला प्रणाली के बिना मैन्युअल रूप से धुंधला
    1. स्लाइड बेक किए जाने के बाद, चरण 5.12 से आसन्न स्लाइड का चयन करें ताकि एच एंड ई और आईएचसी के बीच बेहतर तुलना की जा सके। एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर, डीवैक्स और पिछले चरणों 6.1 और 6.2., क्रमशः का उपयोग कर xylene के साथ स्लाइड rehydrate.
    2. deparaffinization और rehydration के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अंतर्जात पेरोक्साइड ब्लॉकिंग समाधान (0.1% सोडियम azide और 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त 1x PBS) में स्लाइड को भिगोएं। 3 मिनट के लिए ताजा 1x PBS में स्लाइड धोएं और कुल 3 बार के लिए दो बार दोहराएं।
      सावधानी: सोडियम एजाइड तीव्र रूप से विषाक्त है। अपने संस्थान के नियमों के आधार पर एहतियाती प्रक्रियाओं और अभिकर्मक के उचित निपटान का अभ्यास करना सुनिश्चित करें।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए proteinase K (1x PBS में 1:500) के साथ समाधान में स्लाइड incubating द्वारा एंटीजन पुनः प्राप्त करें। प्रत्येक 3 मिनट के लिए 1x PBS के साथ स्लाइड 3 बार धोएं।
    4. रॉकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1x PBS में 5% बकरी सीरम के साथ incubating द्वारा ब्लॉक स्लाइड। ताजा 1x PBS के साथ स्लाइड को दो बार 3 मिनट प्रत्येक के लिए धोएं।
    5. Avidin ब्लॉकिंग समाधान की 4 बूँदें सीधे स्लाइड पर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक 3 मिनट के लिए दो बार ताजा 1x पीबीएस के साथ स्लाइड धोने के बाद, बायोटिन ब्लॉकिंग समाधान की 4 बूँदें जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    6. स्लाइड को अवरुद्ध करने के बाद, कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (टीएच) (1: 500) के प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्राथमिक ट्यूमर और अन्य मेटास्टैटिक साइटों के शरीर विज्ञान और गतिविधि को संबोधित करने के लिए ट्रांसजीन और अन्य प्रासंगिक मार्करों के खिलाफ अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ दाग। इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता एंटीबॉडी और ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकती है।
    7. 3 मिनट के लिए ताजा 1x PBS के साथ स्लाइड धोएं, कुल 3 बार के साथ दो बार दोहराएं।
    8. बायोटिनिलेटेड एंटी-खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) के माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला किया जाता है। पिछले धोने के चरण 7.2.7 को दोहराएँ।
    9. HRP संयुग्मित Avidin जोड़ें (1x PBS में 1:300), और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक 5 मिनट के लिए ताजा 1x PBS के साथ स्लाइड 3 बार धोएं।
    10. 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) समाधान (2.5 mL आसुत पानी, किट बफर की 1 बूंद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की 1 बूंद, और किट से DAB की 2 बूँदें) तैयार करें, और एक माइक्रोस्कोप के पास स्लाइड पर सीधे डीएबी की बूंदें रखें। डीएबी जोड़ने के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड पर रंग परिवर्तन प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें। एक बार वांछित धुंधला तीव्रता तक पहुंच जाने के बाद, ठंडे आसुत पानी में स्लाइड वर्गों को रखकर प्रतिक्रिया रोकें।
    11. कुछ ही सेकंड के लिए नमूनों को डुबोकर या डुबोकर और आसुत पानी में वापस रखकर ताजा 50% हेमेटोक्सिलिन के साथ स्लाइड्स को काउंटरस्टेन करें। वांछित के रूप में दोहराएं, लेकिन आम तौर पर, एक बार पर्याप्त होना चाहिए क्योंकि ऊतक अनुभाग पतले होते हैं।
    12. अल्कोहल ग्रेडिएंट में स्लाइड पर डिहाइड्रेट ऊतक के नमूने जैसा कि पहले चरण 7.1.5 में वर्णित है और आईएचसी विश्लेषण को समाप्त करने के लिए शेष चरणों (7.1.8 के रूप में अंतिम चरण के साथ) के माध्यम से जारी रखें।

8. तंत्र अध्ययन के रूप में ट्यूमर में कोलेजन संचय के लिए पैराफिन स्लाइड के Picrosirius लाल धुंधला

  1. स्लाइड्स पर पैराफिन अनुभागों को डीवैक्स, हाइड्रेट और धोने के लिए चरण 6.1-6.3 को दोहराएँ.
  2. पेशेवर ग्रेड लिंट-मुक्त पोंछे के साथ स्लाइड धारक से अतिरिक्त पानी को ब्लोटिंग करने के बाद, 10 मिनट के लिए 50% हेमेटोक्सिलिन में दाग। 10 मिनट के लिए बहते नल के पानी के साथ स्लाइड कुल्ला।
  3. Picrosirius लाल में स्लाइड स्थानांतरण और 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन.
  4. अम्लीकृत पानी में स्लाइड को धोएं (1 लीटर नल या आसुत पानी में 5 मिलीलीटर ग्लेशियल एसिटिक एसिड) दो बार, शेकर पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. स्लाइड से अधिकांश पानी को पहले शारीरिक रूप से हिलाने और स्लाइड पर ब्लोटिंग वर्गों से पहले डिकेंट करें ताकि जितना संभव हो उतना पानी निकाल सकें।
  6. पैराफिन वर्गों को निर्जलित करने के लिए 100% इथेनॉल के तीन परिवर्तनों में स्लाइड को जल्दी से रखें।
  7. ज़ायलीन और माउंट नमूना में स्लाइड साफ़ करने के लिए चरण 6.10 और 6.11 दोहराएँ। अगला, यौगिक माइक्रोस्कोप के साथ छवि जो कैमरे से सुसज्जित है।
  8. इमेजजे का उपयोग करके, प्रत्येक अनुभाग के लिए कम से कम तीन यादृच्छिक क्षेत्रों में पिकरोसिरियस लाल-सकारात्मक कोलेजन फाइबर की गणना करें। MYCN और MYCN की स्लाइड्स के बीच तुलना करें; LMO1 मछली वर्गों.

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Representative Results

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या LMO1 एनबी रोगजनन को प्रभावित करने के लिए MYCN के साथ synergizes, ट्रांसजेनिक निर्माण जो या तो LMO1 (dπh: LMO1 और dπh: mCherry) या MYCN (dπh: EGFP-MYCN) की अभिव्यक्ति को ड्राइव करते हैं, उन्हें PSNS कोशिकाओं में dπh प्रमोटर के नियंत्रण में zebrafish भ्रूण 13 में इंजेक्ट किया गया था। जैसा कि चित्रा 1 ए में सचित्र है, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों के विकास और उनके जीनोटाइप के सत्यापन के बाद, विषमयुग्मजी MYCN और LMO1 मछली को इंटरब्रीड किया गया था। उनकी संतानों को MYCN (EGFP+) या LMO1 (mCherry +) अभिव्यक्ति के लिए क्रमशः 1 dpf या 3-4 dpf पर क्रमबद्ध किया गया था। MYCN overexpression PSNS development6 को दबाने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, EGFP-MYCN अभिव्यक्ति 1 dpf6 पर गैर-PSNS डोपामिनर्जिक न्यूरोनल कोशिकाओं में अधिक प्रमुख है, जैसे कि कपाल गैन्ग्लिया (सीए), आर्क-संबद्ध कैटेकोलामिनर्जिक न्यूरॉन्स (एएसी), और मेडुला ओब्लोंगाटा (एमओ)। EGFP-MYCN प्रोटीन की अस्थिरता के कारण, EGFP सिग्नल 2 दिनों के बाद डिमर हो जाता है। इसके विपरीत, mCherry अभिव्यक्ति दोनों PSNS कोशिकाओं में प्रमुख है, जैसे कि बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंग्लियन और गैर-PSNS डोपामिनर्जिक न्यूरोनल कोशिकाएं, जिसमें CA, AAC और MO शामिल हैं, 3 dpf और उसके बाद से 6। इसलिए, MYCN और LMO1 संभोग की संतानों को MYCN (EGFP+) के लिए 1 dpf और LMO1 (mCherry +) के लिए 3 dpf पर क्रमबद्ध किया जाता है। सॉर्ट की गई मछलियों को विभिन्न जीनोटाइपिक समूहों में विभाजित किया गया था, निम्नानुसार: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1, और iv) WT, और समान परिस्थितियों में उठाया। 4 wpf पर शुरू, संतानों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्यूमर के सबूत के लिए द्विसाप्ताहिक रूप से जांच की गई थी। फ्लोरोसेंट सकारात्मक ट्यूमर द्रव्यमान दोनों MYCN और LMO1 के overexpression के साथ यौगिक ट्रांसजेनिक मछली में प्राथमिक ट्यूमर साइट से दूर ऊतकों और अंगों में पाया गया था, लेकिन अकेले MYCN की अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक मछली में नहीं (चित्रा 1B)।

इन ट्रांसजेनिक जानवरों में मेटास्टेसिस को और सत्यापित करने के लिए, ट्यूमर-असर MYCN और MYCN; 5 से 9 महीने की उम्र में एलएमओ 1 ट्रांसजेनिक मछली को न्यूरोब्लास्टोमा मार्कर, टीएच के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पैराफिन सेक्शनिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए अधीन किया गया था। एक MYCN के लिए प्रतिनिधि परिणाम; LMO1 मछली चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया है। सैगिटल वर्गों के एच एंड ई धुंधला होने से पता चला है कि प्राथमिक ट्यूमर इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र से उत्पन्न हुआ, मानव अधिवृक्क ग्रंथि के बराबर ज़ेब्राफ़िश, जो न्यूरोब्लास्टोमा रोगी 12,22 (आंकड़े 2 ए, बी) में प्राथमिक बीमारी की सबसे आम साइट है। हाइपरक्रोमैटिक नाभिक के साथ छोटे, अविभाजित और गोल कैंसर कोशिकाओं से बना, ट्यूमर अक्सर परतों का गठन करता है जो हिस्टोलॉजिकल रूप से मानव न्यूरोब्लास्टोमा के समान थे जैसा कि पहले वर्णित था6 (आंकड़े 2 ए, बी)। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 बी) द्वारा अवलोकन के अनुरूप, अंतर-गुर्दे की ग्रंथि से दूर व्यापक ट्यूमर द्रव्यमान को कई क्षेत्रों में पाया गया था, जिसमें शामिल हैं: गुर्दे का दूरस्थ हिस्सा (ज़ेब्राफ़िश का प्राथमिक वयस्क हेमटोपोइएटिक आला और स्तनधारी अस्थि मज्जा 23 के बराबर) (चित्रा 2 ए, सी), कक्षा (आंकड़े 2 ए, डी), गिल (स्तनधारी फेफड़े 24 के अनुरूप) (आंकड़े 2 ए, ई), प्लीहा (स्तनधारी लिम्फ नोड 25 के अनुरूप) (चित्रा 2 ए और 2 एफ) और दिल के अलिंद कक्ष की आंतरिक दीवार (आंकड़े 2 जी)। इनमें से कई मेटास्टेसिस उच्च जोखिम वाले न्यूरोब्लास्टोमा वाले रोगियों में देखे गए मेटास्टेसिस की सामान्य साइटों को दोहराते हैं, जिसमें अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड, कक्षा क्षेत्र और फेफड़े 13,23,24,25 शामिल हैं। टीएच के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ आगे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने प्राथमिक ट्यूमर और सभी मेटास्टैटिक साइटों (आंकड़े 2 एच-एम) पर ट्यूमर कोशिकाओं के पीएसएनएस न्यूरोब्लास्ट वंश की पुष्टि की।

ट्यूमर मेटास्टैटिक प्रसार में तेजी लाने में MYCN और LMO1 के बीच तालमेल के अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के प्रयास में, यह पाया गया कि ट्यूमर सेल में शामिल जीन के एक पैनल के अभिव्यक्ति के स्तर को एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन में शामिल किया गया था, जो कि MYCN और LMO113 दोनों के ओवरएक्सप्रेशन के साथ मछली के ट्यूमर में काफी ऊंचा था। यह जांचने के लिए कि क्या बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स वास्तव में LMO1-overexpressing ट्यूमर में परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति से प्रभावित था, जिससे ट्यूमर के प्रसार या प्रवास में वृद्धि हुई, MYCN-केवल और MYCN से पैराफिन अनुभाग; LMO1 ट्यूमर Picrosirius लाल (PSR), कोलेजन फाइबर के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक दाग, कोलेजन जमाव और extracellular मैट्रिक्स (ECM) कठोरता का आकलन करने के लिए 26,27 के साथ दाग थे। जैसा कि चित्रा 3ए-ई में दिखाया गया है, एमवाईसीएन में पाए जाने वाले पीएसआर-दाग कोलेजन फाइबर की काफी मात्रा और बढ़ी हुई मोटाई थी; LMO1 ट्यूमर, जब ट्यूमर की तुलना में केवल MYCN अकेले व्यक्त करते हैं। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि LMO1 का ओवरएक्सप्रेशन ट्यूमर ईसीएम को अपनी कठोरता को बढ़ाने के लिए फिर से तैयार कर सकता है, और इसलिए, ट्यूमर सेल प्रसार की सुविधा प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: MYCN और LMO1 ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों के प्रजनन से संतानों पर ट्यूमर स्क्रीनिंग परख का चित्रण. (ए) न्यूरोब्लास्टोमा अध्ययन के लिए MYCN और / या LMO1-overexpressing स्थिर ट्रांसजेनिक मछली की छँटाई और ट्यूमर स्क्रीनिंग का योजनाबद्ध चित्रण। ऊपरी पैनल: EGFP-MYCN + भ्रूण के प्रतिनिधि चित्र 1 दिन के बाद निषेचन (dpf) (बाईं ओर पृष्ठीय दृश्य और दाईं ओर पार्श्व दृश्य) पर। निचले पैनलों: mCherry-LMO1 + भ्रूण के प्रतिनिधि चित्र 3 dpf पर (बाईं ओर पार्श्व दृश्य और दाईं ओर वेंट्रल दृश्य)। एएसी, आर्क-संबद्ध कैटेकोलामिनर्जिक न्यूरॉन्स; सीए, कपाल गैन्ग्लिया; और एमओ, मेडुला ओब्लोंगाटा। स्केल बार, 100 μm. BioRender.com (बी) के साथ बनाया गया LMO1 और MYCN के Coexpression न्यूरोब्लास्टोमा मेटास्टेसिस को बढ़ावा देता है। बाएं: Transgenic मछली 36 महीने की उम्र में EGFP-व्यक्त ट्यूमर (सफेद तीर) के साथ अकेले MYCN (MYCN) overexpressing. दाएं: ट्रांसजेनिक मछली MYCN और LMO1 (MYCN) दोनों को अतिरंजित करती है; LMO1) प्राथमिक साइट (IRG, सफेद तीर) और 36 महीने की उम्र में कई मेटास्टैटिक साइटों (ठोस एरोहेड्स) पर एक mCherry-सकारात्मक ट्यूमर द्रव्यमान के साथ। स्केल बार, 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: MYCN और LMO1 के सह-overexpression ट्रांसजेनिक zebrafish मॉडल में neuroblastoma के दूर मेटास्टेसिस को बढ़ावा देता है। (A-G) एच एंड ई-MYCN के दाग sagittal वर्गों ; LMO1 ट्रांसजेनिक मछली जबकि उम्र के 6 महीने में. (H-M) MYCN के immunohistochemical विश्लेषण के आवर्धित विचार ; Tyrosine hydroxylase (TH) एंटीबॉडी का उपयोग कर sagittal ऊतक वर्गों में LMO1 ट्रांसजेनिक मछली। सफेद बॉक्स इंटररेनल ग्रंथि (बी, एच) को रेखांकित करता है, जिसमें पैनल बी और एच में आवर्धित दृश्य होते हैं। प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं को गुर्दे के मज्जा (सी, आई, सी, और मैं ठोस काले एरोहेड्स के साथ), आंख के स्क्लेरा (डी, जे, डी, और जे काले रेखांकित और सफेद भरे खुले तीरों के साथ), गिल (ई, के, ई, और के काले रेखांकित और सफेद भरे खुले एरोहेड्स के साथ), प्लीहा (एफ, एल, एफ, और एल ठोस काले तीर के साथ) में पाया गया था। और दिल कक्ष (जी और एम काले रेखांकित और सफेद भरे डबल एरोहेड्स के साथ)। स्केल सलाखों, 100 μm (ए) और 50 μm (बी-एम)। इस आंकड़े को Zhu, S. et al. LMO1 से संशोधित किया गया है, जो न्यूरोब्लास्टोमा दीक्षा और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के लिए MYCN के साथ Synergizes है। कैंसर सेल। 32, 310-323 (2017)13. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बढ़ी हुई LMO1 अभिव्यक्ति कोलेजन जमाव और ईसीएम कठोरता को बढ़ावा देती है जिससे ज़ेब्राफ़िश मॉडल में ट्यूमर सेल प्रसार की सुविधा होती है। (A-D) कोलेजन फाइबर की प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों को केवल MYCN (A, B) या MYCN में Picrosirius लाल (PSR) द्वारा दाग दिया गया है; LMO1 (C,D) ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश। (बी) और (डी) को (ए) और (सी) के बॉक्स्ड क्षेत्रों से बढ़ाया जाता है, क्रमशः पीएसआर-पॉजिटिव कोलेजन फाइबर को इंगित करने के लिए तीर (ए और बी) और एरोहेड्स (सी और डी) का उपयोग करके। स्केल बार, 100 μm (A और C) और 50 μm (B और D)। (ई) केवल एमवाईसीएन या एमवाईसीएन के ट्यूमर वर्गों पर पीएसआर-दाग वाले क्षेत्रों का परिमाणीकरण; LMO1 ट्रांसजेनिक मछली. परिणामों को MYCN-केवल ट्यूमर में PSR-दाग वाले क्षेत्रों के माध्य के लिए सामान्यीकृत किया गया था। तीन MYCN-केवल या तीन MYCN के औसत ± एसडी के रूप में मौजूद आंकड़े; LMO1 ट्यूमर; p = 0.02 दो पूंछ t-परीक्षण द्वारा. इस आंकड़े को Zhu, S. et al. LMO1 से संशोधित किया गया है, जो न्यूरोब्लास्टोमा दीक्षा और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के लिए MYCN के साथ Synergizes है। कैंसर सेल। 32, 310-323 (2017)13. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ज़ेबराफ़िश का उपयोग आमतौर पर पिछले कुछ दशकों से अनुसंधान में किया जाता है, विशेष रूप से कैंसर अनुसंधान में, स्पष्ट कारणों से, जैसे कि रखरखाव में आसानी, मजबूत प्रजनन, और विवो इमेजिंग 1,28 के लिए स्पष्ट लाभ। ज़ेब्राफ़िश मॉडल को उनके बाहरी निषेचन और विकास के कारण आसानी से भ्रूणीय रूप से हेरफेर किया जा सकता है, जो बड़े पैमाने पर आनुवंशिक अध्ययन 1,2,3 के लिए स्तनधारी मॉडल जीवों, जैसे चूहों और चूहों के लिए अच्छी तरह से पूरक है। इसके अलावा, ज़ेबराफ़िश जीनोम में मानव जीनोम के लिए उच्च-स्तरीय समानताएं हैं। मानव संदर्भ जीनोम के लिए ज़ेब्राफ़िश जीनोम के विस्तृत एनोटेशन की तुलना करते हुए, लगभग 70% मानव जीन को ज़ेबराफ़िश ऑर्थोलॉग 29 प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, अनुसंधान में ज़ेबराफ़िश के अन्य उपयोगों को व्यक्तिगत कैंसर थेरेपी 30,31 के लिए दवा की खोज और रोगी अवतारों तक बढ़ाया गया है। संचित अध्ययनों से पता चला है कि ज़ेब्राफ़िश में प्रेरित ट्यूमर हिस्टोलॉजिकल और आणविक स्तरों पर मानव ट्यूमर के समान हैं, जो ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और विषमता के विच्छेदन में सहायता कर सकते हैं32,33। साथ में, ज़ेब्राफ़िश एक मूल्यवान पशु मॉडल के रूप में जबरदस्त क्षमता प्रदर्शित करता है जिसका उपयोग मेटास्टेसिस का अध्ययन करने और रोग रोगजनन में शामिल संभावित ऑन्कोजेनिक मार्गों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।

LMO1 और MYCN दोनों के overexpression के साथ ट्रांसजेनिक zebrafish मॉडल का उपयोग करते हुए, एनबी और मेटास्टेसिस में इन दो ऑन्कोजीन के बीच सहयोग को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया है। शक्तिशाली लाइव इमेजिंग तकनीकों की आज की उपलब्धता के साथ, ट्यूमर स्क्रीन को आसानी से द्वि-साप्ताहिक रूप से किया जा सकता है और समय के साथ मेटास्टेसिस का पता लगाया जा सकता है। व्यापक मेटास्टेसिस को पैराफिन सेक्शनिंग और एंटीबॉडी स्टेनिंग द्वारा भी पुष्टि की जा सकती है। आश्चर्यजनक रूप से, MYCN में पाए गए मेटास्टेसिस; LMO1 zebrafish उच्च जोखिम वाले एनबी मामलों में देखे गए मेटास्टेसिस की सामान्य साइटों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, जैसे कि अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड्स, कक्षा और फेफड़ों में 34,35, आगे मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य और लाभकारी मॉडल के रूप में ज़ेबराफ़िश का समर्थन करते हैं।

इसके अलावा, अपेक्षाकृत छोटे शरीर के आकार के कारण, पूरे ज़ेबराफ़िश को पूरी तरह से विभाजित किया जा सकता है, जो इस मॉडल का एक और स्पष्ट लाभ है, जो शरीर के अन्य क्षेत्रों में मेटास्टेसिस के साथ-साथ प्राथमिक ट्यूमर के पूरी तरह से लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। ट्यूमर वर्गों के picrosirius लाल धुंधला स्पष्ट रूप से मछली ट्यूमर में कोलेजन नेटवर्क पर प्रकाश डाला है और LMO1 overexpression के साथ ट्यूमर में बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स की बढ़ी हुई कठोरता को दर्शाता है। यद्यपि यह तकनीक ज़ेब्राफ़िश के लिए अद्वितीय नहीं है, ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर उच्च-थ्रूपुट यौगिक स्क्रीनिंग के साथ इसका आवेदन जो आनुवंशिक रूप से संशोधित या ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है, प्रभावी यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में एक उपन्यास साधन प्रदान कर सकता है जो बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स रीमॉडलिंग को लक्षित कर सकता है, जो ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस में शामिल एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है।

स्थिर ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश मॉडल हमारे लिए विवो में ट्यूमर के विकास के लिए उम्मीदवार ऑन्कोजीन के योगदान को समझने के लिए बहुत उपयोगी हैं, हालांकि इन लाइनों को विकसित करना चुनौतीपूर्ण और श्रमसाध्य हो सकता है। एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन बनाने के लिए लंबे समय तक समय की आवश्यकता होती है क्योंकि लाइन प्रसार से पहले कई पीढ़ियों का अधिग्रहण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इन लाइनों का प्रचार करना थकाऊ हो सकता है, और रणनीतिक संभोग योजनाओं की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, एक MYCN ट्रांसजेनिक मछली की उत्पादकता अक्सर ट्यूमर विकसित होने के बाद स्पष्ट रूप से कम हो जाती है, और होमोजीगस MYCN ट्रांसजेनिक मछली वयस्कता में अच्छी तरह से जीवित नहीं रहती है। इसलिए, MYCN ट्रांसजेनिक मछली लाइन को बेहतर ढंग से बनाए रखने के लिए, यह WT या अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मछली लाइनों, जैसे LMO1 ट्रांसजेनिक मछली लाइन के साथ एक छोटी उम्र में विषमयुग्मजी गैर-ट्यूमर-असर MYCN ट्रांसजेनिक मछली को आउटक्रॉस करने की सिफारिश की जाती है। स्थिर ट्रांसजेनिक मछली लाइनों को विकसित करने और बनाए रखने में चुनौतियों को दूर करने के लिए, मोज़ेक क्षणिक ट्रांसजेनेसिस मुख्य रूप से इंजेक्ट की गई मछली में ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के लिए एक एकल जीन या जीन के संयोजन के योगदान का तेजी से और प्रभावी ढंग से आकलन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है। इसके अलावा, प्राथमिक इंजेक्टेड मछली में ट्रांसजीन एकीकरण का मोज़ेक पैटर्न रोग रोगजनन की बेहतर नकल कर सकता है, विशेष रूप से दैहिक घटनाओं से प्रेरित 36।

हालांकि, कैंसर का अध्ययन करने के लिए अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले किसी भी अन्य पशु मॉडल की तरह, ज़ेबराफ़िश के भी अपने नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, विशेष रूप से ज़ेब्राफ़िश प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी काफी हद तक अविकसित रहते हैं, हालांकि न्यूरोब्लास्टोमा मार्कर जीन के खिलाफ कई एंटीबॉडी- जैसे टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेस, सिनाप्टोफिसिन और एचयूसी-सौभाग्य से ज़ेब्राफ़िश 6,13 में अच्छी तरह से काम कर रहे हैं। इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, कई विक्रेताओं ने अपने उत्पादों का परीक्षण करना शुरू कर दिया है और ज़ेबराफ़िश प्रोटीन के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया में अपने एंटीबॉडी की क्षमता की भविष्यवाणी की है। मान्य एंटीबॉडी के बारे में अधिक जानकारी ज़ेब्राफ़िश सूचना नेटवर्क (ZFIN) में भी पाई जा सकती है। इन प्रयासों के साथ, अधिक से अधिक एंटीबॉडी जो विशेष रूप से ज़ेब्राफ़िश प्रोटीन का पता लगा सकते हैं, जल्द ही ज़ेबराफ़िश समुदाय के लिए उपलब्ध हो जाएंगे। एनबी रोगजनन में जटिल सिग्नलिंग मार्गों के इंटरप्ले को विच्छेदित करने के लिए एक आनुवंशिक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करने की एक और चुनौती इसका आंशिक रूप से डुप्लिकेट जीनोम है। इस तरह के जीनोम दोहराव, जो ज़ेब्राफ़िश 37,38 के प्राकृतिक वंश में हुआ था, अक्सर मनुष्यों के लिए ज़ेबराफ़िश होमोलॉग्स के एक से अधिक संस्करणों को जन्म दे सकता है। यह उपन्यास जीन कार्यों या पशु मॉडल 39 में अद्वितीय अभिव्यक्ति पैटर्न के एक विकसित लाभ का कारण बन सकता है। इसलिए, ट्यूमर दमन में संभावित भूमिकाओं के साथ जीन का अध्ययन करते समय, डुप्लिकेट जीन के कई एलील के लिए अपने ट्यूमर दमन समारोह को प्रदर्शित करने के लिए एक ही समय में दस्तक देने के लिए आवश्यक हो सकता है, जो संभावित रूप से समय लेने वाला और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रयास हो सकता है।

फिर भी, ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश मॉडल विवो में ट्यूमर मेटास्टेसिस के सभी चरणों को ईमानदारी से दोहरा सकता है, और आनुवंशिक विश्लेषण और ट्यूमर प्रसार के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए स्पष्ट लाभ रखता है। इसलिए, यह मॉडल प्रणाली हमारे लिए क्षेत्र में कई चुनौतीपूर्ण प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक अद्वितीय उपकरण प्रदान करती है, जैसे कि विवो में ट्यूमर प्रसार और मेटास्टेसिस की मल्टीस्टेप प्रक्रिया के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर घटनाएं क्या हैं, जब एनबी कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर से फैलती हैं, और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट एनबी मेटास्टेसिस में कैसे योगदान देता है। दवा की स्क्रीनिंग और परीक्षण के लिए ज़ेब्राफ़िश की मजबूती के साथ, मछली मॉडल मेटास्टैटिक एनबी को रोकने या इलाज करने के लिए उपन्यास एजेंटों और अवरोधकों की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान साधन भी प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से एक अनुदान R01 CA240323 (S.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था; संयुक्त राज्य अमेरिका के रक्षा विभाग (डीओडी) से एक अनुदान W81XWH-17-1-0498 (S.Z.); कैंसर अनुसंधान के लिए वी फाउंडेशन (एसजेड) से एक वी विद्वान पुरस्कार और बायोमेडिकल डिस्कवरी (एसजेड) के लिए मेयो सेंटर से एक मंच अनुदान; और मेयो क्लिनिक कैंसर सेंटर और सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (एसजेड) से समर्थन करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit Vector SK-4100
Acetic Acid Fisher Scientific / Acros Organic 64-19-7
Agarose GP2 Midwest Scientific 009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Pel-Freez P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
BOND Intense R Detection Leica Biosystems DS9263
BOND primary antibody diluent Leica Biosystems Newcastle, Ltd. AR9352
BOND-MAX IHC instrument Leica Biosystems Newcastle, Ltd. N/A fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone BACPAC resources center (BRFC) N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera Olympus AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) Richard-Allan Scientific 8312-4
Eosin Leica 3801601 ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol Carolina 86-1263
Expand Long Template PCR System Roche Applied Science, IN 11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) Dako E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC HHS-32-1L
HRP Avidin D Vector A-2004
Hydrochloric Acid Aqua Solutions 4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3% Fisher Scientific H324-500
I-SceI enzyme New England Biolabs, MA R0694L
Kanamycin sulfate Teknova, Inc. K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 34133
Lithium Carbonate Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC 554-13-2
Microtome for sectioning Leica Biosystems RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404006
p3E-polyA  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax Surgipath Paraplast 39603002 Parrafin to parafin
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany N/A a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector Thermo Fisher Scientific 12536-017
pDONRP4-P1R donor vector  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
Phenol red, 0.5% Sigma Aldrich  P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X BioRad 1610780
Picrosirrius red stain kit Polysciences 24901-250
pME-mCherry Addgene 26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
RDO Rapid Decalcifier Apex Enginerring RDO04
Sodium Azide (NaN3) Sigma Aldrich 26628-22-8
Stereo fluorescence microscope Leica MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging Nikon SMZ-1500
Taq DNA Polymerase New England Biolabs, MA M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor Sakura N/A Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S Western Chemical Incorporated 20513
Xylene Thermo Fisher Scientific X3P1GAL

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References

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Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C., Levee, T., Zhu, S. Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis. J. Vis. Exp. (169), e62416, doi:10.3791/62416 (2021).

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