Summary
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.
Abstract
Il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) è una tecnica molecolare potente e ampiamente utilizzata per mappare le posizioni dell'intero genoma dei fattori di trascrizione (TF), dei regolatori della cromatina e delle modifiche istoniche, nonché per rilevare interi genomi per scoprire i modelli di legame TF e le modifiche post-traduzionali degli istoni. Le attività di modifica della cromatina, come la metilazione degli istoni, sono spesso reclutate in specifiche sequenze regolatorie geniche, causando cambiamenti localizzati nelle strutture della cromatina e con conseguenti effetti trascrizionali specifici. L'esplosione di riso è una malattia fungina devastante sul riso in tutto il mondo ed è un sistema modello per studiare l'interazione fungo-pianta. Tuttavia, i meccanismi molecolari nel modo in cui le modificazioni istoniche regolano i loro geni di virulenza in Magnaporthe oryzae rimangono sfuggenti. Più ricercatori devono utilizzare ChIP-seq per studiare come la modificazione epigenetica degli istoni regola i loro geni bersaglio. ChIP-seq è anche ampiamente usato per studiare l'interazione tra proteine e DNA negli animali e nelle piante, ma è meno utilizzato nel campo della patologia vegetale e non è stato ben sviluppato. In questo articolo, descriviamo il processo sperimentale e il metodo operativo di ChIP-seq per identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3) che si lega ai geni bersaglio funzionali in M. oryzae. Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.
Introduction
L'epigenetica è una branca della ricerca genetica che si riferisce al cambiamento ereditario dell'espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica dei geni. Un numero crescente di studi ha dimostrato che la regolazione epigenetica svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo delle cellule eucariotiche, compresa la cromatina che regola e influenza l'espressione genica attraverso il processo dinamico di ripiegamento e assemblaggio in strutture di ordine superiore1,2. Il rimodellamento della cromatina e la modificazione degli istoni covalenti influenzano e regolano la funzione e la struttura della cromatina attraverso la variazione dei polimeri di cromatina, ottenendo così la funzione di regolazione dell'espressionegenica 3,4,5,6. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni includono acetilazione, fosforilazione, metilazione, monoubiquitinazione, sumoilazione e ribosilazione ADP7,8,9. La metilazione dell'istone H3K4, in particolare la trimetilazione, è stata mappata nei siti di inizio della trascrizione in cui è associata alla replicazione della trascrizione, alla ricombinazione, alla riparazione e all'elaborazione dell'RNA negli eucarioti10,11.
La tecnologia ChIP-seq è stata introdotta nel 2007 ed è diventata lo standard sperimentale per l'analisi genome-wide della regolazione trascrizionale e dei meccanismi epigenetici12,13. Questo metodo è adatto a livello di genoma e per ottenere informazioni sull'interazione tra istoni o fattori di trascrizione, compresi i segmenti di DNA delle proteine leganti il DNA. Qualsiasi sequenza di DNA reticolata a proteine di interesse coprecipita come parte del complesso della cromatina. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione vengono utilizzate anche per sequenziare 36-100 bp di DNA, che vengono poi abbinati al genoma bersaglio corrispondente.
Nei funghi fitopatogeni, la ricerca ha recentemente iniziato a studiare come le modificazioni della metilazione degli istoni regolano i loro geni bersaglio nel processo di patogenicità. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato che la regolazione dei geni correlati all'istone metilasi si riflette principalmente nel silenziamento genico e nella catalizzazione della produzione di metaboliti secondari (SM). MoSet1 è la metilasi H3K4 in M. oryzae. Il knockout di questo gene provoca la delezione completa della modifica H3K4me314. Rispetto al ceppo wild-type, l'espressione del gene MoCEL7C nel mutante è inibita nello stato indotto da CMC e nello stato non indotto (glucosio o cellobiosio), l'espressione di MoCEL7C è aumentatadi 15. In Fusarium graminearum,KMT6 può catalizzare la modificazione della metilazione di H3K27me3, regolare il normale sviluppo dei funghi e aiutare a regolare il "genoma criptico" contenente il cluster di geni SM16,17,18,19. Nel 2013, Connolly ha riferito che la metilazione H3K9 e H3K27 regola il processo patogeno dei funghi attraverso metaboliti secondari e fattori effettori che regolano l'inibizione dei geni bersaglio20. In Aspergillus, la modifica degli istoni H3K4me2 e H3K4me3 è correlata all'attivazione genica e svolge un ruolo importante nel controllo della regolazione del livello di cromatina dei cluster genici SM21. In M. oryzae, Tig1 (omologo a Tig1 in lieviti e mammiferi) è un HADC (istone deacetilasi)22. Il knockout del gene Tig1 porta alla completa perdita di patogenicità e capacità di produzione di spore nel mutante nullo. È più sensibile a un ambiente perossigeno, che non può produrre ifeinfettive 22.
L'esplosione di riso causata da M. oryzae. è una delle più gravi malattie del riso nella maggior parte delle aree di coltivazione del riso nel mondo19. A causa del suo processo di infezione rappresentativo, M. oryzae è simile al processo di infezione di molti importanti funghi patogeni. Poiché può facilmente eseguire operazioni di genetica molecolare, il fungo è diventato un organismo modello per lo studio delle interazioni fungo-pianta23. Il blocco di ogni fase del processo di infezione di M. oryzae può causare un'infezione non riuscita. I cambiamenti morfologici durante il processo di infezione sono strettamente regolati dall'intera funzione del genoma e dalla trascrizione genica. Tra questi, le modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni svolgono un ruolo essenziale nella regolazione trascrizionale dei geni funzionali24,25. Tuttavia, finora, sono stati condotti pochi studi sul meccanismo molecolare delle modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni e l'acetilazione degli istoni nella trascrizione dei geni della patogenesi in M. oryzae. Pertanto, l'ulteriore sviluppo del meccanismo di regolazione epigenetica del fungo blasto del riso durante la ricerca sulla rete di regolazione a monte ea valle di questi geni patogeni aiuterà a sviluppare strategie di prevenzione e controllo dell'esplosione del riso.
Con lo sviluppo della genomica funzionale come ChIP-seq, specialmente in epigenetica, questo metodo di acquisizione dati ad alto rendimento ha accelerato la ricerca sui cromosomi. Utilizzando la tecnologia sperimentale ChIP-seq, è possibile identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae e altri funghi filamentosi. Pertanto, questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base del modo in cui le modificazioni epigenetiche regolano i loro geni bersaglio candidati durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale.
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Protocol
1. Preparazione di protoplasti da M. oryzae
- Preparare l'agar farina d'avena-pomodoro (OTA).
- Pesare 30-50 g di farina d'avena e farlo bollire in 800 ml di acqua (ddH2O) per 20 minuti. Filtrare attraverso due strati di garza e prendere il filtrato.
- Raccogli i pomodori maturi e sbucciali. Spremere il succo e filtrare attraverso due strati di garza per raccogliere 150 ml di succo filtrato.
- Mescolare accuratamente tutto il succo di pomodoro e il filtrato d'avena preparato e aggiungere ddH2O fino a 1000 ml.
- Aggiungere 250 ml di OTA e 2,5 g di polvere di agar in un pallone conico da 500 ml e autoclave per 20 minuti. Conservare a 25 °C.
- Versare 25 ml di OTA autoclavata in una piastra di Petri di vetro 5 cm x 5 cm. Prepara 10 di queste piastre di Petri in totale. Dopo che l'OTA si è solidificata sulle piastre di Petri, conservare le piastre a testa in giù a 25 °C.
- Utilizzare uno stuzzicadenti sterilizzato per scavare un piccolo pezzo di micelio da M. oryzae (il ceppo wild-type P131, ceppi knockout Δmobre2, Δmospp1 e Δmoswd2) e metterli sui piatti OTA preparati. Coltivateli per 4-6 giorni a 28 °C in condizioni di luce.
NOTA: capovolgere la capsula di Petri per prevenire l'inquinamento. - Aggiungere 1000 μL di liquido Complete Medium (CM) (0,6% estratto di lievito, 0,3% idrolizzato enzimatico di caseina, 0,3% idrolizzato acido di caseina, 1% glucosio) alle stoviglie OTA utilizzando una pipetta da 1000 μL.
NOTA: Le ife sono cresciute sui piatti OTA per 4-6 giorni. - Raschiare i miceli del ceppo wild-type e del ceppo knockout con un ciclo di inoculazione.
- Raccogliere i detriti miceli e trasferirli in 250 ml di liquido Complete Medium (CM).
- Far crescere i detriti fungini in un pallone triangolare a 28 °C per 36 ore con agitazione a 150 giri/min.
- Utilizzare un imbuto per filtrare e raccogliere le ife fungine.
- Lavare le ife fungine con 500 ml di soluzione di NaCl da 0,7 M.
- Raccogliere il micelio fungino e pesarlo.
NOTA: Il micelio non deve essere asciugato prima della pesatura. - Aggiungere ~ 1 mL di soluzione di permeazione enzimatica di lisi per 1 g di micelio fungino.
- Preparare la soluzione di permeazione enzimatica di lisi da 20 mg/mL sciogliendo l'enzima di lisi da Trichoderma harzianum in 0,7 M NaCl.
- Posizionare le ife per la lisi a 28 °C per 3-4 ore con agitazione a 150 giri/min.
- Lavare le ife lisi con 50 mL di soluzione di NaCl da 0,7 M.
- Raccogliere i protoplasti e la centrifuga per 15 min a 2.000 x g e 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, scartare accuratamente il surnatante. Ripresa dei protoplasti in 20 mL di tampone NaCI da 0,7 M a 4 °C.
2. Reticolazione in vivo e sonicazione
- Aggiungere 55 μL di formaldeide al 37% (aggiungere formaldeide goccia a goccia fino a quando la concentrazione finale è dell'1%) a 2 mL di tampone NaCI contenente protoplasto per la reticolazione.
- Incubare i protoplasti a 25 °C per 10 min.
- Aggiungere 20 μL di 10x glicina a ciascun tubo per estinguere la formaldeide non reatta.
- Ruotare per mescolare e incubare a 25 °C per 5 min.
- Centrifuga per 15 min a 2.000 x g e 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, scartare accuratamente il surnatante. Ripresa del pellet in 1 mL di soluzione NaCI da 0,7 M.
- Centrifuga per 10 min a 2.000 x g e 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, scartare accuratamente il surnatante. Rinsoprire il pellet in 750 μL di tampone RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS e inibitori della proteasi).
- Aggiungere 37,5 μL di inibitore della proteasi 20x.
- Trasferire i protoplasti dalla fase precedente a un tubo centrifugo da 1,5 ml.
- Eseguire la sonicazione (25% W, uscita 3 s, stop 5 s, 4 °C) immediatamente con un sonicatore per circa 10 min. Lo scopo di questo passaggio è quello di sonicare il lisisato reticolato per un periodo di tempo per determinare le migliori condizioni.
NOTA: Il lisiato può essere congelato a -80 °C in questa fase. - Se sono già state determinate le condizioni ottimali per la sonicazione, procedere al passaggio successivo.
- Se lo si desidera, rimuovere 5 μL di protoplasti per l'analisi del gel di agarose (DNA non segnato).
- Tagliare la cromatina mediante sonicazione con un omogeneizzatore ad ultrasuoni per 8 min (25% W, uscita 3 s, stop 5 s, 4 °C).
- Dopo che il campione è stato rotto ad ultrasuoni, eseguì una parte del campione come "input".. L'input non esegue l'esperimento ChIP e contiene tutto il DNA e le proteine rilasciate dopo che il campione è stato sonicato.
- Dopo la sonicazione, eseguire un'elettroforesi su gel di agarose all'1% per analizzare la lunghezza dei frammenti di DNA.
NOTA: I risultati dell'elettroforesi su gel di acarosio mostrano che la lunghezza del frammento di DNA è di 200-500 bp (Figura 4). - Posizionare il tubo sonicato sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.
- Centrifuga per 10 min a 10.000 x g e 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante centrifugato in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 mL e conservarlo a -80 °C per un uso successivo. La soluzione di cromatina ottenuta in questa fase può essere utilizzata per ip successivi.
- Prima di eseguire l'esperimento IP, diluire ogni campione di cromatina in un rapporto di 1:10 con 1x tampone RIPA (ad esempio, aggiungere 10 μL di campione di cromatina a 1 μL di tampone 1×ripA).
3. IP della proteina/DNA reticolata
- Pipettare 50 μL di perle proteiche superparamagnetiche in un tubo centrifugo da 2 mL. Posizionare i tubi su un supporto magnetico. Lascia precipitare le pere magnetiche. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di 1 tampone RIPA (pre-raffreddato su ghiaccio) al tubo e lavare tre volte le perle proteiche superparamagnetiche. Dopo il lavaggio, posizionare i tubi su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 μL di 1x tampone RIPA a ciascun tubo.
- Aggiungere 300 μL di campione di chormatina (sono state utilizzate 2 x10 7 cellule), 100 μL di perle proteiche superparamagnetiche e 4 μL di anticorpo H3K4me3 al tubo.
- Utilizzare campioni con Mouse IgG come controllo negativo.
NOTA: le IgG di topo utilizzate in questo protocollo contengono 0,01 M tampone fosfato e 0,15 M NaCl e rimarranno congelate al di sotto di 20 °C (vedere Tabella dei materiali). - Dopo aver mescolato bene, posizionare i campioni su uno shaker rotativo e incubare durante la notte a 4 °C, 30 x g.
NOTA: Potrebbe essere possibile ridurre il tempo di incubazione dell'immunoprecipitazione (IP). Il tempo di incubazione dipende da diversi fattori (ad esempio, l'anticorpo, il bersaglio genico, il tipo di cellula, ecc.) e dovrà essere testato empiricamente.
4. Raccolta e risciacquo dei prodotti IP
- Pellet le perle proteiche superparamagnetiche posizionandole su un supporto magnetico. Aspirare e scartare il surnatante.
- Lavare il complesso perla-anticorpo/cromatina della proteina superparamagnetica risospendo le perle in 1 mL di 1x tampone RIPA.
- Risciacquare il tubo su uno shaker rotativo per 5 minuti e rimuovere il surnatante a 30 x g.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio immuno complesso a basso contenuto di sale (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 e 150 mM NaCl).
- Risciacquare il tubo su uno shaker rotativo per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio immuno complesso ad alto contenuto salino (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 e 500 mM NaCl) al tubo centrifugo.
- Posizionare il tubo su uno shaker rotante per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risciacquare con 1 mL di LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% acido desossicolico, 1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl pH 8,1) nel tubo centrifuga.
- Posizionare il tubo su uno shaker rotante per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risciacquare nuovamente la provetta con 1 mL di tampone LiCI da 0,25 M, rimuovere il surnatante con una pipetta e quindi scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di tampone TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Posizionare il tubo su uno shaker rotante per 5 minuti a 30 x g.
- Lavare nuovamente il tubo con un tampone TE da 1 ml e rimuovere il surnatante con una pipetta.
- Raccogli le pere.
5. Eluizione di complessi proteina/DNA
- Preparare il tampone di eluizione (10 μL di SDS al 20%, 20 μL di 1 M NaHCO3,170 μL di H2O distillato sterile) per tutti i tubi IP e di ingresso.
- Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione a ciascun tubo della centrifuga.
- Eluizione a 65 °C per 15 min.
- Centrifugare per 1 minuto a 10.000 x g e 4 °C e raccogliere il surnatante in nuovi tubi centrifuga.
- Ripetere i passaggi 5.2 - 5.4 e combinare gli eluati. Aggiungere 190 μL di tampone di eluizione ai 10 μL del DNA in ingresso. (volume totale = 200 μL).
6. Reticolazione inversa di complessi proteina/DNA
- Aggiungere 8 μL di 5 M NaCl a tutti i tubi e incubare a 65 °C per 4-5 ore o durante la notte per invertire i collegamenti incrociati DNA-proteina.
NOTA: dopo questo passaggio, conservare i campioni a -20 °C e continuare il protocollo il giorno seguente, se necessario. - Aggiungere 1 μL di RNasi A e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 4 μL di proteinasi K (disciolta in H2O a 20 mg/mL e conservata a -20 °C) in ciascun tubo e incubare a 45 °C per 1-2 ore.
7. Purificazione e recupero del DNA
- Aggiungere 550 μL di miscela fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (rapporto 25:24:1) al tubo della centrifuga.
- Vortice completo della miscela per 1 min.
- Centrifugare per 15 min a 10.000 x g e aspirare il surnatante.
- Trasferire il surnatante estratto dalla fase precedente in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 1/10 di volume di soluzione di acetato di sodio 3 M, 2,5 volumi di etanolo assoluto e 3 μL di glicogeno (20 mg/mL) al tubo.
- Mettere il campione in frigorifero a -20 °C durante la notte per le precipitazioni.
- Centrifuga per 15 min a 10.000 x g e 4 °C.
- Scartare il surnatante dopo la centrifugazione. Lavare il pellet tre volte con 1 ml di etanolo al 75% (deve essere preparato fresco) a 10.000 x g.
- Posizionare il precipitato lavato su una panca pulita per lasciare asciugare l'alcol.
- Aggiungere 50 μL di H2O deionizzato sterile per sciogliere sufficientemente il precipitato.
- Ligate l'adattatore di sequenziamento al frammento di DNA e utilizzate una piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento per sequenziare il DNA.
8. Riparazione del DNA e costruzione della libreria Solexa
- Riparare le estremità del DNA per generare DNA smussato utilizzando un kit di riparazione finale del DNA (1-34 μL di DNA, 5 μL di tampone di riparazione finale 10x, 5 μL di 2,5 mM ciascuno dNTP, 5 μL di ATP 10 mM, 1 μL di miscela enzimatica end-repair e H2O per regolare il volume di reazione a 49 μL).
- Utilizzare un kit di purificazione PCR o fenolo: estrazione del cloroformio per purificare il DNA. Eluire o risusciere il DNA in 30 μL di 1x TE pH 7,4.
- Aggiungere "A" alle estremità 3' (30 μL di DNA dallo step 2, 2 μL di H2O, 5 μL di 10x tampone Taq, 10 μL di 1 mM dATP e 3 μL di Taq DNA polimerasi). Aggiungere i reagenti in un tubo centrifugo PCR da 0,2 ml, mescolare bene e reagire in una macchina PCR a 72 °C per 10 minuti.
- Eseguire la legatura del linker mescolando 10 μL di DNA, 9,9 μL di H2O, 2,5 μL di tampone T4 DNA ligasi, 0,1 μL di oligo mix adattatore e 2,5 μL di T4 DNA ligasi. Aggiungere i reagenti in un tubo centrifugo PCR da 0,2 ml e mescolare bene. Incubarli a 16 °C per 4 ore.
- Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore. Elute con 20-25 μL di tampone di eluizione.
- Prima di stabilire la libreria del DNA, identificare la concentrazione del DNA purificato per confermarne l'utilizzo per i successivi esperimenti di sequenziamento.
- Rileva la concentrazione di DNA usando un fluorometro. Dopo aver sciolto il campione su ghiaccio, mescolarlo accuratamente e centrifugare per 30 s a 1000 x g e 4 °C. Quindi prendere una quantità appropriata di campione e misurarla in un fluorometro con una lunghezza d'onda di 260 nm.
- Posizionare campioni di DNA con qualità e concentrazione qualificate sulla piattaforma di sequenziamento Illumina per il sequenziamento.
- Prima del sequenziamento, amplificare il DNA utilizzando primer PCR, PE1.0 e PE2.0, e 2x master mix ad alta fedeltà (10,5 μL di DNA, 12,5 μL di 2x mix master ad alta fedeltà, 1 μL di primer PCR PE1.0 e 1 μL di primer PCR PE2.0). Aggiungere i reagenti in un tubo centrifugo PCR da 0,2 ml e mescolare bene.
- Eseguire la reazione PCR nella macchina PCR: predenaturazione a 95 °C per 2 min; poi 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura a 60 °C per 15 s, estensione a 72 °C per 5 s; un'estensione finale a 72 °C per 5 min. Infine, incubare la reazione a 4 °C.
- Utilizzare il DNA per la generazione di cluster ed eseguire il sequenziamento per sintesi su un Illumina Hiseq 2000.
NOTA: in questo protocollo, le celle di flusso Illumina sono state utilizzate per la generazione di cluster. Il sequenziamento per sintesi è stato eseguito su un analizzatore del genoma Illumina seguendo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
L'intero diagramma di flusso del metodo ChIP-seq è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti ChIP-seq sono stati eseguiti utilizzando anticorpi contro H3K4me3 nel ceppo wild-type P131 e tre ceppi mutanti nulli privi di gene mobre2, mospp1e moswd2 per verificare l'intero profilo genome-wide della distribuzione dell'istone H3K4me3 in M. oryzae. I protoplasti del ceppo wild-type, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, sono stati preparati e sonicati al 25% W, uscita 3 s, stop 5 s, a 4 °C. Inoltre, la cromatina è stata immunopurificata con l'anticorpo H3K4me3 e la proteina Dynabeads A/G. Successivamente, i frammenti di DNA sono stati estratti utilizzando il metodo fenolo-cloroformio per costruire una libreria di sequenziamento e sequenziati con singole estremità su una piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento.
I risultati rappresentativi dei ceppi wild-type, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 con metodo ChIP-seq utilizzando l'anticorpo H3K4me3 sono mostrati nella Figura 2. I segnali H3K4me3 dei mutanti di delezione Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 sono stati significativamente ridotti nelle sue regioni target funzionali. Come mostrato nella Figura 2,alcuni geni bersaglio candidati selezionati, tra cui MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 e MGG_04235, sono stati mappati per la distribuzione H3K4me3. Rispetto al ceppo wild-type P131, i segnali delle letture arricchite H3K4me3-ChIP-seq nei mutanti di delezione Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 sono stati in gran parte ridotti (Figura 2)26. Questi risultati suggeriscono che la modifica H3K4me3 svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica bersaglio in M. oryzae.
Figura 1. Diagramma di flusso del metodo ChIP-seq in M. oryzae. (A) Il DNA genomico di M. oryzae è statoreticolato con l'1% di formaldeide. (B) Successivamente sono state ottenute cellule fungine blasti di Lysed, DNA rotto, DNA libero e DNA legante gli istoni. (C) frammenti di DNA legati agli istoni e sono stati estratti mediante legame specifico all'anticorpo H3K4me3. (D) Attraverso la reticolazione inversa, il DNA purificato ha successivamente ottenuto frammenti di DNA modificati dagli istoni H3K4me3. (E-F) I frammenti di DNA sono stati sequenziati, i risultati del sequenziamento sono stati confrontati e le sequenze sono state identificate nel gruppo DNA M. oryzae. (G) Sono stati recuperati geni e loci specifici degli istoni H3K4me3 in M. oryzae. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. I mutanti di delezione Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 hanno ridotto significativamente i profili H3K4me3 nelle loro regioni target. La distribuzione H3K4me3-ChIP-seq dei picchi arricchiti attorno alle regioni codificanti dei geni sovrapposti nei mutanti di delezione Δmobre2,Δmospp1e Δmoswd2 viene decresased rispetto al ceppo wild-type nei geni MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 e MGG_0423526. Il numero in WT (input) etichettato come [0-2074] significa che i risultati di ChIP nell'intervallo del DNA genomico [0-2074]. [0-2074] si riferisce a 0-2074bp del cromosoma 6.La figura mostra una selezione casuale dei risultati del sequenziamento, che rappresenta solo la distribuzione del DNA sul cromosoma 6. I risultati completi del sequenziamento sono stati presentati a Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ accession 649321) 26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero di serie | Nome di esempio | Numero di serie del campione | Numero di tubi | Totale (μg) | Distribuzione dei frammenti | Tipo di database | Osservazioni | ||||
| 1 | immissione | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Il picco principale è inferiore a 100bp, ma c'è distribuzione del DNA tra 100bp-500bp | ChIP-seq | Il frammento è troppo piccolo | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Immissione | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Il picco principale è inferiore a 100bp, ma c'è distribuzione del DNA tra 100bp-500bp | ChIP-seq | Il frammento è troppo piccolo | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | ingresso Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Il picco principale è inferiore a 100bp, ma c'è distribuzione del DNA tra 100bp-500bp | ChIP-seq | Il frammento è troppo piccolo | ||||
| 4 | ingresso Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Il picco principale è inferiore a 100bp, ma c'è distribuzione del DNA tra 100bp-500bp | ChIP-seq | Il frammento è troppo piccolo | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Il picco principale è compreso tra 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Il picco principale è compreso tra 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Il picco principale è compreso tra 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Il picco principale è compreso tra 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabella 1. La quantità totale di DNA in questo esperimento. La quantità totale di input P131(2) è 2.7948 μg, la quantità totale di Δmobre2(3) (input) è 2.4748 μg, la quantità totale di Δmospp1(4) (input) è 3.22 μg, la quantità totale di Δmoswd2 (5) (input) è 3.97 μg e la quantità totale di P131(2) è 0.0735 μg, la quantità totale di Δmobre2(3) è 0.0491μg, la quantità totale di Δmospp1(4) è 0,0288 μg, la quantità totale di Δmoswd2(5) è 0,0527 μg.
Figura 3. Rilevazione elettroforesi del DNA dopo ultrasuoni. Dopo la sonicazione ad ultrasuoni, il DNA viene sottoposto a un esperimento di gel di agarose all'1% per analizzare la lunghezza dei frammenti di DNA. La lunghezza del frammento di DNA sonicato è da 200-500 bp e questi frammenti di DNA possono essere utilizzati per i seguenti passaggi di ChIP-seq. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Traccia bioanalizzatore di campioni input e ChIP. La figura mostra la distribuzione dei frammenti di ciascun campione, dove l'ascissa rappresenta la dimensione del frammento e l'ordinata rappresenta la dimensione del picco. I campioni in esecuzione sul bioanalizzatore sono l'ingresso P131(2), Δmobre2(3) (ingresso), Δmospp1(4) (ingresso), Δmoswd2(5) (ingresso), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Tra questi, la distribuzione di ingresso P131 (2), Δmobre2(3) (ingresso), Δmospp1(4) (ingresso), Δmoswd2(5) (ingresso) mostra che il picco principale è inferiore a 100 bp, ma c'è distribuzione del DNA a 100-500 bp. La distribuzione reale di P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) e Δmoswd2(5) è compresa tra 100-500 bp come picco principale26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Recentemente, ChIP-seq è diventato un metodo di analisi genomica ampiamente utilizzato per determinare i siti di legame di TF o siti di arricchimento modificati da istoni specifici. Rispetto alla precedente tecnologia ChIP-seq, la nuova tecnologia ChIP-seq è altamente sensibile e flessibile. I risultati sono forniti in alta risoluzione senza effetti negativi, come il segnale di rumore causato dall'ibridazione non specifica degli acidi nucleici. Sebbene si tratta di un'analisi comune dell'espressione genica, molti metodi computazionali sono stati convalidati e la complessità dei dati ChIP-seq in termini di rumore e variabilità rende questo problema particolarmente difficile da superare per ChIP-seq. In termini di analisi dei dati, gestire e analizzare la grande quantità di dati generati dagli esperimenti ChIP-seq è anche una sfida che deve ancora essere adeguatamente affrontata.
Ci sono diversi passaggi chiave nell'esperimento ChIP-seq. Prima di tutto, la preparazione dei protoplasti è molto importante. È necessario controllare il tempo di collasso in modo da poter raccogliere protoplasti di alta qualità. Anche l'ecografia è molto importante, il tempo degli ultrasuoni dovrebbe essere controllato, troppo lungo o troppo breve non funzionerà. In secondo luogo, la quantità di anticorpi aggiunti dovrebbe essere sufficiente per facilitare l'arricchimento di più frammenti di DNA che si legano alla proteina. Nel verificare la qualità e la quantità di DNA precipitato nell'esperimento ChIP-seq è stato utilizzato il fluorometro Qubit. Agilent 2100 è stato utilizzato per rilevare la concentrazione di massa e la distribuzione dei frammenti del DNA, che fornisce una base per stabilire il campione per i successivi esperimenti di creazione e sequenziamento della biblioteca.
Nel complesso, questo protocollo migliora la comprensione dell'intera distribuzione a livello di genoma delle modificazioni epigenetiche che regolano i geni patogeni durante l'infezione da patogeni. Questo metodo contribuirà a identificare i meccanismi molecolari delle modificazioni epigenetiche e ad identificare nuovi geni bersaglio durante lo sviluppo di funghi e la patogenesi indotta da patogeni in M. oryzae e altri funghi filamentosi.
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Disclosures
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), dallo Special Scientific Research Project della Beijing Agriculture University (YQ201603), dal Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), dal progetto di coltivazione di ricerca scientifica di alto livello di BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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