Summary

Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

Published: May 10, 2021
doi:

Summary

Cet article décrit l’isolement des cellules de valve aortique de souris par un procédé en deux étapes de collagénase. Les cellules valvulaires isolées de la souris sont importantes pour effectuer différents essais, tels que ce test de calcification in vitro, et pour étudier les voies moléculaires menant à la minéralisation de la valve aortique.

Abstract

La calcification des cellules de valve aortique est le cachet de la sténose aortique et est associée à la fibrose de cuspide de valve. Les cellules interstitielles valvulaires (VICs) jouent un rôle important dans le processus de calcification dans la sténose aortique par l’activation de leur programme de dédifférenciation aux cellules osteoblast-comme. Les circuits vit de souris sont un bon outil in vitro pour l’élucidation des voies de signalisation conduisant à la minéralisation de la cellule valvulaire aortique. La méthode décrite ici, utilisée avec succès par ces auteurs, explique comment obtenir des cellules fraîchement isolées. Un procédé en deux étapes de collagénase a été exécuté avec 1 mg/mL et 4.5 mg/mL. La première étape est cruciale pour enlever la couche cellulaire endothéliale et éviter toute contamination. La deuxième incubation de la collagénase consiste à faciliter la migration des CCI du tissu vers la plaque. En outre, un procédé de souillure d’immunofluorescence pour la caractérisation de phénotype des cellules d’isolement de valve de souris est discuté. En outre, l’analyse de calcification a été exécutée in vitro en utilisant le procédé de mesure de réactif de calcium et la souillure rouge d’alizarin. L’utilisation de la culture primaire de cellules de valve de souris est essentielle pour tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin d’inhiber la minéralisation cellulaire in vitro.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est la maladie cardiaque valvulaire la plus répandue dans les populations occidentales, affectant près de 2,5 % des personnes âgées de plus de 65 ans1. Le CAVD affecte plus de six millions d’Américains et est associé à des changements dans les propriétés mécaniques des folioles qui altèrent le flux sanguin normal1,2. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique pour arrêter la progression de la maladie ou pour activer la régression minérale. La seule thérapie efficace pour traiter le CAVD est le remplacement de la valve aortique par chirurgie ou le remplacement de la valve aortique transcathéter3. Il est donc impératif d’étudier les mécanismes moléculaires conduisant à la minéralisation valvulaire pour identifier de nouvelles cibles pharmacologiques. En effet, la sténose aortique non traitée a plusieurs conséquences néfastes telles que le dysfonctionnement du ventricule gauche et l’insuffisance cardiaque4.

La valve aortique se compose de trois couches connues sous le nom de fibrosa, spongiosa, et ventriculaireis, qui contiennent des VICs comme type prédominant de cellules5. La fibrose et le ventriculaire sont recouverts d’une couche de cellules endothéliales vasculaires (VECs)5. Les VECs règlent la perméabilité des cellules inflammatoires ainsi que des signaux paracrines. Une augmentation du stress mécanique peut affecter l’intégrité des VECs et perturber l’homéostasie de la valve aortique, conduisant à une invasion cellulaire inflammatoire6. Les analyses de microscopie électronique de balayage ont montré l’endothélium perturbé dans une valve aortique calcifiée humaine7.

Les analyses histologiques du tissu calcifié indiquent la présence des osteoblasts et des osteoclasts. En outre, la différenciation ostéogénique des CCI a été observée à la fois in vitro et dans le tissu valvulaire humain8. Ce processus est principalement orchestré par le facteur de transcription lié à Runt 2 (Runx2) et les protéines morphogénétiques osseuses (PGO)8,9.

Protocol

REMARQUE: Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du noyau institutionnel et du comité d’utilisation du Mont Sinaï. 1. Préparation avant l’isolement des cellules valvulaires de souris adultes Nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux illustrés à la figure 1A en utilisant 70% d’éthanol v/v et ensuite les autoclaver pendant 30 min. nettoyer l’espace de travail chiru…

Representative Results

Comme les valves aortiques murines mesurent généralement 1 mm de diamètre, au moins trois valves doivent être regroupées pour recueillir un million de cellules viables pour différentes procédures expérimentales. Les différentes étapes du processus d’isolation VIC sont illustrées à la figure 1 et à la figure 2. Comme il est difficile de gratter manuellement le tissu valvulaire, il est préférable d’utiliser le stress de cisaillement créé par l…

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé d’isolement de cellules de valve de souris pour la culture primaire. Trois valves aortiques de souris de 8 semaines ont été mises en commun pour obtenir un nombre proportionné de cellules. De plus, ce protocole décrit la caractérisation du phénotype VIC et l’analyse de minéralisation in vitro. La méthode a été adaptée du protocole précédemment décrit de Mathieu et al.7.

Lors de l’isolem…

Materials

3 mm cutting edge scissors F.S.T 15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate Cell Signaling 4412
Arsenazo-III reagent set POINT SCIENTIFIC C7529-500 a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors F.S.T 14184-09
Calcium hydroxide SIGMA -Aldrich 31219 31219
CD31 Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg) Thermofisher Scientific 17018029
DMEM Tthermofisher 11965092
Extra fine graefe forceps F.S.T 11150-10
FBS Gibco 16000044
Fine forceps F.S.T Dumont
HCl SIGMA-ALDRICH H1758
HEPES 1 M solution STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x Thermofisher Scientific 25030081
Mycozap Lanza VZA-2011 Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x Thermofisher Scientific 10378016
Sodium Pyruvate 100 mM Thermofisher Scientific 11360070
Standard pattern forceps  F.S.T 11000-12
Surgical Scissors – Sharp-Blunt F.S.T 14008-14
Trypsin 0.05% Thermofisher Scientific 25300054
Vimentin abcam

References

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Cite This Article
Bouchareb, R., Lebeche, D. Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro. J. Vis. Exp. (171), e62419, doi:10.3791/62419 (2021).

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