Summary
본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.
Abstract
Zebrafish는 인간 질병, 특히 암을 연구하는 중요한 동물 모델로 부상했습니다. Zebrafish 모델링에 적용된 강력한 형질 전환 및 게놈 편집 기술과 함께 유지 보수의 용이성, 고수량 생산성 및 강력한 라이브 이미징은 모두 제브라피쉬를 생체 내에서 이 공정의 기초에 기초한 전이 및 세포 및 분자 기지를 연구하는 귀중한 모델 시스템으로 만듭니다. 전이의 첫번째 제1 제브라피시 신경모세포종 (NB) 모형은 도파민 베타-하이드록실라제 (dβh) 프로모터의 통제하에, 2개의 종양유전자, MYCN 및 LMO1를 과보로 해서 개발되었습니다. CO-표현 된 MYCN 및 LMO1 신경 모세포종 발생의 감소 된 대기 시간 및 증가 침투뿐만 아니라 종양 세포의 가속 먼 전이로 이어졌다. 이 새로운 모델은 임상적으로 관련되고 전이 연관된 유전 적 변경의 참여를 포함하여 인간 전이성 NB의 많은 주요 특징을 안정적으로 반복합니다. 생체 내에서 전이의 자연적이고 자발적인 발달; 전이의 보존 사이트. 따라서, 제브라피쉬 모델은 생체내에서 종양 전이의 복잡한 과정을 해부하는 독특한 장점을 갖는다.
Introduction
Zebrafish는 널리 사용되고 연구의 여러 영역에 적용되었습니다, 특히 암에서. 이 모델은 강력한 생식, 비용 효율적인 유지 보수 및 종양 성장 및 전이의 다목적 시각화와 같은 많은 이점을 제공하며, 이 중 제브라피쉬는 종양 발생 및 전이의 세포 및 분자 기지를 연구하고 조사할 수 있는 강력한 도구로 만듭니다. 대규모 게놈 매핑, 전염, 유전자 과발성 또는 녹아웃, 세포 이식 및 화학 스크린을 위한 새로운 기술은 제브라피시 모델1의 힘을 대단히 증강시켰습니다. 지난 몇 년 동안, 많은 얼룩말 물고기 라인은 백혈병, 흑색종, rhabdomyosarcoma, 및 간세포 암에 국한되지 않는 다양한 인간 암의 종양 발생 및 전이를 연구하기 위하여 개발되었습니다2,3,4,5. 또한, 신경모세포종(NB)의 제1 제1 제1 제보브라시모델은 도파민-베타-하이드록실라제(dβh) 프로모터를 통제하에 있는 말초 교감 신경계(PSNS)에서 종양유전자인 MYCN을 과발현함으로써 생성되었다. 이 모델로, 활성화된 ALK가 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 종양 발병을 가속화하고 생체내에서 종양 침투를 증가시킬 수 있음을 더욱 입증되었다.
NB는 신경 문장 세포의 동감 계보에서 파생되고, 어린이의 고이성암이다7. 그것은 소아암 관련 죽음의 10%를 책임집니다8. 진단에서 널리 전이되는, NB는 PSNS9,10의 교감 심정 및 부신 수질의 사슬을 따라 주로 유래하는 종양으로 임상적으로 제시될 수 있습니다. MYCN 증폭은 일반적으로 NB 환자에서 가난한 결과와 연관11,12. 더욱이, LMO1은 고위험 케이스13,14에서 중요한 NB 감수성 유전자로 확인되었습니다. 연구 결과는 제브라피시 모형의 PSNS에 있는 MYCN및 LMO1의 형질전환이 NB의 초기 개시를 승진시킬 뿐 아니라, 또한 고위험 NB13를 가진 환자에서 일반적으로 보인 사이트에 유사한 조직 및 기관에 광범위하게 전이를 유도한다는 것을 것을을 발견했습니다. 아주 최근에, NB의 또 다른 전이성 표현형은 또한 NB의 새로운 제브라피시 모형에서 관찰되고, MYCN과 Lin28B, RNA 결합 단백질을 인코딩하는, dβh promoter16의 통제하에 과발현되는.
제브라피시에 있는 안정한 형질 전환 접근법은 관심있는 유전자의 과발현이 일반적인 발달 및 질병 병인에 기여할 수 있었다는 것을 연구하기 위하여 수시로 이용됩니다14,15. 이 기술은 성공적으로 NB 종양 발생에 여러 유전자와 경로의 중요성을 입증하기 위해 사용되었습니다6,16,17,18,19,20. 이 논문에서는 PSNS에서 MYCN과 LMO1을 과도하게 표현하는 형질전환선이 어떻게 만들어졌는지, 그리고 이 두 종양발생의 협력이 NB 종양발생과 전이의 발병을 가속화한다는 것이 어떻게 입증되었는지소개합니다. 첫째, dβh 프로모터(지정된 MYCN 라인)의 제어하에 EGFP-MYCN을 과발현하는 형질전환선은 dβh-EGFP-MYCN 구조를 야생형(WT) AB 배아의 1세포 단계로 주입하여 개발하였으며, 이는 이전에 설명된 바와 같이 6,17이다. PSNS(지정된 LMO1 라인)에서 LMO1을 과발현하는 별도의 형질전환선은 1세포 13단계에서 WT 배아에 2개의 DNA 구조, dβh-LMO1 및 dβh-mCherry를 주입하여 개발되었다. 이전에는 이중 DNA 구조를 생성하여 물고기 게놈으로 통합될 수 있음을 입증했습니다. 따라서, LMO1 및 mCherry는 형질전환 동물의 PSNS 세포에서 공동 발현된다. 주입 된 F0 배아가 성숙에 도달하면, 그들은 트랜스 진 (들) 통합을 가진 긍정적인 물고기의 식별을 위해 WT 물고기와 교차했습니다. 간단히, F1 자손은 PSNS 세포에서 mCherry 발현에 대한 형광 현미경 검사법에 의해 처음으로 검열되었다. mCherry 양성 물고기에서 LMO1의 세균성 통합은 게놈 PCR 및 시퀀싱에 의해 더 확인되었다. 각 형질전환선의 성공적인 식별 후, 이종구스 MYCN 및 LMO1 형질형 물고기의 자손은 MYCN과 LMO1을 모두 표현하는 복합 어류 라인을 생성하기 위해 교배되었다 (지정된 MYCN; LMO1 라인). 종양 베어링 MYCN; LMO1 물고기는 1 차 부위, 인터신장 영역 (IRG, 인간 부신의 얼룩말 물고기 에 상응하는)에 먼 지역에서 전이성 종양의 증거를 위해 주중 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다. MYCN에서 종양의 전이를 확인하려면; LMO1 물고기, 조직학적 및 면역 조직화학 적 분석이 적용되었다.
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Protocol
제브라피시와 동물 관리/유지관리를 이용한 모든 연구 방법은 메이요 클리닉의 제도적 가이드라인에 따라 수행되었습니다.
1. PSNS에서 과발현을 가진 LMO1 형질전환 제브라피시 라인의 개발을 위한 트랜스진 구조의 제조 및 미세 주입
- LMO1-pDONR221 항목 클론을 개발하기 위해, PCR을 사용하여 인간 세포주로부터 얻은 cDNA로부터 인간 LMO1의 코딩 영역을 증폭시한다.
- 여기에 자세히 설명된 대로 25 μL 반응을 확인하십시오: 10x 표준 Taq 반응 버퍼의 2.5 μL, Taq DNA 폴리머라제0.125 μL, 10mm dNTPs의 0.5 μL, cDNA 템플릿 2μL, 10 μM 포워드 LMO1 ATTB1 프라이머의 0.5 μL, 10 μM 역 LMO1 ATTB2 프라이머, 물 18.875 μL.
참고: 앞으로 LMO1 ATTB1 프라이머 사용: 5'GGGGACAAGTAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGGTGCTGGACAAGAGA-3' 및 역 LMO1 ATTB2 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTAAAGAGGTTTTTACT
가액트게가트카아그-3' - 다음 프로그램을 사용하여 증폭 : 94 °C의 1 주기, 2 분; 그 다음으로 30°C(94°C, 30초, 55°C, 30초, 72°C, 1분) 및 72°C, 7분, 7분.
- 여기에 자세히 설명된 대로 25 μL 반응을 확인하십시오: 10x 표준 Taq 반응 버퍼의 2.5 μL, Taq DNA 폴리머라제0.125 μL, 10mm dNTPs의 0.5 μL, cDNA 템플릿 2μL, 10 μM 포워드 LMO1 ATTB1 프라이머의 0.5 μL, 10 μM 역 LMO1 ATTB2 프라이머, 물 18.875 μL.
- CLONE LMO1 PCR 제품은 BP 재조합 반응6,13에 의해 pDONR221 게이트웨이 기증자 벡터로 (PCR 단편 + 기증자 벡터 = 엔트리 클론).
- 10 μL 반응의 경우 정제된 LMO1 PCR 제품(150 ng/μL), 1 μL(150 ng/μL) pDONR221 기증자 벡터, 6 μL(pH 8.0) 및 BP 효소 혼합2μL, 25°C에서 1시간 동안 배양, TOP1의 유능한 프로토콜을 사용하여 TOP1로 변환한다.
- 다음으로, 루리아 국물(LB) 한천판에 50-200 μL을 확산시키고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양하였다.
- 50 μg/mL 카나마이신으로 단일 콜로니를 LB 2-5mL로 접종하고 37°C에서 하룻밤(16-18h)을 배양하여 클론을 선택합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 절연에 대 한 하룻밤 세균 문화의 2 mL를 사용 하 여. LMO1 플라스미드를 확인하려면 M13-F 프라이머(5-GTAAAAAACGAGGGAG-3')로 시퀀싱을 위해 플라스미드 샘플을 보내주십시오.
- dβh-pDONRP4-P1R 엔트리 클론을 생성하기 위해, dβh PCR 생성물6,13을 얻어 CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2kb 프로모터 영역을 증폭시킴으로써 이전에 설명된 바와 같이 20 μL 반응을 준비하는 템플릿으로 1.1.1을 한다. 다음 PCR 프로그램 매개 변수를 사용하십시오: 94°C, 2분; 94°C, 15초, 50°C, 30초, 68°C, 8분의 10사이클; 94°C, 15초, 53°C, 30초, 68°C, 8분의 30사이클; 68 °C, 4 분 (앞으로 프라이머 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTCGTACTC
CCCCTTTAGG-3' 및 역 프라이머 5'-GGGGACTGCTTTTGTAACTTGTTGTTGCTTTG
TCGTCTTTTGA-3').
참고: 이 단계에서 긴 DNA 템플릿으로 인해 정확한 PCR 증폭을 위해 적절한 PCR 시스템을 사용할 수 있습니다. - BP 재조합 반응6,13에 의해 pDONRP4-P1R 게이트웨이 기증자 벡터로 클론 dβh PCR 생성물 (PCR 단편 + 기증자 벡터 = 엔트리 클론).
- 정제 된 dβh PCR 제품(172 ng/uL), pDONRP4-P1R 기증자 벡터의 1 μL(150 ng/μL), TE 버퍼(pH 8.0)의 6μL을 총 10μL 반응으로 혼합하고, 25°C에서 1시간 동안 1시간 동안 인큐베이트하였다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 TOP10 유능한 대장균 으로 변환합니다. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 바와 같이 플라스미드를 분리하고 M13-F(5'-GTAAAAAAACGACCCAG-3') 및 M13-R(5'-CAGGAAACAGCATGAC-3') 프라이머로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
- dβh:LMO1 식 구조를 생성합니다.
- 각 엔트리 클론(dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 및 p3E-polyA11)(각각 20fmole), I-SceI 인식 사이트와 수정된 대상 벡터의 1 μL(60 ng/μL) 및 4 μL의 TE 버퍼(pH 8.0)를 결합하여 2μl의 재조합 효소를 함유하고 있습니다. 25°C에서 1h로 이 혼합물을 배양한다.
- 제조 업체의 프로토콜을 따르는 동안, 화학적으로 유능한 TOP10 대장균에 박테리아를 변환. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 플라스미드를 분리하고 DBH 포워드(5'-GAAGCTGTCACAGGTTGTGG-3') 및 LMO1(5'GGCATTGGACAAGTGGCA-3') 프라이머로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
- dβh:mCherry DNA 구조는 5.2kb dβh 프로모터, pME-mCherry 및 p3E-polyA의 엔트리 클론을 I-SceI 인식 부위를 포함하는 수정된 대상 벡터로 결합하여 게이트웨이 시스템과 함께 1.5.16단계를 생성한다. 1.2.2-1.2.4 단계에 설명된 플라스미드를 분리하고 DBH 포워드 프라이머(5'-GAAGCTGTCACAGGTTGTGG-3')로 시퀀싱하여 플라스미드를 검증한다.
- dβh:LMO1 DNA 구조 및 dβh:mCherry DNA 구조(각각 3:1 비율)는 I-SceI 효소(5U/μL)와 0.75 μL의 1μL을 가진 총 15μL 반응 부피(10x)로, 실내 온도에서 최소 4h 또는 하룻밤 동안 배양한다. DNA 농도가 반응에서 750 ng를 초과하지 않는지 확인합니다.
- 다음날 및 분재의 선형화 후, 신선한 I-SceI 효소(5U/μL)의 0.5 μL과 0.5 μL의 0.5%의 페놀 레드를 이전 단계의 총 DNA 혼합물 5μL에 1.7의 이전 단계로부터 추가한다. 1.0mm 직경 유리 마이크로파이펫 바늘을 사용하여 1세포 단계 야생형 AB 배아(및 500배아)에 1세포 단계 야생형 AB 배아(및 500개의 배아)에 1.0mm 직경의 유리 마이크로파이펫 바늘을 마이크로젝트하여 177. 향후 주사를 위해 나머지 DNA 혼합물을 -20°C에 저장합니다.
2. LMO1 및 mCherry의 생식선 전송을 위한 LMO1 형질전환 어항을 화면및 확인
- 3-4일 후 수정(dpf)에서 주입된 배아를 0.02% 트리카인으로 마취하고 모자이크 트랜스제네시스로 인해 어신 전체의 모든 곳에 제시하는 형광 mCherry 발현을 검사합니다. mCherry 양성 배아를 신선한 달걀 물을 곁들인 페트리 접시에 옮기고 제브라피쉬 북21에 따라 배아를 성숙으로 키울 수 있습니다.
참고: 긍정적인 어류의 비율은 연구 인력의 전문 지식과 경험에 따라 달라질 것으로 예상됩니다. 예를 들어, 아마추어를 시작하는 것은 전문가의 ≥50%에 비해 10%의 낮은 통합률을 가질 수 있습니다. - dβh:LMO1 및 dβh:mCherry 트랜스게네스를 가진 창시자 물고기를 결정하기 위해, WT AB 물고기와 이전 단계 (2.1)에서 주사된 mCherry 양성 F0 성적으로 성숙한 물고기의 단일 쌍을 능가합니다. 3-4 dpf에서 mCherry 양성 배아에 대한 F1 세대를 선별합니다.
- mCherry 양성 어류가 LMO1 트랜스진을 운반하는지 확인하기 위해, GDNA 추출 버퍼를 사용하여 F1 mCherry 양성 단일 배아로부터 gDNA를 분리합니다: 4x 리시스 버퍼의 12.5 μL (500 μL 의 1 M Tris 의 8.4, 2.5 mL) 1 M 칼륨 염화물, 정제 및 47 m의 정제 및 단백질 제 K의 2.5 μL 에서 10 mg/mL. 55°C에서 16h의 시료를 배양한 다음 98°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 추출된 gDNA(2 μL)를 프라이머가 함유한 지노티핑 PCR의 템플릿으로 사용하십시오: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' 및 LMO1 RV: 5'-CGAAGGGGATCAGCTTG -3', 및 다음 PCR 프로그램: 94°C, 10분 35 사이클 (30 s94 °C, 30 s용 60 °C; 68 °C, 30 s); 및 7 분 동안 68 °C. 시퀀싱하여 증폭된 182 bp 조각을 확인합니다.
- 유전자형확인 후, 제브라피쉬 북21의 표준 지침에 따라 나머지 mCherry 양성 F1 배아를 성숙으로 올립니다. 상기 프로토콜에서 2.3-2.4단계를 사용하여 2-3개월에 지느러미 클립및 유전자형이 어류에 LMO1 트랜스진의 통합을 더욱 확인한다.
참고: LMO1 양성 F1 물고기는 안정적인 형질전환물고기[Tg(dβh:LMO1), Tg(dβh:mCherry)] ( LMO1 라인으로 지정됨)이 될 것이다. - WT 물고기와 함께 F1 LMO1 안정적인 형질 전환 물고기를 품종이 라인을 전파하는 데 필요한 대로 반복.
3. 전이성 모델을 만들기 위해 LMO1 및 MYCN 형질전환 선의 아웃 크로스
- LMO1 형질전환 제브라피쉬 라인이 생성되면 MYCN 라인6,17과 교배하여 MYCN과 LMO1을 모두 과발현하는 이종화구균 형질전환어선을 개발합니다.
- 1 dpf에서, 힌드뇌 영역에서 EGFP 양성 점으로 제시 입체 형광 현미경으로 EGFP 발현에 대한 아웃 크로스의 자성을 정렬합니다.
참고: 또는, 모든 배아가 1dpf에서 MYCN 을 위해 분류되는 것은 아니더라도, gDNA 격리를 위한 2.3-2.4 단계 에서 이전에 명시된 가이드라인을 사용하여 성인과 유전자형으로 배아를 올리고, 프라이머와 함께 PCR 유전자를 사용하십시오: MYCN-F (5'ATT CAC CAT CAC TGT TGT TCG TCC-3'); MYCN-R(5'TGC ATC ATC ACT CTC CAC GTA-3', 표준 Taq 폴리머라제와 함께 다음 프로그램: 3분 동안 94°C, 30초동안 60°C, 68°C 3분, 68°C) 및 68°C를 15암으로 예상하였다. - EGFP를 1dpf에서 정렬한 후, 선별된 배아를 별도의 페트리 접시로 분리하고 MYCN+(EGFP-Positive) 또는 MYCN-(EGFP-negative)로 라벨 접시를 표시합니다.
- 3-4 dpf에서, 입체 형광 현미경으로 LMO1 발현을 위한 두 그룹(step 3.3)의 배아를 시각화하고 정렬한다. 특히 힌드브레인6,13의 직사각형에서 우수한 자궁 경부 신경절과 비 PSNS 도파민성 뉴런 세포 모두에서 반점으로 적색 형광 단백질 발현을 찾습니다6,13.
참고: 공기가 채워진 수영 방광이 그때까지 완전히 발달하고 배아가 떠다니기 때문에 배아가 5dpf에 도달하기 전에 mCherry/LMO1의 화면이 분류 과정에서 PSNS 세포의 어려운 현미경 초점으로 이어질 수 있습니다. - 정렬이 완료되면 정렬된 물고기를 아래와 같이 다른 유전자형 및 라벨의 4개 그룹으로 분리합니다. 제브라피쉬 북21의 표준 프로토콜에 따라 동일한 조건에서 정렬된 물고기를 올립니다.
- MYCN 전용(EGFP 양성),
- LMO1 전용(mCherry-positive),
- MYCN; LMO1 (EGFP 및 mCherry 이중 양성),
- WT (EGFP와 mCherry 더블 네거티브).
4. 형질전환 제브라피시 라인의 종양 부담을 시각화
- 4주 후 수정(wpf)에서 페트리 접시에 0.02% 트리카인으로 3.5단계에서 선별된 생선을 마취합니다.
- 종양을 보기 위해 금속 주걱으로 물고기를 양쪽 측면에 부드럽게 뒤집어 입체 형광 현미경으로 종양을 시각화합니다. 종양은 단일 EGFP-, 단일 mCherry-, 또는 이중 EGFP-mCherry 양성 질량으로 나타나게 될 것으로 예상하며, 이는 인터신장 부위(머리와 신장 근처)에서 발생합니다.
참고: 초기 종양 발병은 전형적으로 인터신장의 한쪽에 더 밝고 더 큰 형광 양성 질량으로 제시될 수 있으며, 이는 초기 종양 발병을 피하기 위해 물고기의 양면을 시각화하는 것이 중요합니다. - 가능한 종양 베어링 물고기를 식별 한 후, 생년월일, 종양이 검사 된 날짜 및 유전자형을 포함하는 적절한 라벨이있는 별도의 탱크로 물고기를 분리합니다.
- 6 wpf에서, 종양 베어링 물고기와 비 종양 베어링 물고기를 다시 검사하기 위해 4.1-4.3 단계를 반복하여 이전에 선별된 종양 베어링 물고기에 대한 종양의 존재를 확인하거나 각각 새로운 가능한 종양 베어링 물고기를 식별한다. 확인된 종양 베어링 물고기에서 형광 양성 질량의 지속 또는 증가한 크기를 찾아보십시오.
- 종양 을 베어링 물고기를 확인 한 후, 종양 세포 이동의 증거를 위해 격주 모니터링, 이는 종양 발생의 기본 부위에서 멀리 작은 EGFP- 및 /또는 mCherry 양성 종양 질량으로 제시 (인터 신장 영역). 필요에 따라 이러한 물고기를 별도의 탱크로 분리하고 가능한 전이를 나타내기 위해 적절하게 라벨을 부착합니다.
- 전이를 더 확인하기 위해, 먼 형광 양성 종양 질량이 명확하게 증가 된 크기를 보여 줄 때까지 정기적으로 (2 주마다) 이러한 물고기를 추적, 전이성 부위에서 종양의 성장을 나타내는.
5. 종양 베어링 물고기의 조직 처리 및 파라핀 단면
참고: MYCN 및 MYCN에서 자발적으로 개발된 1차 및/또는 전이성 종양을 특성화하기 위해 이 단계를 수행 합니다. LMO1 형질전환 물고기.
- 종양을 낳는 물고기를 식별하고 확인한 후, 0.02% 트리카인으로 생선을 침수하여 페트리 접시에서 4.6단계에서 물고기를 희생한 다음, 생선이 더 이상 다시 약해지고 있지 않을 때까지 트리카인 복용량을 증가시십시오. 물고기를 머리와 신체의 중간 부분(종양 포함)과 물고기의 중간 부분과 꼬리가 있는 다른 조각으로 잘라냅니다.
- 로커의 실온에서 1시간 동안 1x PBS에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 두 어류 섹션을 모두 수정합니다. 고정 효율성을 향상시키기 위해 버퍼를 신선한 4% PFA로 교체하여 내부 장기에 대한 침투를 효과적이고 신속하게 증가시킵니다. 하룻밤 사이에 4 °C 또는 48 h에 대한 로커에 신선한 고정 버퍼와 생선을 둡니다.
주의: PFA는 독성이 있습니다. 예방 절차와 시약의 적절한 폐기는 기관의 규정에 따라 다르므로 시약을 사용하고 폐기하기 전에 적절한 지침을 구하십시오. - 처리에 앞서 실온에서 15-20분 동안 시료를 100% 급속데칼시피어 용액에 배치합니다. 비금속 용기를 사용하고 배양 전반에 걸쳐 샘플(들)을 확인하여 과잉 탈화를 방지해야 합니다. 샘플 조직이 심하게 저하된 것처럼 보이는 경우, 시료를 물 이나 4°C에 배치하여 탈화 과정을 늦출 수 있습니다.
- 일단 고정되고 탈화되면, 생선 샘플을 1 시간 동안 흐르는 수돗물로 씻고 프로세서 카세트에 넣습니다. 샘플이 두 개 이상인 경우 각각을 자체 카세트로 분리합니다.
- 시료가 다양한 솔루션에 잠긴 티슈 프로세서에 생선을 넣은 카세트(들)를 배치하여 파라핀 을 포함시키는 조직을 탈수하고, 각각 다음과 같이 70% 에탄올(60분, 40°C), 85% 에탄올(50분, 40°C), 95% 에탄올(40분, 40°C) 두 번, 100% 에탄올(30분, 40°C), 100% 에탄올(30분, 40°C), 또 다른 신선한 용액 100% 에탄올(50분, 40°C) 40°C) 두 번, 자일렌 (30 분, 40 °C), 또 다른 신선한 자일렌 (50 분, 40 ° C), 또 다른 신선한 자일렌 (50 분, 45 ° C), 파라핀 (30 분, 45 ° C), 파라핀 (20 분, 58 °C) 세 번.
- 조직이 처리된 후 각 카세트의 조직을 유지하면서 프로세서 기계에서 카세트(들)를 내리고 생선 샘플을 혼합하지 않도록 하십시오.
- 물고기의 크기에 따라 적절한 크기의 금형을 선택하여 곰팡이가 생선 샘플과 전체 카세트에 맞는지 확인합니다. 60°C에서 액체 파라핀으로 금형의 바닥을 덮습니다.
- 즉시 생선 위에 생선을 얹고(물고기가 수축구간의 평평한 측면위에 놓여 있는지 확인)와 액체 파라핀을 바르고, 물고기를 완전히 포함시키기 위해 곰팡이 의 상단에 파라핀으로 채우는 것을 마무리합니다.
- 파라핀이 경화될 때까지 절개 마이크로토메의 찬판에 완성된 금형을 놓습니다.
- 파라핀 블록이 단단해지면 시각적으로 더 높은 불투명성과 블록에 대한 단단한 터치를 관찰하여 판단할 수 있으며, 금형에서 블록을 부드럽게 제거합니다. 카세트 의 측면에서 여분의 파라핀을 조심스럽게 긁어 냅니다.
- 파라핀임베디드 어류 블록은 마이크로톤4미크론에서 적당히 하며 증류수를 함유한 40°C의 따뜻한 수조에 섹션을 띄워보냅니다.
- 조심스럽게 양전하 슬라이드에 섹션을 전송하고 6 단계, 7 또는 8 단계로 진행하기 전에 염색하기 전에 30 분 동안 60 °C에서 오븐에서 구워.
6. 헤마톡클린과 에오신 (H&E) 병리학 검토를위한 파라핀 섹션의 염색
- 5.12 단계에서 파라핀 섹션이 포함된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣습니다. 화학 연기 후드 안에, 자일렌3 번, 5 분 각각으로 deparaffinize. 각 사용 후 용액을 폐기합니다.
- 100% 에탄올로 3분 동안 섹션을 재수화하고 신선한 100% 에탄올로 두 번 반복합니다. 100% 에탄올을 95% 에탄올로 교체한 후 3분 동안 80% 에탄올을 교체합니다.
- 증류수로 단면을 5분 동안 헹구는 다. 섹션이 물로 세척하는 동안, 보풀이없는 닦아 헤마톡시린의 표면을 필터링하거나 스키밍하여 헤마톡시린에서 산화 된 입자를 제거해야합니다.
- 미끄럼 방지 전문 등급 물티슈로 슬라이드 홀더의 과도한 물을 블롯하고, 원하는 염색 선호도 및 시약 악화에 따라 2-5분 동안 50% 헤마톡시린(증류수1:1 희석)으로 스테인 슬라이드를 블롯합니다. 매화에서 파란색/갈색으로 용액 색상이 바뀌거나 염색 시간이 과도해지면 헤마톡슬린을 버리십시오. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 20분 동안 헹구십시오.
- 슬라이드를 여러 번 빠르게 찍어 1% 산에 탄올(3.3mL의 염산 70%로 염색)으로 변색합니다. 슬라이드를 최대 3s까지 담그수 있지만 슬라이드를 더 오래 담그면 섹션이 가벼워집니다.
- 슬라이드를 수돗물로 두 번 헹구고 각각 1분, 탈온화된 물로 한 번 헹구십시오. 옵션으로, 슬라이드는 물에 담그고, 이 단계에서 하룻밤 동안 남아있을 수 있습니다.
- 1.36% 탄산염 용액(탄산리튬 47g, 3500mL 물)에 3s로 섹션을 담급니다. 리튬 탄산염 용액의 시간이 길어질수록 조직이 떠있을 가능성이 높기 때문에 섹션을 오버 배양하지 않도록하십시오.
- 5 분 동안 수돗물에 섹션을 헹구고, 보풀이없는 전문 급성 물티슈로 슬라이드 홀더에서 여분의 물을 얼룩.
- 15-30초 동안 100% 즉시 사용할 수 있는 에신으로 슬라이드를 카운터스테인하고, 각각 5분 동안 95%의 에탄올로 즉시 탈수합니다. 각각 5분 동안 100% 에탄올로 교체하고, 사용 후 솔루션을 폐기합니다.
- 자일렌의 섹션을 15분 동안 지우고 총 3회 동안 두 번 반복합니다. 선택적으로, 슬라이드는 더 나은 여분의 물을 취소하기 위해 실온에서 하룻밤 자일렌에 남아있을 수 있습니다.
- 슬라이드가 화학 연기 후드에서 공기 건조하도록 허용한 다음 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 장착하여 조직 샘플을 밀봉합니다.
- 현미경 검사의 밑에 얼룩진 조직 단면도를 시각화하고 심상화합니다. 1 차 적인 사이트에 종양을 주의 깊게 검사 (머리 신장에 있는 interinnal 선 지역) 및 물고기의 그밖 조직 그리고 기관에 있는 먼 산발적인 전이. 병리학자가 검토할 조직 섹션에 얼룩진 슬라이드를 보냅니다. 인간 신경 아세포종에 물고기 모형의 유사한 병리학적인 특징에 근거하여, MYCN 전용 또는 MYCN에서 일어난 종양을 기대 합니다; LMO1 물고기는 병리학자에 의해 신경 모세포종으로 처음 진단될 수 있습니다.
7. NB 마커및 과잉 발현 된 전염된 유전자에 대한 항체를 가진 면역 히스토케미컬 분석 (IHC)은 종양과 그들의 동문 혈통 특성의 확산을 더욱 확인합니다.
- 완전 자동 염색 시스템으로 염색
- IHC 결과를 H&E 염색 결과와 더 잘 비교하려면 IHC 염색을 위해 5.12 단계에서 인접한 슬라이드를 선택합니다.
참고: 자동화된 염색 시스템은 더 빠르고 덜 힘든 결과를 허용하지만, IHC 염색을 위한 수동 프로토콜은 7.2 절의 단계를 참조하여 이러한 경우 사용할 수 있습니다. - 자동화 된 시스템의 해당 1 차 항체 딜루언트와 필요한 원하는 농도 및 총 양을 기준으로 신경 모세포종 마커 인 티로신 하이드록실라제 (TH)(TH)(1:500)에 대한 1 차 항체를 희석시하십시오.
참고: 최적의 항체 농도는 항체 와 조직에 따라 다를 수 있습니다. - 자동화된 시스템은 에피토프 검색 용액을 20분 동안 온보드 열 유도 항원 검색을 사용하고 시스템의 해당 검출 시약을 사용하기 때문에, 기계의 매개 변수가 다음과 같이 설정되어 있는지 확인: Peroxidase 차단, 5분; 원하는 농도를 가진 1 차적인 항체, 15 분; 생체화 항토끼 IgG 이차 항체 (1:500), 8 분; 스트렙타비딘 HRP, 8분; 혼합 DAB 강렬한 기판, 5 분; 그리고 헤마톡시린, 5분.
- 설정이 설정되면 항체 트레이를 기계에 넣습니다. 슬라이드에 레이블이 지정되는 새 케이스를 만들어 슬라이드를 설정합니다. 이제 기기가 로드되어 실행될 준비가 되었습니다(탈밀, 염색 및 카운터스테인링).
- 슬라이드가 자동화 된 기계를 사용하여 탈밀, 염색 및 카운터 스테인드되면 각각 70 %, 95 %, 100 %의 에탄올 그라데이션에서 슬라이드를 탈수합니다. 섹션의 슬라이드를 100% 신선한 에탄올로 다시 5분 동안 잠급니다.
- 자일렌의 섹션을 5분, 두 번 또는 두 번 치우거나, 밤새 자일렌에 슬라이드를 두드려 여분의 물을 더 잘 치웁니다.
- 미끄럼틀을 화학 연기 후드에서 공기 건조하게 한 다음 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 장착합니다. 미세 검사로 염색 된 조직 섹션을 시각화하고 이미지화합니다.
- 물고기 모델의 전이를 확실하게 확인하려면 7단계에서 H&E에 의해 염색된 슬라이드와 6단계에서 H&E에 의해 염색된 신경모세포종 마커에 대한 항체로 염색된 슬라이드를 비교합니다.
참고: H&E 염색에 의해 확인된 모든 종양 세포에서 신경 모세포종 마커, TH를 위한 긍정적인 염색을 볼 것으로 예상합니다. 또한 전이성 종양이 LMO1에서 확인된 인접한 조직에서 TH에 대한 긍정적 인 염색을 기대하지 않습니다 . MYCN 물고기. MYCN과 비슷한 나이의 제어 WT 및 MYCN 전용 물고기를 선택해야 합니다 . 이 분석을 위한 LMO1 물고기는 전이성 종양이 다초점 1차 종양일 가능성을 배제합니다.
- IHC 결과를 H&E 염색 결과와 더 잘 비교하려면 IHC 염색을 위해 5.12 단계에서 인접한 슬라이드를 선택합니다.
- 자동화된 IHC 염색 시스템 없이 수동으로 염색
- 슬라이드를 구울 후 5.12 단계에서 인접한 슬라이드를 선택하여 H&E와 IHC 염색을 더 잘 비교하여 분리합니다. 화학 연기 후드 내부, 탈밀 및 이전 단계를 사용하여 자일렌으로 슬라이드를 수분 6.1 과 6.2., 각각.
- 탈파라피화 및 재수화 후 내생 과산화수소 차단 용액(1x PBS)에서 실온에서 5분간 내생과산화수소 차단 용액(0.1% 아지드 나트륨 및 0.3%의 과산화수소 함유)에 슬라이드를 담그십시오. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 세척하고 총 3회 동안 두 번 반복합니다.
주의: 아지드 나트륨은 심각하게 독성이 있습니다. 교육기관의 규정에 따라 예방 절차와 적절한 시약 처분을 실천해야 합니다. - 실온에서 10분 동안 단백질제 K(1x PBS1:500)를 통해 용액으로 슬라이드를 배양하여 항원들을 회수합니다. 세면 슬라이드3회 1x PBS로 3분 씩 3분.
- 로커의 실온에서 30분 동안 1x PBS에서 5% 염소 세럼으로 인큐베이팅하여 슬라이드를 차단합니다. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 두 번 씻으십시오.
- 아비딘 블로킹 용액 4방울을 슬라이드에 직접 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 두 번 세척한 후, 비오틴 블로킹 용액 4방울을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 차단한 후, 티로신 하이드록실라제(TH)의 1차 항체에서 실온에서 45-60분, 또는 4°C에서 하룻밤동안 배양한다.
참고: 1차 종양 및 기타 전이성 부위의 생리학 및 활성을 해결하기 위해 트랜스게네및 기타 관련 마커에 대한 추가 항체를 가진 얼룩. 최적의 항체 농도는 항체 및 조직에 따라 다를 수 있습니다. - 신선한 1x PBS로 슬라이드를 3분 동안 세척하고 총 3회 반복합니다.
- 생체화 된 안티 래빗 IgG 이차 항체 (1:500)의 이차 항체에서 인큐베이션 슬라이드는 실온에서 45-60 분 동안 차단 용액으로 희석됩니다. 이전 세탁 단계 7.2.7을 반복합니다.
- HRP 컨쥬게이드 아비딘(1x PBS1:300)을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 신선한 1x PBS로 3회 슬라이드를 5분 씩 세탁합니다.
- 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) 용액 (2.5 mL 증류수, 키트 버퍼 1 방울, 과산화수소 1 방울, 키트에서 DAB 2 방울)을 준비하고 DAB방울을 현미경 근처의 슬라이드에 직접 놓습니다. DAB를 추가한 후 현미경 아래 슬라이드의 색상 변화 반응을 관찰하십시오. 원하는 염색 강도에 도달하면 슬라이드 섹션을 차가운 증류수에 배치하여 반응을 중지하십시오.
- 몇 초 동안 샘플을 잠그거나 찍어 증류수로 다시 배치하여 신선한 50 % 헤마톡시린슬라이드를 카운터스테인하십시오. 원하는대로 반복하지만 일반적으로 조직 섹션이 얇기 때문에 한 번 충분해야합니다.
- 이전에 설명된 바와 같이 알코올 그라데이션의 슬라이드에 대한 탈수 조직 샘플을 7.1.5단계로 정하고 IHC 분석을 완료하기 위해 나머지 단계(7.1.8로 마지막 단계)를 계속합니다.
8. 메커니즘 연구로 종양에 콜라겐 축적파라핀 슬라이드의 피크로시리우스 붉은 염색
- 6.1-6.3 단계를 반복하여 슬라이드에서 파라핀 섹션을 탈밀, 수화 및 세척합니다.
- 슬라이드 홀더에서 프로급 보풀이 없는 물티슈로 여분의 물을 블롯한 후, 10분 동안 50% 헤마톡클린에 얼룩을 남습니다. 슬라이드를 흐르는 수돗물로 헹구고 10분 동안 헹구십시오.
- 슬라이드를 피그리리우스 레드로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 산성 수분(5mL 빙하 아세트산 1L의 수돗물 또는 증류수로 세척)을 두 번 세척하여 셰이커에서 5분 동안 배양합니다.
- 슬라이드에서 먼저 대부분의 물을 늘림에 떨어뜨리고 슬라이드의 섹션을 흔들며 가능한 한 많은 물을 제거합니다.
- 슬라이드를 100% 에탄올의 세 가지 변경으로 빠르게 배치하여 파라핀 섹션을 탈수합니다.
- 6.10 및 6.11 단계를 반복하여 자일렌의 슬라이드를 지우고 샘플을 마운트합니다. 다음으로, 카메라가 장착된 복합 현미경이 있는 이미지.
- ImageJ를 사용하여 각 섹션에 대해 적어도 세 개의 무작위 필드에 피그리리우스 적양성 콜라겐 섬유를 계산합니다. MYCN과 MYCN의 슬라이드 사이 비교; LMO1 물고기 섹션.
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Representative Results
LMO1이 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 NB 병원체에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, dβh 프로모터의 통제하에 있는 PSNS 세포에서 LMO1(dβh:LMO1 및 dβh:mCherry) 또는 MYCN(dβh:EGFP-MYCN)의 발현을 구동하는 형질형성생성이 얼룩말피 배아배아로 주입되었다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 안정된 형질전환선의 발달 과 유전자형의 검증 후, 이종고우스 MYCN 및 LMO1 물고기는 교배되었다. 그들의 자손은 MYCN (EGFP+) 또는 LMO1 (mCherry+) 발현을 각각 1 dpf 또는 3-4 dpf로 정렬하였다. MYCN 과발현은 PSNS 개발을 억제하는 것으로 나타났다6. 따라서, EGFP-MYCN 발현은 두개골 신경리아(CA), 아치 관련 카테콜라미너기뉴런(AAC), 및 수질외경구(MO)와 같은 1dpf6에서 비-PSNS 도파민간 뉴런 세포에서 더 두드러보인다. EGFP-MYCN 단백질의 불안정성으로 인해 EGFP 신호는 2일 후에 어두워집니다. 대조적으로, mCherry 발현은 3dpf및 이후의 CA, AAC 및 MO를 포함하는 우수한 자궁 경부 신경절 및 비 PSNS 도파민성 신경 세포와 같은 PSNS 세포 모두에서 두드러지다. 따라서 MYCN 및 LMO1 짝짓기의 자손은 MYCN (EGFP +)의 경우 1 dpf에서 정렬되고 LMO1 (mCherry +)의 경우 3 dpf로 정렬됩니다. 정렬 된 물고기는 다음과 같이 다른 지노티픽 그룹으로 분리되었다 : i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 및 iv) WT, 동일한 조건에서 제기. 4 wpf에서 시작, 자손은 형광 현미경 검사법에 의해 종양의 증거를 위해 격주 검열되었다. 형광 양성 종양 질량은 MYCN과 LMO1 의 과발현을 가진 화합물 형질전환 물고기의 1 차종양 부위로부터 먼 조직 및 기관에서 검출되었지만 MYCN 단독으로 발현된 형질전환 물고기에서는 검출되지 않았다(도 1B).
이러한 형질전환 동물에서 전이를 추가로 확인하기 위해 종양을 베어링 MYCN 및 MYCN; LMO1 트랜스제닉 어류는 5~9개월의 나이에 신경모세포종 마커, TH에 대한 항체를 가진 파라핀 단면 및 면역히스토케미컬 분석을 위해 실시되었다. MYCN에 대한 대표적인 결과; LMO1 물고기는 그림 2에 제시됩니다. 적혈구의 H&E 염색은 1차 종양이 신경모세포종 환자에서 1차 질환의 가장 흔한 부위인 인간 부신의 제브라피쉬(interenal glands) 부위로부터 발생한다는 것을 보여주었다(그림 2A,B). 초색 핵을 가진 작고, 미분화되고, 둥근 암세포로 이루어짐에, 종양은 이전에 설명한 바와 같이 인간 신경모세포종과 조직학적으로 유사한 층을 형성하였다(그림 2A,B). 형광 현미경 검사법(도 1B)에 의한 관찰과 일치하여 신장 간 선으로부터 먼 광범위한 종양 덩어리가 신장의 단층 부분(얼룩말피의 1차 성인 조혈 틈새 및 포유류 골수23)와 비교되는 (그림 2A,C), 궤도(그림 2A,D) 및 원피(그림 2A,D) E), 비장 (포유류 림프절25와 유사) (도 2A 및 2F) 및 심방 챔버의 내벽 (그림 2G). 이 전이의 많은 골수, 림프절, 궤도 지구 및 lung13,23,24,25를 포함하는 고위험 신경 모세포종을 가진 환자에서 보인 전이의 일반적인 사이트를 재차 양수합니다. TH에 대한 항체와의 추가 면역 화학은 1 차 종양 및 모든 전이성 부위에서 종양 세포의 PSNS 신경 폭발 계보를 확인하였다(그림 2H-M).
종양 전이성 확산을 가속화하는 MYCN과 LMO1 간의 시너지 효과를 더 잘 이해하기 위한 노력의 일환으로, 종양 세포에서 세포외 매트릭스 상호 작용에 관여하는 유전자 패널의 발현 수준이 MYCN 과발현을 가진 물고기 종양에서 크게 상승된 것으로 나타났습니다. 세포외 매트릭스가 실제로 LMO1 과발현 종양에서 변경된 유전자 발현에 의해 영향을 받았는지 여부를 검사하기 위해 향상된 종양 보급 또는 이주로 이어지는 MYCN 전용 및 MYCN의 파라핀 섹션; LMO1 종양은 콜라겐 섬유에 대한 고도로 선택적 얼룩인 Picrosirius red(PSR)로 염색되어 콜라겐 증착 및 세포외 매트릭스(ECM) 강성을 평가하였다26,27. 도 3A-E에서 입증된 바와 같이, MYCN에서 발견되는 PSR 염색 콜라겐 섬유의 양과 두께가 크게 증폭되었다. LMO1 종양은 MYCN만을 단독으로 발현하는 종양과 비교했을 때. 이러한 결과는 LMO1의 과발현이 종양 ECM을 리모델링하여 강성을 증가시키고, 따라서 종양 세포 보급을 용이하게 할 수 있음을 보여준다.
도 1: MYCN 및 LMO1 형질형 제브라피시 라인의 사육으로부터 자손에 종양 스크리닝 분석의 그림. (A) 신경 아세포종 연구를 위한 MYCN 및/또는 LMO1 과발현의 선별 및 종양 스크리닝의 회로도 예시. 상부 패널: EGFP-MYCN+ 배아의 대표 사진은 1일 후유료(dpf)(왼쪽및 오른쪽 측면 보기의 등쪽 보기)에서 확인할 수 있습니다. 낮은 패널: 3 dpf에서 mCherry-LMO1+ 배아의 대표 사진 (왼쪽과 오른쪽에 복부 보기). AAC, 아치 관련 카테콜라민기 뉴런; CA, 두개골 간통; 및 MO, 수질나 직사각형. 스케일 바, 100 μm. LMO1과 MYCN의 BioRender.com (B) 코발현으로 만든 신경 모세포종 전이를 촉진합니다. 왼쪽: 36개월에 EGFP 발현 종양(흰 화살)을 가진 MYCN 만(MYCN)을 과도하게 표현하는 트랜젠틱 물고기. 오른쪽: MYCN과 LMO1 (MYCN; LMO1) 1 차 부위 (IRG, 백색 화살표) 및 다중 전이성 부위 (고체 화살촉)에서 mCherry 양성 종양 질량을 가진 36 개월. 스케일 바, 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MYCN과 LMO1의 공동 과발현은 형질 전환 제브라피시 모델에서 신경 모세포종의 먼 전이를 촉진합니다. (A-G) MYCN의 H&E 염색 처상 섹션; LMO1 트랜스제닉 물고기 동안 6 개월 의 나이. (H-M) MYCN의 면역히스토케미칼 분석의 확대된 견해; 경화 조직 섹션에서 LMO1 형질형 물고기, 티로신 하이드록실라제 (TH) 항체를 사용하여. 흰색 상자는 패널 B와 H의 확대된 뷰와 함께 인터레널 선 (b, h)을 간략하게 설명합니다. 전파된 종양 세포는 신장 골수(c, i, C, 그리고 단단한 검은 색 화살로), 눈의 창막(d, j, D, J,검정 윤곽과 흰색으로 채워진 열린 화살표), 아가미(e, k, E, K, K,검정색 으로 윤곽이 있는 및 흰색 으로 채워진 열린 화살), 비장(f, l, F, L) 및 L에서 발견되었습니다. 그리고 심장 챔버 (검은 색 윤곽과 흰색 채워진 이중 화살촉G와 M). 스케일 바, 100 μm (A) 및 50 μm (B-M). 이 수치는 주, S. 외. LMO1에서 수정되어 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 신경 모세포종 개시 및 전이를 촉진합니다. 암 세포. 32, 310-323 (2017)13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: LMO1 발현이 증가하면 제브라피시 모델에서 용이하게 되는 종양 세포 보급으로 이어지는 콜라겐 증착 및 ECM 강성을 촉진한다. (A-D) MYCN에서 피크로시우스 레드(PSR)에 의해 염색된 콜라겐 섬유의 대표적인 광 현미경 이미지(A,B) 또는 MYCN; LMO1 (C,D) 형질형 제브라피시. (B) 및 (D)는 각각 PSR 양성 콜라겐 섬유를 나타내기 위해 화살표(A 및 B) 및 화살촉(C 및 D)을 사용하여(A) 및 (C)의 박스화된 영역에서 확대된다. 스케일 바, 100 μm(A 및 C) 및 50 μm(B 및 D). (E) MYCN의 종양 섹션또는 MYCN의 종양 부위에 대한 PSR 염색 부위의 정량화; LMO1 형질전환 물고기. 결과는 MYCN 전용 종양에 있는 PSR 염색한 지역의 평균으로 정규화되었습니다. 3개의 MYCN 전용 또는 3개의 MYCN의 평균 ± SD로 존재하는 통계; LMO1 종양; p = 0.02 by 두 꼬리 t-test. 이 수치는 주, S. 외. LMO1에서 수정되어 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 신경 모세포종 개시 및 전이를 촉진합니다. 암 세포. 32, 310-323 (2017)13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 지난 수십 년 동안 연구에서 일반적으로 사용되어 왔으며, 특히 암 연구에서는 유지 보수의 용이성, 견고한 재생산 및 생체 내 이미징1,28에 대한 명확한 이점과 같은 명백한 이유로 사용되었습니다. 제브라피시 모델은 대규모 유전 연구를 위해 쥐와 마우스와 같은 포유류 모형 유기체에 잘 보완하는 그들의 외부 풍부하게 함 및 발달 때문에 배아로 쉽게 조작될 수 있습니다1,2,3. 더욱이, 제브라피시 게놈은 인간 게놈과 높은 수준의 유사성을 갖는다. 제브라피시 게놈의 상세한 주석을 인간 기준 게놈과 비교하면, 인간 유전자의 약 70%가 제브라피시 정형소그29를 얻는 것으로 나타났다. 또한, 연구에서 제브라피시의 다른 용도는 개별화된 암 치료를 위한 약물 발견 및 환자 아바타로 확장되었습니다30,31. 모축적 연구는 제브라피시에 유도된 종양이 종양 개시, 진행 및 이질성의 해부에서 도울 수 있는 조직학적 및 분자 수준에서 인간 종양과 유사하다는 것을 보여주었습니다32,33. 함께, 얼룩말 물고기는 전이를 연구하고 질병 병원발생에 관련되었던 가능한 종양발생 통로를 해명하기 위하여 이용될 수 있는 귀중한 동물 모형으로 엄청난 잠재력을 보여줍니다.
LMO1과 MYCN 둘 다의 과발현을 가진 형질전환 제브라피시 모형을 사용하여, NB 종양발생및 전이에 있는 이 두 종양 유전자 사이 협력은 명확하게 입증되었습니다. 오늘날 강력한 라이브 이미징 기술의 가용성으로 종양 스크린은 격주 에 쉽게 수행 될 수 있으며 시간이 지남에 따라 전이를 추적 할 수 있습니다. 광범위 한 전이 또한 파라핀 단면 및 항체 염색에 의해 더 확인 될 수 있다. 놀랍게도, 전이는 MYCN에서 검출; LMO1 얼룩말물고기는 골수, 림프절, 궤도 및 lung34,35와 같은 고위험 NB 사례에서 볼 수 있는 전이의 일반적인 부위와 잘 연관되어 전이 연구를 위한 실현 가능하고 유익한 모델로 제브라피쉬를 추가로 지원합니다.
더욱이, 상대적으로 작은 체내에서, 전체 얼룩말물고기는 완전히 단면될 수 있고, 이는 본체의 다른 지역에서 전이와 함께 1차 종양의 철저한 특성화를 허용하는 이 모델의 또 다른 명확한 이점이다. 종양 단면도의 피크로시우스 적색 염색은 물고기 종양에 있는 콜라겐 네트워크를 명확하게 강조하고 LMO1 과발현을 가진 종양에 있는 세포외 매트릭스의 증가한 강성을 보여줍니다. 이 기술은 제브라피시에 고유하지 않지만, 유전자 변형 또는 종양 세포로 이식 된 제브라피시 배아에 높은 처리량 화합물 스크리닝과 함께 응용 프로그램은 종양 세포 전이에 관련된 중요한 과정인 세포 외 매트릭스 리모델링을 대상으로 할 수있는 효과적인 화합물을 선별하는 새로운 수단을 제공 할 수 있습니다.
안정적인 형질전환 제브라피시 모델은 이러한 대사를 개발하는 데 도전적이고 힘들 수 있지만, 생체 내에서 종양 발달에 대한 후보 온코진의 기여를 이해하는 데 매우 유용합니다. 안정적인 형질전환선을 만들려면 라인 전파 전에 여러 세대를 획득해야 하기 때문에 오랜 시간이 필요합니다. 또한 이러한 라인을 전파하는 것은 지루할 수 있으며 전략적 짝짓기 계획이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, MYCN 형질전환물고기의 생산성은 종양이 발달되면 현저하게 감소되는 경우가 많으며, 상동성 MYCN 형질전환물고기는 성년기에 잘 살아남지 못한다. 따라서, MYCN 형질전환어선을 더 잘 유지하기 위해, LMO1 형질전환어선과 같은 다른 유전자 조작어라인을 가진 이종화구균 비종양계 형질류를 능가하는 것이 좋습니다. 안정적인 형질전환어선을 개발하고 유지하는 데 있어 어려움을 극복하기 위해 모자이크 과도 전환은 단일 유전자의 기여도 또는 유전자의 조합을 1차 적으로 주입된 물고기에서 종양 개시 및 진행에 대한 대체 접근법일 수 있다. 또한, 1차 주입된 물고기에서 의 전균 통합의 모자이크 패턴은 질병 병발생, 특히 체세포 에 의해 유도된 질환 병인을 더 잘 모방할 수 있다36.
그러나, 암을 공부하기 위하여 연구에 사용된 그밖 동물 모형같이, 제브라피쉬는 또한 그것의 단점이 있습니다. 예를 들어, 제브라피쉬 단백질에 대한 항체는 크게 저개발 상태로 남아 있지만, 티로신 하이드로실라제, 시냅토피신 및 HuC-와 같은 신경 모세포종 마커 유전자에 대한 여러 항체는 다행히 제브라피시6,13에서 잘 작동합니다. 이 문제에 대처하기 위해 많은 공급 업체는 제품을 테스트하고 제브라피시 단백질과 상호 반응하여 항체의 잠재력을 예측하기 시작했습니다. 검증된 항체에 대한 자세한 내용은 제브라피시 정보 네트워크(ZFIN)에서도 확인할 수 있다. 이러한 노력으로, 특히 제브라피시 단백질을 검출할 수 있는 점점 더 많은 항체가 곧 제브라피시 공동체에 제공될 것입니다. NB 병기에서 복잡한 신호 경로의 상호 작용을 해부하는 유전자 모델로 제브라피쉬를 사용하는 또 다른 과제는 부분적으로 중복된 게놈입니다. zebrafish37,38의 자연적인 조상에서 일어난 이러한 게놈 복제는 종종 인간에게 제브라피시 동종구의 하나 이상의 변종으로 이어질 수 있습니다. 이것은 동물 모형에 있는 새로운 유전자 기능 또는 독특한 발현 패턴의 진화한 이득을 일으키는 원인이 될 수 있습니다39. 따라서 종양 억제에 잠재적인 역할을 가진 유전자를 연구할 때, 중복된 유전자의 다중 유전자가 종양 억제 기능을 입증하는 동시에 노크될 필요가 있을 수 있으며, 이는 잠재적으로 시간이 많이 걸리고 기술적으로 도전적인 노력이 될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 형질전환 제브라피쉬 모델은 생체 내에서 종양 전이의 모든 단계를 충실하게 재구성할 수 있으며, 유전 분석및 종양 보급의 실시간 이미징에 대한 명확한 이점을 가지고 있다. 따라서 이 모델 시스템은 생체 내 종양 보급 및 전이의 다단계 과정의 근간이 되는 분자 및 세포 이벤트가 무엇인지, NB 세포가 1 차 종양에서 보급될 때, 종양 미세 환경이 NB 전이에 기여하는 방법과 같은 분야에서 많은 어려운 질문을 해결할 수 있는 독특한 도구를 제공합니다. 약물 검사 및 검사를 위한 zebrafish의 견고성으로, 물고기 모형은 또한 전이성 NB를 방지하거나 취급하기 위하여 새로운 에이전트 및 억제제의 효험의 평가를 위한 귀중한 수단을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 암 연구소에서 보조금 R01 CA240323 (S.Z.)에 의해 지원되었다; 미국 국방부(DoD)의 보조금 W81XWH-17-1-0498(S.Z.) V학자상은 V암연구재단(S.Z.)과 마요 생물의학 발견 센터(S.Z.)의 플랫폼 보조금으로 수여됩니다. 메이요 클리닉 암 센터 및 개별 의학 센터 (S.Z.)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
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