Summary
Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.
Abstract
Zebra balığı, başta kanser olmak üzere insan hastalıklarını incelemek için önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Zebra balığı modellemesinde uygulanan sağlam transgenik ve genom düzenleme teknolojilerinin yanı sıra, bakım kolaylığı, yüksek verimli üretkenlik ve güçlü canlı görüntüleme, zebra balığını metastaz ve bu sürecin altında bulunan hücresel ve moleküler temelleri vivo olarak incelemek için değerli bir model sistemi haline getirir. Metastazın ilk zebra balığı nöroblastom (NB) modeli, dopamin-beta-hidroksilyaz (dβh) promotörünün kontrolü altında iki onkogen, MYCN ve LMO1 aşırı ifade ederek geliştirilmiştir. Birlikte ifade edilen MYCN ve LMO1, nöroblastomagenezisin gecikmesinin azalmasına ve penetrancesinin artmasına ve tümör hücrelerinin uzak metastazlarının hızlanmasına yol açtı. Bu yeni model, klinik olarak ilgili ve metastazla ilişkili genetik değişikliklerin katılımı da dahil olmak üzere insan metastatik NB'nin birçok temel özelliklerini güvenilir bir şekilde yineler; metastaz in vivo doğal ve spontan gelişimi; ve metastaz sitelerini korumuş. Bu nedenle, zebra balığı modeli, tümör metastazının karmaşık sürecini in vivo olarak parçalamak için benzersiz avantajlara sahiptir.
Introduction
Zebra balığı, özellikle kanserde çeşitli araştırma alanlarına yaygın olarak kullanılmış ve uygulanmıştır. Bu model, sağlam üremesi, uygun maliyetli bakımı ve tümör büyümesi ve metastazının çok yönlü görselleştirilmesi gibi birçok avantaj sağlar- bunların hepsi zebra balığını tümöregenez ve metastazın hücresel ve moleküler bazlarını incelemek ve araştırmak için güçlü bir araç haline getirir. Büyük ölçekli genom haritalama, transgenez, genlerin aşırı ifade edilmesi veya nakavt edilmesi, hücre nakli ve kimyasal ekranlar için yeni teknikler zebra balığı modelinin gücünü son derece artırmıştır1. Son birkaç yıl içinde, lösemi, melanom, rabdomyosarkom ve hepatosellüler karsinom2,3,4,5 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli insan kanserlerinin tümörjenezi ve metastazını incelemek için birçok zebra balığı hattı geliştirilmiştir. Ek olarak, nöroblastom (NB) ilk zebra balığı modeli, dopamin-beta-hidroksilaz (dβh) promotörünün kontrolü altındaki periferik sempatik sinir sisteminde (PSNS) bir onkogen olan MYCN'nin aşırı ifade edilmesiyle üretildi. Bu model ile aktif ALK'nın tümör başlangıcını hızlandırmak ve in vivo6'daki tümör penetrance'ını artırmak için MYCN ile sinerjiye sahip olabileceği daha da gösterilmiştir.
NB, nöral kret hücrelerinin sympathoadrenal soyundan türetilmiştir ve çocuklarda oldukça metastatik bir kanserdir7. Pediatrik kansere bağlı ölümlerin %10'undan sorumludur8. Tanıda yaygın olarak metastaz yapılan NB, klinik olarak öncelikle sempatik gangliyon zinciri ve PSNS9,10'un adrenal medullası boyunca ortaya çıkan tümörler olarak sunulabilir. MYCN amplifikasyonu genellikle NB hastalarında kötü sonuçlarla ilişkilidir11,12. Ayrıca LMO1, yüksek riskli olgularda kritik NB duyarlılık geni olarak tanımlanmıştır13,14. Çalışmalar, zebra balığı modelinin PSNS'sinde MYCN ve LMO1'in transgenik koexpressasyonunun sadece NB'nin daha erken başlamasını teşvik etmekle kalmayıp, aynı zamanda yüksek riskli NB13 hastalarında yaygın olarak görülen bölgelere benzeyen doku ve organlara yaygın metastaz yaptığını buldu. Çok yakın zamanda, bir RNA bağlayıcı proteini kodlayan MYCN ve Lin28B'nin dβh promotörü16'nın kontrolü altında aşırı ifade edildiği daha yeni bir zebra balığı NB modelinde NB'nin başka bir metastatik fenotipi de gözlenmiştir.
Zebra balıklarındaki kararlı transgenik yaklaşım genellikle ilgi çekici bir genin aşırı ekspresyonunun normal gelişime ve hastalık patogenezine katkıda bulunup bulunamayacağını incelemek için kullanılır14,15. Bu teknik, NB tümörjenezis6,16,17,18,19,20'ye giden birden fazla gen ve yolun önemini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Bu makale, PSNS'de hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden transgenik balık hattının nasıl oluşturulduğunu ve bu iki onkogenin işbirliğinin NB tümörjenezi ve metastaz13'ün başlangıcını nasıl hızlandırdığının nasıl gösterildiğini tanıtacaktır. İlk olarak, dβh promotörünün (mycn hattı olarak belirlenmiş) kontrolü altındaki EGFP-MYCN'yi aşırı ifade eden transgenik hat, dβh-EGFP-MYCN yapısı daha önce açıklandığı gibi vahşi tip (WT) AB embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte ederek geliştirilmiştir6,17. PSNS'de LMO1'i (LMO1 hattı olarak belirlenmiş) aşırı ifade eden ayrı bir transgenik hat, dβh-LMO1 ve dβh-mCherry olmak üzere iki DNA yapısı tek hücreli aşamada WT embriyolarına dönüştürülerek geliştirilmiştir13. Daha önce, sikkelenmiş çift DNA yapılarının balık genomuna kazınabileceği gösterilmiştir; bu nedenle, LMO1 ve mCherry transgenik hayvanların PSNS hücrelerinde birlikte ifade edilir. Enjekte edilen F0 embriyoları cinsel olgunluğa ulaştığında, transgene(ler) entegrasyonu ile pozitif balıkların tanımlanması için WT balıklarıyla aşıldılar. Kısaca, F1 yavruları ilk olarak PSNS hücrelerinde mCherry ekspresyolü için floresan mikroskopi ile tarandı. LMO1'in mCherry pozitif balıklara germline entegrasyonu genomik PCR ve dizileme ile daha da doğrulandı. Her transgenik hattın başarılı bir şekilde tanımlanmasından sonra, heterozipöz MYCN ve LMO1 transgenik balıklarının soyu, hem MYCN hem de LMO1'i ifade eden bileşik bir balık hattı oluşturmak için iç içe geçti (MYCN olarak belirlenmiştir; LMO1 hattı). Tümör taşıyan MYCN; LMO1 balıkları, birincil bölgeye uzak bölgelerde metastatik tümörlerin, interrenal bez bölgesinin (IRG, insan adrenal bezine eşdeğer zebra balığı eşdeğeri) kanıtı için iki haftada bir floresan mikroskopi ile izlendi 13. MYCN'deki tümörlerin metastazını doğrulamak için; LMO1 balıkları, histolojik ve immünohistokimyasal analizler uygulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı ve hayvan bakımı/bakımı kullanılarak yapılan tüm araştırma yöntemleri Mayo Clinic'teki kurumsal yönergelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. PSNS'de aşırı ifade ile LMO1 transgenik zebra balığı hattının geliştirilmesi için transgene yapılarının hazırlanması ve mikroenjeksiyonu
- LMO1-pDONR221 giriş klonunu geliştirmek için, pcr kullanarak insan hücre hattından elde edilen cDNA'dan insan LMO1'in kodlama bölgesini güçlendirin.
- Burada ayrıntılı olarak açık olarak 25 μL reaksiyon yapın: 2,5 μL 10x standart Taq Reaksiyon Tamponu, 0,125 μL Taq DNA Polimeraz, 0,5 μL 10 mM dNTP, 2 μL cDNA şablonu, 0,5 μL 10 μM ileri LMO1 ATTB1 astar, 0,5 μL 10 μM ters LMO1 ATTB2 astar ve 18,875 μL su.
NOT: İleri LMO1 ATTB1 astarı kullanın: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' ve ters LMO1 ATTB2 astar: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-3' - Aşağıdaki programı kullanarak güçlendirin: 1 döngü 94 °C, 2 dk; ardından 30 döngü (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 dk) ve 72 °C, 7 dk.
- Burada ayrıntılı olarak açık olarak 25 μL reaksiyon yapın: 2,5 μL 10x standart Taq Reaksiyon Tamponu, 0,125 μL Taq DNA Polimeraz, 0,5 μL 10 mM dNTP, 2 μL cDNA şablonu, 0,5 μL 10 μM ileri LMO1 ATTB1 astar, 0,5 μL 10 μM ters LMO1 ATTB2 astar ve 18,875 μL su.
- BP rekombinaz reaksiyonu6,13 (PCR fragment + Donor vektör = Entry Clone) tarafından PDONR221 ağ geçidi donör vektörüne LMO1 PCR ürününü klonla.
- 10 μL reaksiyon için, 1 μL saflaştırılmış LMO1 PCR ürünü (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 donör vektörünü karıştırın, ve 2 μL BP enzim karışımı ile 6 μL TE tamponu (pH 8.0), 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatar ve üreticinin protokolünü kullanarak TOP10 yetkin E. coli'ye dönüşür.
- Daha sonra, 50 μg / mL kanamycin içeren bir Luria Suyu (LB) agar plakası üzerindeki dönüşüm şişesinden 50-200 μL yayın ve bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya yayın.
- Tek bir koloniyi 50 μg/mL kanamycin ile 2-5 mL LB'ye aşılayarak ve 37 °C'de bir gecede (16-18 saat) kültleme yaparak klonları seçin.
- Üreticinin protokolüne göre plazmid izolasyonu için 2 mL gece bakteri kültürü kullanın. LMO1 plazmidini doğrulamak için, M13-F astarı (5- GTAAAACGACGGCCAG-3') ile sıralama için plazmid örneği gönderin.
- Bir dβh-pDONRP4-P1R giriş klonu oluşturmak için, daha önce adım 1.1.1'de açıklandığı gibi 20 μL reaksiyon hazırlamak için şablon olarak CH211-270H11 BAC klonunu kullanarak 5.2 kb promotör bölgesini güçlendirerek dβh PCR ürününü6,13 edinin. Aşağıdaki PCR program parametrelerini kullanın: 94 °C, 2 dk; 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 dk 10 döngü; 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 dk 30 döngü; 68 °C, 4 dk (ileri astarlı 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
CCCCTTTTTAGG-3' ve ters astar 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTTTGTTGCTTTTTG
TCGTCTTTTGA-3').
NOT: Bu adımdaki uzun DNA şablonları nedeniyle, doğru PCR amplifikasyonu için uygun bir PCR sisteminin kullanımını sağlayın. - Clone dβh PCR ürünü pDONRP4-P1R ağ geçidi donör vektörüne BP rekombinoz reaksiyonu6,13 (PCR parçası + Donör vektörü = Giriş Klonu).
- Toplam 10 μL reaksiyonda 1 μL saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R donör vektörü ve 6 μL TE tamponu (pH 8.0) 2 μL BP enzim karışımı ile karıştırın, 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin protokolüne göre TOP10 yetkin E. coli'ye dönüştürün. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') ve M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') astarları ile sıralayarak plazmidi doğrulayın.
- dβh:LMO1 ifade yapısını oluşturun.
- Her giriş klonunun 1 μL'sini birleştirin (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 ve p3E-polyA11) (her biri 20 fmole), I-SceI tanıma alanlarına sahip 1 μL (60 ng/μL) modifiye hedef vektör ve 2 μL LR rekombinaz enzim karışımını içeren 4 μL TE tamponu (pH 8.0). Bu karışımı 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin protokolünü takip ederken, bakterileri kimyasal olarak yetkin TOP10 E. coli'ye dönüştürün. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve plazmidi DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGGGTG-3') ve LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') astarları ile sıralayarak doğrulayın.
- 5,2 kb dβh promotörü, pME-mCherry ve p3E-polyA'nın giriş klonlarını, adım 1.5.16'da daha önce belirtildiği gibi I-SceI tanıma sitelerini içeren değiştirilmiş hedef vektörde birleştirerek bir ağ geçidi sistemiyle dβh:mCherry DNA yapısı oluşturun. Plazmidi 1.2.2-1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi izole edin ve plazmidi DBH Forward astarı (5'-GAAGCTGTCAGGGGGGGTG-3') ile sıralayarak doğrulayın.
- Dβh:LMO1 DNA yapısı ve dβh:mCherry DNA konstrüktüyü (sırasıyla 3:1 oranında) 1 μL I-SceI enzimi (5 U/μL) ve 0,75 μL tampon (10x) ile toplam 15 μL reaksiyon hacminde doğrusallaştırın ve oda sıcaklığında en az 4 saat veya gece boyunca kuluçkaya yatırın. DNA konsantrasyonu reaksiyonda 750 ng'yi aşmamasını sağlayın.
- Ertesi gün ve yapıların doğrusallaştırılmasından sonra, önceki adım olan 1,7'den 5 μL toplam DNA karışımına 0,5 μL taze I-SceI enzimi (5 U / μL) ve 0,5 μL% 0,5 fenol kırmızısı ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi 1,0 mm çapında cam mikropipette iğne kullanarak toplam çözeltiyi (50-80 pg doğrusallaştırılmış DNA) tek hücreli yabani tip AB embriyolarına (ve 500 kadar embriyoya) mikroenjan. Kalan DNA karışımını gelecekteki enjeksiyonlar için -20 °C'de saklayın.
2. LMO1 ve mCherry'nin germline iletimi için LMO1 transgenik balık hattını tarayın ve doğrulayın
- Döllenme sonrası 3-4 gün (dpf) sırasında, enjekte edilen embriyoları% 0.02 trikain ile uyuşturun ve mozaik transgenez nedeniyle balık gövdesinin her yerinde herhangi bir yerde bulunan floresan mCherry ekspresyolü için tarayın. mCherry pozitif embriyoları taze yumurta suyu içeren bir Petri kabına aktarın ve embriyoları zebra balığı kitabına uygun olarak cinsel olgunluğa yükseltin21.
NOT: Pozitif balık oranının araştırma personelinin uzmanlığına ve deneyimine bağlı olarak değişmesini bekleyin. Örneğin, yeni başlayan amatörler% 50'≥ bir uzmana kıyasla% 10'luk düşük bir entegrasyon oranına sahip olabilir. - Dβh:LMO1 ve dβh:mCherry transgenes ile kurucu balıkları belirlemek için, enjekte edilmiş mCherry pozitif F0 çiftlerini WT AB balığı ile önceki adımdan (2.1) cinsel olarak olgunlaşmış balıkların dışında. MCherry pozitif embriyolar için F1 neslini 3-4 dpf olarak tarayın.
- mCherry pozitif balığın LMO1 transgene taşıdığını doğrulamak için, aşağıdakileri içeren gDNA ekstraksiyon tamponunu kullanarak gDNA pozitif tek embriyodan izole edin: 12,5 μL 4x lizis tamponu (8,4 pH'lı 1 M Tris'in 500 μL'si, 1 M potasyum klorürün 2,5 mL'si ve 47 mL arıtılmış su), 35 μL arıtılmış su, ve 10 mg/mL'de 2,5 μL proteinaz K. Numuneyi 55 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın, ardından 98 °C'de 10 dk.
- Çıkarılan gDNA'yı (2 μL) astarlı genotipleme PCR için bir şablon olarak kullanın: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' ve LMO1 RV: 5'-CGAAGGGGGATCAGCTTG -3' ve aşağıdaki PCR programı: 94 °C, 10 dk 1 döngü; 35 döngü (30 s için 94 °C, 30 sn için 60 °C; 68 °C, 30 s); ve 7 dakika için 68 °C. Yükseltilmiş 182 bp parçasını sıralayarak onaylayın.
- Genotipin onaylanmasından sonra, kalan mCherry pozitif F1 embriyolarını zebra balığı kitabının standart yönergelerine uygun olarak olgunluğa yükseltin21. LMO1 transgenesinin balıklara entegrasyonunu daha da onaylamak için yukarıdaki protokolden 2.3-2.4 adımlarını kullanarak 2-3 aylıkken bunları klipsle ve genotiple.
NOT: LMO1 pozitif F1 balığı kararlı transgenik balık [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] ( LMO1 hattı olarak belirlenmiştir) olacaktır. - F1 LMO1 stabil transgenik balıkları WT balığı ile yetiştirin ve bu hattı yaymak için gerektiği gibi tekrarlayın.
3. Metastatik model oluşturmak için LMO1 ve MYCN transgenik çizgilerin aşrımı
- LMO1 transgenik zebra balığı hattı oluşturulduktan sonra, hem MYCN hem de LMO1'i aşırı ifade eden heterozipöz transgenik balık hattı geliştirmek için MYCN hattı6,17 ile melezlenmiştir.
- 1 dpf'de, arka beyin bölgesinde EGFP pozitif noktalar olarak sunulan stereoskopik floresan mikroskop ile EGFP ekspresyözü için outcross soylarını sıralayın.
NOT: Alternatif olarak, tüm embriyolar MYCN için 1 dpf'de sıralanmazsa, embriyoları yüzgeç kırpması ile yetişkinliğe ve genotipe yükseltin ve gDNA izolasyonu ve PCR genotipleme için 2.3-2.4 adımlarından daha önce belirtilen yönergeleri kullanarak, astarlarla: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', ve standart Taq polimeraz ile aşağıdaki program: 3 dakika için 94 °C 1 döngü, 35 döngü (30 s için 94 °C, 30 s için 60 °C ve 3 dakika için 68 °C) ve 7 dakika boyunca 145 bp beklenen amplicon boyutu ile 68 °C. - EGFP için 1 dpf'de sıraladıktan sonra, taranmış embriyoları ayrı Petri kaplarına izole edin ve bulaşıkları şu şekilde etiketlendir: MYCN+ (EGFP pozitif) veya MYCN- (EGFP-negatif).
- 3-4 dpf'de, stereoskopik floresan mikroskop ile LMO1 ekspresyasyonu için her iki grubun embriyolarını (adım 3.3) görselleştirin ve sıralayın. Kırmızı floresan protein ekspresyonunun hem üstün servikal ganglion hem de psns dışı dopaminerjik nöronal hücrelerde, özellikle arka beynin oblongata medullasında lekeler olarak arayın6,13.
NOT: Embriyolar 5 dpf'ye ulaşmadan önce mCherry/LMO1 taraması, çünkü hava dolu yüzme mesaneleri o zamana kadar tamamen gelişir ve embriyoların yüzmesine neden olur ve bu da sıralama işlemi sırasında PSNS hücrelerinin zor mikroskobik odaklanmasına neden olur. - Sıralama tamamlandıktan sonra, sıralanmış balıkları farklı genotiplerden oluşan dört gruba ayırın ve aşağıdaki gibi etiketlendirin. Sıralanmış balıkları zebra balığı kitabından standart protokollere göre aynı koşullarda kaldırın21.
- Yalnızca MYCN (EGFP pozitif),
- Yalnızca LMO1 (mCherry-pozitif),
- MYCN; LMO1 (EGFP ve mCherry çift pozitif),
- WT (EGFP ve mCherry çift negatif).
4. Transgenik zebra balığı hatlarında tümör yükünü görselleştirme
- Döllenme sonrası 4 hafta (wpf) sırasında, sıralanmış balıkları bir petri kabında% 0.02 trikain ile 3.5 adımından uyuşturun.
- Tümörü görüntülemek için her iki yan tarafa metal spatula ile balıkları hafifçe çevirerek stereoskopik floresan mikroskopla tümörleri görselleştirin. Tümörlerin interrenal bez bölgesinden (baş ve böbreğe yakın) kaynaklanan tek EGFP, tek mCherry veya çift EGFP ve-mCherry pozitif kitleler olarak sunulmasını bekleyin.
NOT: İlk tümör başlangıcının tipik olarak interrenal bezin bir tarafında daha parlak ve daha büyük bir floresan pozitif kütle ile sunulması mümkündür, bu nedenle erken tümör başlangıcını kaçırmamak için balığın her iki tarafını da görselleştirmek çok önemlidir. - Olası tümör taşıyan balıkların tanımlanmasından sonra, balıkları doğum tarihini, tümörün tarandığı tarihi ve genotipi içeren uygun etiketlerle ayrı bir tanka izole edin.
- 6 wpf'de, tümör taşıyan balıkları ve tümör olmayan balıkları taramak için önceki 4.1-4.3 adımlarını tekrarlayın, daha önce taranmış tümör taşıyan balıklar için tümörlerin varlığını doğrulamak veya sırasıyla yeni olası tümör taşıyan balıkları tanımlamak için. Doğrulanmış tümör taşıyan balıklarda floresan pozitif kütlenin sürekli veya artan boyutunu arayın.
- Tümör taşıyan balıkları tanımladıktan sonra, tümörgenezi (interrenal bez bölgesi) birincil bölgesinden uzakta küçük EGFP ve/veya mCherry pozitif tümör kitleleri olarak ortaya çıkan tümör hücre göçü kanıtı için onları iki haftada bir izleyin. Bu balıkları gerektiğinde ayrı tanklara izole edin ve olası metastazları belirtmek için uygun şekilde etiketlenin.
- Metastazı daha da doğrulamak için, uzak floresan pozitif tümör kitleleri metastatik bölgelerde tümörlerin büyümesini gösteren açıkça artan boyut gösterene kadar bu balıkları düzenli olarak (iki haftada bir) izlemeye devam edin.
5. Tümör taşıyan balıkların doku işleme ve parafin kesitleri
NOT: MYCN ve MYCN'de kendiliğinden gelişen primer ve/veya metastatik tümörleri karakterize etmek için bu adımı gerçekleştirin ; LMO1 transgenik balık.
- Tümör taşıyan balıkların tanımlanması ve doğrulanmasından sonra, balıkları% 0.02 trikain içinde batırarak petri kabındaki 4.6 adımından önce anesteziye kurban edin ve daha sonra balıklar artık solmayınceye kadar trikain dozajını artırın. Balığı, başı ve vücudun orta bölümünün bir kısmını (tümör dahil) içeren bir parça ve balığın orta bölümünün ve kuyruğunun geri kalanıyla başka bir parçaya bölün.
- Her iki balık bölümünü de 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ile bir rocker'da oda sıcaklığında 1 saat sabitlayın. Fiksasyon verimliliğini artırmak için, iç organlara penetrance'ı etkili ve hızlı bir şekilde artırmak için tamponu taze% 4 PFA ile değiştirin. Balıkları bir gecede 4 °C'de veya 48 saat boyunca bir rocker üzerinde taze sabitleme tamponu ile bırakın.
DİkKAT: PFA toksiktir. Reaktifin ihtiyati prosedürleri ve uygun şekilde bertaraf edilmesi kurumunuzun düzenlemelerine bağlı olduğundan, reaktifi kullanmadan ve elden çıkarmadan önce uygun yönergeleri arayın. - İşlemeden önce, numuneleri oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca% 100 hızlı kireç çözücü çözeltisine yerleştirin. Aşırı kireçten arındırma önlemek için bir ametal kapsayıcı kullandığınızdan ve inkübasyon boyunca örnekleri kontrol etmeyi unutmayın. Örnek doku ağır bir şekilde bozulmuş görünüyorsa, kireç çözme işlemini yavaşlatmak için numuneyi suya veya 4 °C'ye yerleştirin.
- Sabitlendikten ve kireçsizleştirildikten sonra, balık örneklerini 1 saat boyunca akan musluk suyuyla yıkayın ve işlemci kasetlerine yerleştirin. Birden fazla örnek varsa, her birini kendi kasetine ayırin.
- Numunelerin çeşitli çözeltilere batırıldığı doku işlemcisine balıklı kasetler yerleştirerek dokuyu susuz bırakıp parafin gömmeye hazırlamak, sırasıyla, aşağıdaki gibi: %70 etanol (60 dk, 40 °C), %85 etanol (50 dk, 40 °C), %95 etanol (40 dk, 40 °C) iki kez, %100 etanol (30 dk, 40 °C), %100 etanol (50 dk, 40 °C) iki kez, ksilen (30 dk, 40 °C), başka bir taze ksilen çözeltisi (50 dk, 40 °C), başka bir taze ksilen (50 dk, 45 °C), parafin (30 dk, 45 °C), parafin (20 dk, 58 °C) üç kez.
- Doku işlendikten sonra, her kasetin organizasyonunu sürdürürken ve balık örneklerinin karıştırılmasını önlediğinizden emin olurken kasetleri işlemci makinesinden boşaltın.
- Balığın büyüklüğüne göre uygun boyuttaki kalıbı seçin, kalıbın tüm kaseti balık örneğine sığdıracağından emin olun. Kalıbın altını 60 °C'de sıvı parafin ile örtün.
- Hemen balığın üzerine sıvı parafin ile balıklı kaseti (balığın sagittal bölümler için düz yanal tarafına yerleştirildiğından emin olarak) yerleştirin ve balığı tamamen gömmek için kalıbın üstüne parafinle doldurmayı bitirin.
- Tamamlanan kalıbı, parafin sertleşene kadar kesit mikrotomunun soğuk plakasına yerleştirin.
- Parafin bloğu sert olduğunda, görsel olarak daha yüksek opaklık ve bloğa sıkı bir dokunuş gözlemleyerek değerlendirilebilir, bloğu kalıptan hafifçe çıkarın. Kasetin yanlarından fazla parafinleri dikkatlice kazıyın.
- Parafin gömülü balık bloğunu mikrotom üzerinde 4 mikronda sagittally olarak bölümlendirin ve bölümleri damıtılmış su içeren 40 °C'de ılık bir su banyosunda yüzdürün.
- Bölümleri pozitif yüklü slaytlara dikkatlice aktarın ve 6, 7 veya 8.
6. Patoloji incelemesi için parafin bölümlerinin hematoksilin ve eozin (H&E) boyanma
- Parafin bölümleri içeren slaytları adım 5.12'den slayt tutucusuna yerleştirin. Kimyasal bir duman kaputunun içinde, her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez ksilen ile deparaffinize edin. Her kullanımdan sonra çözümü atın.
- Bölümleri 3 dakika boyunca% 100 etanol ile yeniden sulayın ve taze% 100 etanol ile iki kez tekrarlayın. 3 dakika boyunca% 100 etanol% 95 etanol ve ardından 3 dakika boyunca% 80 etanol değiştirin.
- Bölümleri damıtılmış suyla 5 dakika durulayın. Bölümler suda yıkanırken, hematoksilin yüzeyini tüy bırakmayan bir mendille filtreleyarak veya sıyırarak oksitlenmiş parçacıkları hematoksilinden çıkardığınızdan emin olun.
- Slayt tutucusundan gelen fazla suyu tüy bırakmayan profesyonel sınıf mendillerle ve leke slaytlarını istenen boyama tercihlerine ve reaktif bozulmasına bağlı olarak 2-5 dakika boyunca% 50 hematoksilin (damıtılmış su ile 1:1 seyreltme) ile lekeleyin. Çözelti rengi erikten mavi/kahverengiye değiştiğinde veya lekeleme süresi aşırı hale geldiğinde hematoksilin atın. Slaytları akan musluk suyuyla 20 dakika durulayın.
- Slaytları birden fazla kez hızlı bir şekilde batırarak bölümleri % 1 asit etanol (3,3 mL% 70 etanol 50 mL hidroklorik asit) içinde renksizleştirin. Slaytlar 3 sn'ye kadar daldırılabilir, ancak slaytlar ne kadar uzun süre batırıldıysa, bölümler o kadar hafif olur.
- Slaytları musluk suyunda iki kez 1 dakika ve bir kez deiyonize su ile durulayın. Bir seçenek olarak, slaytlar bu aşamada bir gecede suya batırılarak bırakılabilir.
- Bölümleri 3 sn için %1,36 lityum karbonat çözeltisi (47 g lityum karbonat, 3500 mL su) içine daldırın. Lityum karbonat çözeltisinde süre ne kadar uzun olursa, dokunun yüzme olasılığı o kadar fazla olduğundan bölümleri aşırı kuluçkaya yatırmamaya dikkat edin.
- Bölümleri musluk suyunda 5 dakika durulayın ve slayt tutucusundan gelen fazla suyu tüy bırakmayan profesyonel sınıf mendillerle lekeleyin.
- Slaytları 15-30 s için% 100 kullanıma hazır eozin içinde karşıt olarak kullanın ve her biri 5 dakika boyunca iki kez% 95 etanol ile hemen susuz kalın. Her kullanımdan sonra çözeltileri atarak her biri 5 dakika boyunca iki kez% 100 etanol ile değiştirin.
- Ksilendeki bölümleri 15 dakika temizleyin ve toplamda 3 kez iki kez tekrarlayın. İsteğe bağlı olarak, fazla suyu daha iyi temizlemek için slaytlar oda sıcaklığında gece boyunca ksilen olarak bırakılabilir.
- Slaytların kimyasal duman kaputunda havayla kurumasını bekleyin ve ardından doku örneğini sızdırmazlık için montaj ortamını kullanarak bir kapak kayması monte edin.
- Mikroskopi altında lekeli doku bölümlerini görselleştirin ve görüntüleyin. Birincil bölgedeki tümörleri (baş böbrekteki interrenal bez bölgesi) ve balığın diğer doku ve organlarındaki uzak sporadik metastazları dikkatlice inceleyin. Patologlar tarafından incelenecek doku bölümleri için lekeli slaytlar gönderin. Balık modelinin insan nöroblastom ile benzer patolojik özelliklerine dayanarak, yalnızca MYCN veya MYCN'de ortaya çıkan tümörleri bekleyin ; LMO1 balıkları ilk olarak patologlar tarafından nöroblastom olarak teşhis edilecektir.
7. Tümörün yayılmasını ve sempatizanal soy özelliğini daha da doğrulamak için NB işaretleyicisine ve aşırı ifade edilen transgenelere karşı antikorlarla immünohistokimyasal Analiz (IHC)
- Tam otomatik boyama sistemi ile boyama
- IHC sonucunu H&E boyama ile daha iyi karşılaştırmak için, IHC boyama için adım 5.12'den bitişik slaytları seçin.
NOT: Otomatik boyama sistemi daha hızlı ve daha az zahmetli sonuçlara izin verse de, 7.2 alt bölümünün adımlarına atıfta bulunarak bunun yokluğunda IHC boyama için manuel bir protokol kullanılabilir. - İstenilen konsantrasyona ve otomatik sistemin karşılık gelen Birincil Antikor Seyrelticisi ile gereken toplam miktara bağlı olarak bir nöroblastom belirteci olan tirozin hidroksilaz (TH) (1:500) karşı birincil antikoru seyreltin.
NOT: Optimal antikor konsantrasyonları antikor ve dokuya bağlı olarak değişebilir. - Otomatik sistem 20 dakika boyunca epitop alma çözümü ve sistemin ilgili algılama reaktifi ile yerleşik ısı kaynaklı antijen alımı kullandığından, makinenin parametrelerinin şu şekilde ayarlanmasını sağlayın: Peroksidaz Engelleme, 5 dk; İstenilen konsantrasyona sahip birincil antikor, 15 dk; biyotinillenmiş anti-tavşan IgG ikincil antikor (1:500), 8 dk; Streptavidin HRP, 8 dk; karışık DAB yoğun substrat, 5 dk; ve Hematoksilin, 5 dk.
- Ayarlar ayarlandıktan sonra antikor tepsisini makineye yerleştirin. Slaytları etiketleyecek yeni bir servis talebi oluşturarak slaytları ayarlayın. Makine artık yüklendi ve çalışmaya hazır (dewaxing, boyama ve karşı lekeleme).
- Slaytlar otomatik makine kullanılarak dewaxed, lekeli ve sayaç olarak bir kez, her biri 5 dakika boyunca% 70, % 95 ve% 100 etanol gradyanlarında slaytları susuz bırakır. Bölümlerin slaytlarını 5 dakika boyunca tekrar% 100 taze etanolde batırın.
- Xylene'deki bölümleri 5 dakika, iki kez temizleyin veya fazla suyu daha iyi temizlemek için slaytları bir gecede ksilen içinde bırakın.
- Slaytların kimyasal duman kaputunda havayla kurumasını bekleyin ve ardından bir montaj ortamı kullanarak bir kapak kayması monte edin. Lekeli doku bölümlerini mikroskopi ile görselleştirin ve görüntüleyin.
- Balık modelinde metastazı kesin olarak doğrulamak için, nöroblastom belirtecine karşı antikorlarla lekelenmiş slaytları 7.
NOT: H&E lekelenme ile tanımlanan tüm tümör hücrelerinde nöroblastom belirteci, TH için pozitif lekelenme görmeyi bekleyin. Ayrıca LMO1'de metastatik tümörlerin tanımlandığı bitişik dokularda TH için pozitif lekelenme beklenmez ; MYCN balığı. MYCN'ye benzer yaştaki kontrol WT ve YALNıZCA MYCN balıklarını seçtiğinizden emin olun ; Metastatik tümörlerin multifokal primer tümör olma olasılığını ekarte etmek için bu analiz için LMO1 balıkları.
- IHC sonucunu H&E boyama ile daha iyi karşılaştırmak için, IHC boyama için adım 5.12'den bitişik slaytları seçin.
- Otomatik IHC boyama sistemi olmadan manuel boyama
- Slaytlar pişirildikten sonra, H&E ve IHC boyama arasında eşitsizleşme arasında daha iyi karşılaştırma sağlamak için 5.12 adımından bitişik slaytları seçin. Kimyasal duman kaputunun içinde, önceki adımlar 6.1 ve 6.2.'yi kullanarak slaytları ksilen ile dewax ve rehidrat.
- Deparaffinizasyon ve rehidrasyondan sonra, slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca endojen peroksit blokaj çözeltisinde (%0,1 sodyum azit ve % 0,3 hidrojen peroksit içeren 1x PBS) bekletin. Slaytları taze 1x PBS'de 3 dakika yıkayın ve toplam 3 kez iki kez tekrarlayın.
DİkKAT: Sodyum azit akut toksiktir. Kurumunuzun yönetmeliklerine bağlı olarak ihtiyati prosedürleri ve reaktifin uygun şekilde bertaraf edilmesini sağlayın. - Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca proteinaz K (1x PBS'de 1:500) ile çözeltideki slaytları inkübe ederek antijeni alın. Slaytları her biri 3 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Rocker'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de% 5 keçi serumu ile inkübasyon yaparak slaytları engelleyin. Slaytları her biri 3 dakika boyunca iki kez taze 1x PBS ile yıkayın.
- Doğrudan kaydırağa 4 damla Avidin engelleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Her biri 3 dakika boyunca iki kez taze 1x PBS ile kaydıraları yıkadıktan sonra, 4 damla Biotin engelleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Slaytları bloke ettikten sonra, oda sıcaklığında 45-60 dakika veya gece boyunca 4 °C'de tirozin hidroksilazının (TH) (1:500) birincil antikorunda kuluçkaya yatırın.
NOT: Primer tümör ve diğer metastatik bölgelerin fizyolojisini ve aktivitesini ele almak için transgenelere ve diğer ilgili belirteçlere karşı ek antikorlarla lekeleyin. Optimal antikor konsantrasyonları antikor ve dokuya bağlı olarak değişebilir. - Slaytları taze 1x PBS ile 3 dakika boyunca yıkayın, toplam 3 kez iki kez tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş biyotinillenmiş anti-tavşan IgG ikincil antikorunun ikincil antikorunda (1:500) inkübasyon slaytları. Önceki yıkama adımı 7.2.7'yi tekrarlayın.
- HRP konjuge Avidin ekleyin (1x PBS'de 1:300) ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yaslayın. Slaytları her biri 5 dakika boyunca taze 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) çözeltisini (2,5 mL damıtılmış su, 1 damla kit tamponu, 1 damla hidrojen peroksit ve kitten 2 damla DAB) hazırlayın ve DAB damlalarını doğrudan mikroskop yakınındaki slaytlara yerleştirin. DAB ekledikten sonra, mikroskop altındaki slaytlardaki renk değişikliği reaksiyonlarını gözlemleyin. İstenilen lekeleme yoğunluğuna ulaşıldıktan sonra, slayt bölümlerini soğuk damıtılmış suya yerleştirerek reaksiyona son ver.
- Numuneleri birkaç saniyeliğine batırarak veya batırarak ve damıtılmış suya geri yerleştirerek slaytları taze% 50 hematoksilin ile karşılayın. İstenildiği gibi tekrarlayın, ancak normalde, doku bölümleri ince olduğu için bir kez yeterli olmalıdır.
- Daha önce adım 7.1.5'te açıklandığı gibi alkol gradyanındaki slaytlarda dehidrat doku örnekleri ve IHC analizini bitirmek için kalan adımlarla (son adım 7.1.8 olarak) devam edin.
8. Mekanizma çalışması olarak tümörlerde kollajen birikimi için parafin slaytlarının Picrosirius kırmızı lekesi
- Slaytlardaki parafin bölümlerini dewax, hidrat ve yıkamak için 6.1-6.3 adımlarını yineleyin.
- Slayt tutucusundan gelen fazla suyu profesyonel sınıf tüy bırakmayan mendillerle lekelendikten sonra, 10 dakika boyunca% 50 hematoksilin lekesi. Slaytları akan musluk suyuyla 10 dakika durulayın.
- Slaytları Picrosirius Red'e aktarın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Slaytları asitlenmiş suda (1 L musluk veya damıtılmış suda 5 mL buzul asetik asit) iki kez yıkayın, çalkalayıcıda 5 dakika inkübe edin.
- Mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için slaytlardaki bölümleri fiziksel olarak sallamadan ve şiştirmeden önce suyun çoğunu slaytlardan arındırın.
- Parafin bölümlerini susuzmak için slaytları hızlı bir şekilde% 100 etanol üç değişikliğe yerleştirin.
- Ksilen ve montaj örneğindeki slaytları temizlemek için 6.10 ve 6.11 adımlarını yineleyin. Ardından, bir kamera ile donatılmış bileşik mikroskoplu görüntü.
- ImageJ kullanarak, her bölüm için en az üç rastgele alanda picrosirius kırmızı-pozitif kollajen liflerini sayın. MYCN ve MYCN slaytları arasında karşılaştırma; LMO1 balık bölümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LMO1'in NB patogenezini etkilemek için MYCN ile sinerji oluşturup oluşturmadığını belirlemek için, dβh promotörünün kontrolündeki PSNS hücrelerinde LMO1 (dβh:LMO1 ve dβh:mCherry) veya MYCN (dβh:EGFP-MYCN) ekspresyonunun yönlendirici transgenik yapıları zebra balığı embriyolarına enjekte edildi13. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, kararlı transgenik çizgilerin geliştirilmesinden ve genotiplerinin doğrulanmasından sonra, heterozipöz MYCN ve LMO1 balıkları iç içe geçti. Yavruları sırasıyla 1 dpf veya 3-4 dpf'de MYCN (EGFP+) veya LMO1 (mCherry+) ekspresyumu için sıralandı. MYCN aşırı ifadenin PSNS gelişimini baskıladığı gösterilmiştir6. Bu nedenle, EGFP-MYCN ekspresyumu, kraniyal gangliyon (CA), kemerle ilişkili katekolaminerjik nöronlar (AAC) ve medulla oblongata (MO) gibi 1 dpf6'daki PSNS dışı dopaminerjik nöronal hücrelerde daha belirgindir. EGFP-MYCN proteininin kararsızlığı nedeniyle EGFP sinyali 2 gün sonra karartıcı hale gelir. Buna karşılık, mCherry ifadesi, 3 dpf ve ons6'dan itibaren CA, AAC ve MO içeren üstün servikal ganglion ve PSNS dışı dopaminerjik nöronal hücreler gibi her iki PSNS hücresinde de belirgindir. Bu nedenle, MYCN ve LMO1 çiftleşmesinin yavruları MYCN (EGFP+) için 1 dpf ve LMO1 (mCherry+) için 3 dpf olarak sıralanır. Sıralanmış balıklar aşağıdaki gibi farklı genotipik gruplara ayrılmıştır: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 ve iv) WT ve aynı koşullarda yükseltilmiştir. 4 wpf'den başlayarak, yavrular floresan mikroskopi ile tümörlerin kanıtı için iki haftada bir tarandı. Bileşik transgenik balıklarda primer tümör bölgesinden uzak doku ve organlarda floresan pozitif tümör kitleleri hem MYCN hem de LMO1'in aşırı ekspresyonu ile saptandı, ancak sadece MYCN ekspresyonu ile transgenik balıklarda saptanmamıştır (Şekil 1B).
Bu transgenik hayvanlardaki metastazları daha fazla doğrulamak için, tümör taşıyan MYCN ve MYCN; 5 ila 9 aylık LMO1 transgenik balıkları, nöroblastom belirteci TH'ye karşı bir antikor ile parafin kesiti ve immünohistokimyasal analizler için tabi tutuldu. MYCN için temsili sonuçlar; LMO1 balığı Şekil 2'de sunulmuştur. Sagittal bölümlerin H&E lekesi, primer tümörün nöroblastom hastasında primer hastalığın en sık görülen yeri olan insan adrenal bezinin zebra balığı eşdeğeri olan interrenal bez bölgesinden ortaya çıktığını göstermiştir12,22 (Şekil 2A,B). Hiperkromatik çekirdekli küçük, farklılaşmamış ve yuvarlak kanserli hücrelerden oluşan tümör, daha önce açıklandığı gibi histolojik olarak insan nöroblastomlarına benzeyen katmanlar oluşturmuştur6 (Şekil 2A,B). Floresan mikroskopi ile yapılan gözlem ile uyumlu olarak (Şekil 1B), böbrekler arası bezden uzak yaygın tümör kitleleri birden fazla bölgede tespit edilmiş, dahil: böbreğin distal kısmı (zebra balıklarının birincil yetişkin hematopoetik nişi ve memeli kemik iliği23 ile karşılaştırılabilir) (Şekil 2A,C), yörünge (Şekil 2A,D), solungaç (memeli akciğerine benzer24) (Şekil 2A, E), dalak (memeli lenf noduna benzer25) (Şekil 2A ve 2F) ve atriyal kalp odasının iç duvarı (Şekil 2G). Bu metastazların çoğu, kemik iliği, lenf nodu, yörünge bölgesi ve akciğer13,23,24,25'i içeren yüksek riskli nöroblastomlu hastalarda görülen metastazların ortak bölgelerini rekaplasür eder. TH'ye karşı antikor ile daha fazla immünhistokimya, primer tümördeki tümör hücrelerinin PSNS nöroblastı soyunun ve tüm metastatik bölgeleri doğruladı (Şekil 2H-M).
Tümör metastatik yayılımının hızlandırılmasında MYCN ve LMO1 arasındaki sinerjinin altında kalan mekanizmaları daha iyi anlamak amacıyla, tümör hücresinde yer alan genlerden oluşan bir panelin hücre dışı matris etkileşimine kadar olan ekspresyon seviyelerinin balık tümörlerinde hem MYCN hem de LMO113'ün aşırı ekspresyonu ile önemli ölçüde yükseldiği keşfedilmiştir. Hücre dışı matrisin, gelişmiş tümör yayılmasına veya göçüne yol açan LMO1-overexpressing tümörlerindeki değiştirilmiş gen ekspresyonundan gerçekten etkilenip etkilenmediğini incelemek için, yalnızca MYCN ve MYCN'den parafin bölümleri; LMO1 tümörleri kollajen birikimini ve hücre dışı matris (ECM) sertliğini değerlendirmek için kollajen lifleri için oldukça seçici bir leke olan Picrosirius kırmızısı (PSR) ile boyandı26,27. Şekil 3A-E'de gösterildiği gibi, MYCN'de bulunan PSR lekeli kolajen liflerinin önemli ölçüde artmış miktarları ve artan kalınlığı vardı; LMO1 tümörleri, tümörlerle karşılaştırıldığında sadece MYCN'yi ifade eder. Birlikte, bu sonuçlar LMO1'in aşırı ifadesinin tümör ECM'sini sertliğini artırmak için yeniden şekillendirebileceğini ve bu nedenle tümör hücresi yayılmasını kolaylaştırabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: MYCN ve LMO1 transgenik zebra balığı hatlarının üremesinden elde edilen yavrular üzerinde tümör tarama tahlilinin illüstrasyonu. (A) Nöroblastom çalışması için MYCN ve/veya LMO1-overexpressing stabil transgenik balıkların tasnif ve tümör taramasının şematik illüstrasyonu. Üst paneller: EGFP-MYCN+ embriyolarının 1 günlük postfertilizasyonda (dpf) temsili resimleri (solda dorsal görünüm ve sağda yanal görünüm). Alt paneller: 3 dpf'de mCherry-LMO1+ embriyolarının temsili resimleri (solda yanal görünüm ve sağda ventral görünüm). AAC, kemerle ilişkili katekolaminerjik nöronlar; CA, kranial gangliyon; Ve MO, medulla oblongata. Ölçek çubuğu, 100 μm. LMO1 ve MYCN'nin BioRender.com (B) Coexpression ile oluşturulan nöroblastom metastazını teşvik eder. Sol: 36 aylıkken SADECE MYCN'yi (MYCN) EGFP eksprese edici tümör (beyaz ok) ile aşırı ifade eden transjenik balıklar. Sağ: Hem MYCN hem de LMO1'i (MYCN; LMO1) birincil bölgede mCherry pozitif tümör kitlesi (IRG, beyaz ok) ve 36 aylıkken birden fazla metastatik bölge (katı ok uçları) ile. Ölçek çubuğu, 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MYCN ve LMO1'in birlikte ifade edilmesi, transgenik zebra balığı modelinde nöroblastom uzak metastazlarını teşvik eder. (A-G) MYCN'nin H&E-lekeli sagittal bölümleri ; LMO1 transgenik balık 6 aylıkken. (H-M) MYCN'nin immünohistokimyasal analizlerinin büyütülmüş görüşleri ; Tirozin hidroksilaz (TH) antikoru kullanılarak sagittal doku bölümlerinde LMO1 transgenik balık. Beyaz kutu, B ve H panellerinde büyütülmüş görünümlere sahip interrenal bezi (b, h) özetler. Yayılan tümör hücreleri böbrek iliğinde (c, i, C ve ben düz siyah ok uçlu), gözün sklerasında (siyah çizgili ve beyaz dolgulu açık oklarla d, j, D ve J ), solungaçta (siyah çizgili ve beyaz dolgulu açık ok uçlu E, k, E ve K ), dalakta (düz siyah oklarla f, l, F ve L ) bulundu. ve kalp odası (siyah anahatlı ve beyaz dolgulu çift ok uçlu G ve M ). Ölçek çubukları, 100 μm (A) ve 50 μm (B-M). Bu rakam Nöroblastom Başlatma ve Metastaz'ı Teşvik Etmek için MYCN ile Sinerjiye Neden Olan Zhu, S. ve ark. LMO1'den değiştirilmiştir. Kanser Hücresi. 32, 310-323 (2017)13. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Artan LMO1 ekspresyonu, zebra balığı modellerinde tümör hücresinin yayılmasını kolaylaştıran kollajen birikimini ve EKM sertliğini teşvik eder. (A-D) Picrosirius kırmızısı (PSR) tarafından sadece MYCN (A,B) veya MYCN'de lekelenmiş kollajen liflerinin temsili ışık mikroskopi görüntüleri; LMO1 (C,D) transgenik zebra balığı. (B) ve (D), PSR pozitif kollajen liflerini belirtmek için sırasıyla oklar (A ve B) ve ok uçları (C ve D) kullanılarak (A) ve (C) kutulu alanlarından büyütüldü. Ölçek çubukları, 100 μm (A ve C) ve 50 μm (B ve D). (E) PSR lekeli bölgelerin sadece MYCN veya MYCN tümör bölümlerinde nicelleştirilmesi; LMO1 transgenik balık. Sonuçlar sadece MYCN tümörlerinde PSR lekeli bölgelerin ortalamasına göre normalleştirildi. İstatistikler, yalnızca üç MYCN veya üç MYCN'nin ortalama ± SD'si olarak sunar; LMO1 tümörleri; p = 0.02 iki kuyruklu t testi ile. Bu rakam Nöroblastom Başlatma ve Metastaz'ı Teşvik Etmek için MYCN ile Sinerjiye Neden Olan Zhu, S. ve ark. LMO1'den değiştirilmiştir. Kanser Hücresi. 32, 310-323 (2017)13. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı, son birkaç on yıldır, özellikle kanser araştırmalarında, bakım kolaylığı, sağlam üremesi ve in vivo görüntüleme için açık avantajları gibi bariz nedenlerden dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır1,28. Zebra balığı modeli, büyük ölçekli genetik çalışmalar için sıçanlar ve fareler gibi memeli model organizmaları iyi tamamlayan dış döllenmeleri ve gelişimleri nedeniyle embriyonik olarak kolayca manipüle edilebilir1,2,3. Ayrıca, zebra balığı genomun insan genomuna üst düzey benzerlikleri vardır. Zebra balığı genomunun ayrıntılı ek açıklamalarını insan referans genomu ile karşılaştırarak, insan genlerinin yaklaşık% 70'inin zebra balığı orthologue29 elde ettiği gösterilmiştir. Buna ek olarak, zebra balıklarının araştırmadaki diğer kullanımları, bireyselleştirilmiş kanser tedavisi için ilaç keşfine ve hasta avatarlarına genişletildi30,31. Birikmiş çalışmalar, zebra balıklarında indüklenen tümörlerin histolojik ve moleküler düzeydeki insan tümörlerine benzediğini ve bu tümör başlatma, ilerleme ve heterojenliğin diseksiyonunda yardımcı olabileceğini göstermiştir32,33. Zebra balığı birlikte, metastazları incelemek ve hastalık patogenezinde yer alan olası onkojenik yolları aydınlatmak için kullanılabilecek değerli bir hayvan modeli olarak muazzam bir potansiyel göstermektedir.
Hem LMO1 hem de MYCN'nin aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı modelini kullanarak, NB tümörjenezi ve metastazda bu iki onkogen arasındaki işbirliği açıkça gösterilmiştir. Günümüzde güçlü canlı görüntüleme tekniklerinin kullanılabilirliği ile tümör ekranları iki haftada bir kolayca yapılabiliyor ve metastaz zamanla takip edilebiliyor. Yaygın metastaz, parafin kesitleme ve antikor lekeleme ile de doğrulanabilir. Çarpıcı bir şekilde, MYCN'de tespit edilen metastazlar; LMO1 zebra balığı, kemik iliği, lenf düğümleri, yörünge ve akciğer34,35 gibi yüksek riskli NB vakalarında görülen yaygın metastaz bölgeleriyle iyi ilişkilidir ve zebra balıklarını metastaz çalışması için uygulanabilir ve faydalı bir model olarak daha da destekler.
Ayrıca, nispeten küçük vücut büyüklüğü nedeniyle, tüm zebra balığı tamamen bölümlenebilir, bu da bu modelin bir başka açık avantajıdır ve vücudun diğer bölgelerindeki metastazlarla birlikte birincil tümörün kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir. Tümör bölümlerinin picrosirius kırmızı lekesi, balık tümörlerindeki kollajen ağlarını açıkça vurgulamış ve LMO1 aşırı ifadeli tümörlerde hücre dışı matrisin sertliğinin arttığını göstermektedir. Bu teknik zebra balığına özgü olmasa da, genetiği değiştirilmiş veya tümör hücreleriyle nakledilen zebra balığı embriyoları üzerinde yüksek verimli bileşik tarama ile birlikte uygulanması, tümör hücre metastazında yer alan kritik bir süreç olan hücre dışı matris yeniden şekillendirmeyi hedefleyebilecek etkili bileşiklerin taranmasında yeni bir araç sağlayabilir.
Kararlı transgenik zebra balığı modelleri, aday onkogenlerin in vivo tümör gelişimine katkısını anlamamız için çok faydalıdır, ancak bu çizgileri geliştirmek zor ve zahmetlidir. Kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak uzun bir süre gerektirir, çünkü satır yayılmadan önce birden fazla nesil elde edilmelidir. Ayrıca, bu çizgilerin yayılması sıkıcı olabilir ve stratejik çiftleşme planlarına ihtiyaç duyulabilir. Örneğin, bir MYCN transgenik balığının verimliliği, tümör geliştikten sonra genellikle belirgin bir şekilde azalır ve homozigöz MYCN transgenik balıklar yetişkinliğe kadar iyi hayatta kalamaz. Bu nedenle, MYCN transgenik balık hattını daha iyi korumak için, heterozipöz tümör taşıyan olmayan MYCN transgenik balığın daha genç yaşta WT veya LMO1 transgenik balık hattı gibi genetik olarak tasarlanmış diğer balık hatları ile aşması önerilir. Kararlı transgenik balık hatlarının geliştirilmesi ve sürdürülmesindeki zorlukların üstesinden gelmek için mozaik geçici transgenez, tek bir genin veya gen kombinasyonunun öncelikle enjekte edilen balıklarda tümör başlangıcına ve ilerlemesine katkısını hızlı ve etkili bir şekilde değerlendirmek için alternatif bir yaklaşım olabilir. Ek olarak, birincil enjekte edilen balıklarda transgene entegrasyonunun mozaik deseni, özellikle somatik olayların neden olduğu hastalık patogenezini daha iyi taklit edebilir36.
Bununla birlikte, kanseri incelemek için araştırmalarda kullanılan diğer hayvan modelleri gibi, zebra balığının da dezavantajları vardır. Örneğin, özellikle zebra balığı proteinlerine karşı antikorlar büyük ölçüde az gelişmiş kalır, ancak tirozin hidroksilaz, sinaptophysin ve HuC gibi nöroblastom belirteç genlerine karşı çeşitli antikorlar neyse ki zebra balıklarında iyi çalışmaktadır6,13. Bu sorunla mücadele etmek için, birçok satıcı ürünlerini test etmeye ve zebra balığı proteinleriyle çapraz reaksiyonda antikorlarının potansiyelini tahmin etmeye başladı. Doğrulanmış antikorlar hakkında daha fazla bilgiyi zebra balığı bilgi ağında (ZFIN) da bulabilirsiniz. Bu çabalarla, zebra balığı proteinlerini özel olarak tespit edebilecek daha fazla antikor yakında zebra balığı topluluğunun kullanımına sunulacaktır. Zebra balıklarını NB patogenezinde karmaşık sinyal yollarının etkileşimini parçalamak için genetik bir model olarak kullanmanın bir başka zorluğu da kısmen çoğaltılmış genomudur. Zebra balığının doğal ataları37,38'de meydana gelen bu tür genom çoğaltması, genellikle insanlara birden fazla zebra balığı homologues varyantı yol açabilir. Bu, hayvan modelinde yeni gen işlevlerinin veya benzersiz ifade kalıplarının evrimleşmiş bir kazanıma neden olabilir39. Bu nedenle, tümör baskılamada potansiyel rollere sahip genleri incelerken, potansiyel olarak zaman alıcı ve teknik olarak zorlayıcı bir çaba olabilen tümör baskılama işlevlerini göstermek için çoğaltılan genlerin birden fazla alellerinin aynı anda nakavt edilmesi gerekebilir.
Bununla birlikte, transgenik zebra balığı modeli, tümör metastazının tüm aşamalarını in vivo olarak sadık bir şekilde nüksedebilir ve genetik analiz ve tümör yayılımının gerçek zamanlı görüntülenmesi için net avantajlara sahiptir. Bu nedenle, bu model sistem, tümörün yayılması ve metastaz in vivo çoklustep sürecinin altında bulunan moleküler ve hücresel olayların ne olduğu, NB hücrelerinin primer tümörlerden ne zaman yayılacağı ve tümör mikroçevromunun NB metastazlarına nasıl katkıda bulunduğu gibi alandaki birçok korkutucu soruyu ele almamız için benzersiz bir araç sunmaktadır. Zebra balıklarının ilaç taraması ve testi için sağlamlığı ile balık modeli, metastatik NB'yi önlemek veya tedavi etmek için yeni ajanların ve inhibitörlerin etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir araç sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden R01 CA240323 (S.Z.) hibesi ile desteklendi; Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı'ndan (DoD) W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) hibesi; V Kanser Araştırmaları Vakfı'ndan (S.Z.) V Scholar ödülü ve Mayo Biyomedikal Keşif Merkezi'nden (S.Z.) platform hibesi; ve Mayo Clinic Kanser Merkezi ve Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi'nden (S.Z.) destek almaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
