Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.
Abstract
La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) es una técnica molecular poderosa y ampliamente utilizada para mapear las ubicaciones del genoma completo de los factores de transcripción (TF), los reguladores de cromatina y las modificaciones de histonas, así como para detectar genomas completos para descubrir patrones de unión a TF y modificaciones posttraduccionales de histonas. Las actividades modificadoras de la cromatina, como la metilación de histonas, a menudo se reclutan para secuencias reguladoras de genes específicas, causando cambios localizados en las estructuras de la cromatina y dando lugar a efectos transcripcionales específicos. La explosión del arroz es una enfermedad fúngica devastadora en el arroz en todo el mundo y es un sistema modelo para estudiar la interacción hongo-planta. Sin embargo, los mecanismos moleculares en la forma en que las modificaciones de histonas regulan sus genes de virulencia en Magnaporthe oryzae siguen siendo esquivos. Más investigadores necesitan usar ChIP-seq para estudiar cómo la modificación epigenética de histonas regula sus genes objetivo. ChIP-seq también se utiliza ampliamente para estudiar la interacción entre la proteína y el ADN en animales y plantas, pero es menos utilizado en el campo de la fitopatología y no ha sido bien desarrollado. En este artículo, describimos el proceso experimental y el método de operación de ChIP-seq para identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3) que se une a los genes diana funcionales en M. oryzae. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.
Introduction
La epigenética es una rama de la investigación genética que se refiere al cambio heredable de la expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos de los genes. Un número creciente de estudios han demostrado que la regulación epigenética juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las células eucariotas, incluida la cromatina que regula y afecta la expresión génica a través del proceso dinámico de plegamiento y ensamblaje en estructuras de orden superior1,2. La remodelación de la cromatina y la modificación de las histonas covalentes afectan y regulan la función y estructura de la cromatina a través de la variación de los polímeros de cromatina, logrando así la función de regular la expresióngénica 3,4,5,6. Las modificaciones posttraduccionales de la histona incluyen acetilación, fosforilación, metilación, monoubiquitinación, sumoilación y ribosilación ADP7,8,9. La metilación de la histona H3K4, particularmente la trimetilación, se ha mapeado a los sitios de inicio de la transcripción donde se asocia con la replicación de la transcripción, la recombinación, la reparación y el procesamiento de ARN en eucariotas10,11.
La tecnología ChIP-seq se introdujo en 2007 y se ha convertido en el estándar experimental para el análisis de todo el genoma de la regulación transcripcional y los mecanismos epigenéticos12,13. Este método es adecuado a escala de todo el genoma y para obtener información de interacción de histonas o factores de transcripción, incluidos los segmentos de ADN de las proteínas de unión al ADN. Cualquier secuencia de ADN entrecruzada a proteínas de interés coprecipitará como parte del complejo de cromatina. Las técnicas de secuenciación de nueva generación también se utilizan para secuenciar 36-100 pb de ADN, que luego se emparejan con el genoma objetivo correspondiente.
En hongos fitopatógenos, la investigación ha comenzado recientemente a estudiar cómo las modificaciones de metilación de histonas regulan sus genes diana en el proceso de patogenicidad. Algunos estudios previos demostraron que la regulación de los genes relacionados con la histona metilasa se refleja principalmente en el silenciamiento génico y la catalización de la producción de metabolitos secundarios (SM). MoSet1 es la H3K4 metilasa en M. oryzae. La eliminación de este gen da como resultado la eliminación completa de la modificación H3K4me314. En comparación con la cepa de tipo salvaje, la expresión del gen MoCEL7C en el mutante se inhibe en el estado inducido por CMC y en el estado no inducido (glucosa o celobiosa), la expresión de MoCEL7C aumentó15. En Fusarium graminearum,KMT6 puede catalizar la modificación de la metilación de H3K27me3, regular el desarrollo normal de hongos y ayudar a regular el "genoma críptico" que contiene el grupo de genes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly informó que la metilación de H3K9 y H3K27 regula el proceso patogénico de los hongos a través de metabolitos secundarios y factores efectores que regulan la inhibición de los genes diana20. En Aspergillus,la modificación de las histonas H3K4me2 y H3K4me3 está relacionada con la activación génica y juega un papel importante en el control de la regulación del nivel de cromatina de los grupos de genes SM21. En M. oryzae,Tig1 (homólogo a Tig1 en levaduras y mamíferos) es un HADC (histona desacetilasa)22. La eliminación del gen Tig1 conduce a la pérdida completa de la patogenicidad y la capacidad de producción de esporas en el mutante nulo. Es más sensible a un ambiente de peroxígeno, que no puede producir hifas infecciosas22.
La explosión de arroz causada por M. oryzae. es una de las enfermedades más graves del arroz en la mayoría de las zonas de cultivo de arroz en el mundo19. Debido a su proceso de infección representativo, M. oryzae es similar al proceso de infección de muchos hongos patógenos importantes. Como puede llevar a cabo fácilmente operaciones genéticas moleculares, el hongo se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de las interacciones fúngico-planta23. El bloqueo de cada paso del proceso de infección de M. oryzae puede resultar en una infección fallida. Los cambios morfológicos durante el proceso de infección están estrictamente regulados por la función completa del genoma y la transcripción de genes. Entre ellas, las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas juegan un papel esencial en la regulación transcripcional de los genes funcionales24,25. Sin embargo, hasta ahora, se han realizado pocos estudios sobre el mecanismo molecular de las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y la acetilación de histonas en la transcripción de genes de patogénesis en M. oryzae. Por lo tanto, desarrollar aún más el mecanismo de regulación epigenética del hongo de la explosión de arroz mientras se investiga en la red reguladora aguas arriba y aguas abajo de estos genes patógenos relacionados ayudará a desarrollar estrategias de prevención y control de la explosión de arroz.
Con el desarrollo de la genómica funcional como ChIP-seq, especialmente en epigenética, este método de adquisición de datos de alto rendimiento ha acelerado la investigación sobre los cromosomas. Utilizando la tecnología experimental ChIP-seq, se puede identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) en M. oryzae y otros hongos filamentosos. Por lo tanto, este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a cómo las modificaciones epigenéticas regulan sus genes diana candidatos durante la patogénesis fúngica en la patología vegetal.
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Protocol
1. Preparación de protoplastos de M. oryzae
- Preparar el agar avena-tomate (OTA).
- Pesar 30-50 g de avena y hervirla en 800 mL de agua (ddH2O) durante 20 min. Filtre a través de dos capas de gasa y tome el filtrado.
- Recoge los tomates maduros y pélalos. Exprima el jugo y filtre a través de dos capas de gasa para recolectar 150 ml del jugo filtrado.
- Mezclar bien todo el zumo de tomate y el filtrado de avena preparado y añadir ddH2O hasta 1000 mL.
- Añadir 250 ml de OTA y 2,5 g de polvo de agar a un matraz cónico de 500 ml y autoclave durante 20 min. Conservar a 25 °C.
- Vierta 25 ml de la OTA en autoclave en un vaso de 5 cm x 5 cm de placa de Petri. Prepara 10 de estas placas de Petri en total. Después de que la OTA se haya solidificado en las placas de Petri, guarde los platos boca abajo a 25 ° C.
- Use un palillo esterilizado para extraer un pequeño trozo de micelio de M. oryzae (la cepa de tipo salvaje P131, las cepas knockout Δmobre2, Δmospp1 y Δmoswd2)y colóquelos en los platos OTA preparados. Cultivarlos durante 4-6 días a 28 °C en condiciones de luz.
NOTA: Gire la placa de Petri boca abajo para evitar la contaminación. - Agregue 1000 μL de medio completo (CM) líquido (0.6% extracto de levadura, hidrolizado de caseína enzimática al 0.3%, hidrolizado de caseína ácida al 0.3%, glucosa al 1%) a los platos OTA usando una pipeta de 1000 μL.
NOTA: Las hifas crecieron en los platos de la OTA durante 4-6 días. - Raspe el micelio de la cepa de tipo salvaje y la cepa knockout con un lazo de inoculación.
- Recoja los restos de micelio y transfiéralos a 250 ml de medio completo líquido (CM).
- Cultive los restos de hongos en un matraz triangular a 28 °C durante 36 h con agitación a 150 rpm.
- Use un embudo para filtrar y recoger las hifas fúngicas.
- Lavar las hifas fúngicas con 500 ml de solución de NaCl de 0,7 M.
- Recoge el micelio fúngico y pésalo.
NOTA: El micelio no necesita ser secado antes de pesar. - Agregue ~ 1 ml de solución de permeación de la enzima de lisis por 1 g del micelio fúngico.
- Preparar la solución de permeación de la enzima de lisis de 20 mg/ml disolviendo la enzima de lisis de Trichoderma harzianum en 0,7 M de NaCl.
- Coloque las hifas para lisar a 28 °C durante 3-4 h con agitación a 150 rpm.
- Lavar las hifas lisadas con 50 ml de solución de NaCl de 0,7 m.
- Recoger los protoplastos y la centrífuga durante 15 min a 2.000 x g y 4 °C.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend los protoplastos en 20 mL de 0,7 M NaCI tampón a 4 °C.
2. Reticulación y sonicación in vivo
- Añadir 55 μL de formaldehído al 37% (añadir formaldehído gota a gota hasta que la concentración final sea del 1%) a 2 ml de tampón de NaCI que contenga protoplasto para la reticulación.
- Incubar los protoplastos a 25 °C durante 10 min.
- Agregue 20 μL de glicina 10x a cada tubo para apagar el formaldehído no reaccionado.
- Remolino para mezclar e incubar a 25 °C durante 5 min.
- Centrifugadora durante 15 min a 2.000 x g y 4 °C.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend el pellet en 1 mL de solución de NaCI de 0,7 M.
- Centrifugadora durante 10 min a 2.000 x g y 4 °C.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend el pellet en 750 μL de tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS e inhibidores de la proteasa).
- Añadir 37,5 μL de inhibidor de la proteasa 20x.
- Transfiera los protoplastos del paso anterior a un tubo centrífugo de 1,5 ml.
- Realice la sonicación (25% W, salida 3 s, parada 5 s, 4 °C) inmediatamente con un sonicador durante aproximadamente 10 min. El propósito de este paso es sonicar el lisado reticulado durante un período de tiempo para determinar las mejores condiciones.
NOTA: El lisato se puede congelar a -80 °C en este paso. - Si ya se han determinado las condiciones óptimas para la sonicación, continúe con el siguiente paso.
- Si lo desea, retire 5 μL de protoplastos para el análisis en gel de agarosa (ADN no escuchado).
- Corte la cromatina por sonicación con un homogeneizador ultrasónico durante 8 min (25% W, salida 3 s, parada 5 s, 4 °C).
- Después de que la muestra se rompa por ultrasonidos, saque una parte de la muestra como "entrada". La entrada no realiza el experimento ChIP y contiene todo el ADN y la proteína liberados después de que la muestra se sonica.
- Después de la sonicación, ejecute una electroforesis en gel de agarosa al 1% para analizar la longitud de los fragmentos de ADN.
NOTA: Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa muestran que la longitud del fragmento de ADN es de 200-500 pb(Figura 4). - Coloque el tubo sonicado sobre hielo para evitar la degradación de proteínas.
- Centrifugadora durante 10 min a 10.000 x g y 4 °C.
- Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante centrifugado a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml y guárdelo a -80 °C para su uso posterior. La solución de cromatina obtenida en este paso se puede utilizar para IP posterior.
- Antes de realizar el experimento IP, diluya cada muestra de cromatina a una proporción de 1:10 con 1x tampón RIPA (por ejemplo, agregue 10 μL de muestra de cromatina a 1 μL de tampón 1×RIPA).
3. IP de proteína/ADN reticulado
- Pipete 50 μL de perlas de proteína superparamagnética en un tubo centrífugo de 2 ml. Coloque los tubos en un soporte magnético. Deja que las cuentas magnéticas precipiten. Retire el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de tampón RIPA 1x (preenfriado en hielo) al tubo y lave las perlas de proteína superparamagnética tres veces. Después del lavado, coloque los tubos en un soporte magnético y retire el sobrenadante. Añadir 100 μL de 1x tampón RIPA a cada tubo.
- Agregue 300 μL de muestra de chormatina (se utilizaron 2 x10 7 células), 100 μL de perlas de proteína superparamagnética y 4 μL de anticuerpo H3K4me3 al tubo.
- Utilice muestras con IgG de ratón como control negativo.
NOTA: La IgG de ratón utilizada en este protocolo contiene 0,01 M de tampón de fosfato y 0,15 M de NaCl, y permanecerá congelada por debajo de 20 °C (ver Tabla de Materiales). - Después de mezclar bien, coloque las muestras en un agitador rotativo e incube durante la noche a 4 ° C, 30 x g.
NOTA: Puede ser posible reducir el tiempo de incubación de la inmunoprecipitación (IP). El tiempo de incubación depende de diferentes factores (por ejemplo, el anticuerpo, el gen objetivo, el tipo de célula, etc.) y deberá probarse empíricamente.
4. Recogida y enjuague de los productos IP
- Pellet las perlas de proteína superparamagnética colocándolas en un soporte magnético. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Lave el complejo de perlas/cromatina de la proteína superparamagnética resuspiendo las perlas en 1 ml de 1 tampón RIPA.
- Enjuague el tubo en un agitador rotativo durante 5 min y retire el sobrenadante a 30 x g.
- Agregue 1 ml de tampón de lavado de complejo inmune bajo en sal (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 y 150 mM NaCl).
- Enjuague el tubo en un agitador rotativo durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de tampón de lavado de complejo inmune con alto contenido de sal (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 y 500 mM NaCl) al tubo de la centrífuga.
- Coloque el tubo en un agitador giratorio durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
- Enjuague con 1 ml de LiCl (0,25 M de LiCl, 1% de NP-40, 1% de ácido desoxicólico, 1 mM de EDTA y 10 mM de Tris-HCl pH 8,1) en el tubo de la centrífuga.
- Coloque el tubo en un agitador giratorio durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
- Enjuague el tubo de ensayo nuevamente con 1 ml de tampón LiCI de 0.25 M, retire el sobrenadante con una pipeta y luego deseche el sobrenadante.
- Añadir 1 mL de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
- Coloque el tubo en un agitador rotativo durante 5 min a 30 x g.
- Lave el tubo de nuevo con un tampón TE de 1 ml y retire el sobrenadante con una pipeta.
- Recoge las cuentas.
5. Elución de complejos proteína/ADN
- Preparar el tampón de elución (10 μL de SDS al 20%, 20 μL de 1 M NaHCO3,170 μL de H2O destilado estéril) para todos los tubos IP y de entrada.
- Añadir 100 μL de tampón de elución a cada tubo de centrífuga.
- Elución a 65 °C durante 15 min.
- Centrifugar durante 1 min a 10.000 x g y 4 °C y recoger el sobrenadante en nuevos tubos de centrífuga.
- Repita los pasos 5.2 a 5.4 y combine los eluidos. Añadir 190 μL de tampón de elución a los 10 μL del ADN de entrada. (volumen total = 200 μL).
6. Reticulación inversa de complejos proteína/ADN
- Agregue 8 μL de NaCl de 5 M a todos los tubos e incube a 65 ° C durante 4-5 h o durante la noche para revertir los enlaces cruzados ADN-proteína.
NOTA: Después de este paso, almacene las muestras a -20 °C y continúe con el protocolo al día siguiente, si es necesario. - Añadir 1 μL de RNasa A e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Añadir 4 μL de proteinasa K (disuelta en H2O a 20 mg/ml y almacenada a -20 °C) a cada tubo e incubar a 45 °C durante 1-2 h.
7. Purificación y recuperación del ADN
- Añadir 550 μL de mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (proporción de 25:24:1) al tubo de la centrífuga.
- Vórtice completamente la mezcla durante 1 min.
- Centrifugar durante 15 min a 10.000 x g y aspirar el sobrenadante.
- Transfiera el sobrenadante extraído del paso anterior a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml.
- Añadir 1/10 de volumen de solución de acetato de sodio 3 M, 2,5 volúmenes de etanol absoluto y 3 μL de glucógeno (20 mg/ml) al tubo.
- Coloque la muestra en un refrigerador a -20 °C durante la noche para la precipitación.
- Centrifugadora durante 15 min a 10.000 x g y 4 °C.
- Deseche el sobrenadante después de la centrifugación. Lave el pellet tres veces con 1 ml de etanol al 75% (debe prepararse fresco) a 10.000 x g.
- Coloque el precipitado lavado en un banco limpio para dejar que el alcohol se seque.
- Añadir 50 μL de H2O desionizado estéril para disolver suficientemente el precipitado.
- Ligar el adaptador de secuenciación al fragmento de ADN y utilizar una plataforma de secuenciación de alto rendimiento para secuenciar el ADN.
8. Reparación del ADN y construcción de la biblioteca Solexa
- Repare los extremos del ADN para generar ADN romo utilizando un kit de reparación final de ADN (1-34 μL de ADN, 5 μL de tampón de reparación final 10x, 5 μL de 2.5 mM cada dNTP, 5 μL de 10 mM ATP, 1 μL de mezcla de enzimas de reparación final y H2O para ajustar el volumen de reacción a 49 μL).
- Utilice un kit de purificación por PCR o fenol: extracción de cloroformo para purificar el ADN. Eluar o resuspend el ADN en 30 μL de 1x TE pH 7.4.
- Agregue "A" a los extremos 3' (30 μL de ADN del paso 2, 2 μL de H2O, 5 μL de tampón Taq 10x, 10 μL de dATP de 1 mM y 3 μL de ADN polimerasa Taq). Agregue los reactivos a un tubo centrífugo PCR de 0,2 ml, mezcle bien y reaccione en una máquina de PCR a 72 ° C durante 10 min.
- Realizar la ligadura del enlazador mezclando 10 μL de ADN, 9,9 μL de H2O, 2,5 μL de tampón de ligasa de ADN T4, 0,1 μL de oligomezcla adaptadora y 2,5 μL de ADN ligasa T4. Agregue los reactivos a un tubo de centrífuga PCR de 0,2 ml y mezcle bien. Incubarlos a 16 °C durante 4 h.
- Purificar el ADN utilizando un kit de purificación de PCR según protocolo del fabricante. Elute con 20-25 μL de tampón de elución.
- Antes de establecer la biblioteca de ADN, identifique la concentración del ADN purificado para confirmar su uso para los experimentos de secuenciación posteriores.
- Detecte la concentración de ADN utilizando un fluorómetro. Después de derretir la muestra en hielo, mezclarla bien y centrifugar durante 30 s a 1000 x g y 4 °C. Luego tome una cantidad adecuada de muestra y mídala en un fluorómetro con una longitud de onda de 260 nm.
- Coloque muestras de ADN con calidad y concentración calificadas en la plataforma de secuenciación Illumina para secuenciación.
- Antes de la secuenciación, amplifique el ADN utilizando cebadores de PCR, PE1.0 y PE2.0, y 2x mezcla maestra de alta fidelidad (10.5 μL de ADN, 12.5 μL de 2x mezcla maestra de alta fidelidad, 1 μL de imprimación de PCR PE1.0 y 1 μL de imprimación de PCR PE2.0). Agregue los reactivos a un tubo de centrífuga PCR de 0,2 ml y mezcle bien.
- Ejecutar la reacción de PCR en la máquina de PCR: predenaturalización de 95 °C durante 2 min; luego 35 ciclos de desnaturalización de 95 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 15 s, extensión a 72 °C durante 5 s; una extensión final a 72 °C durante 5 min. Finalmente, incubar la reacción a 4 °C.
- Utilice el ADN para la generación de clústeres y realice la secuenciación por síntesis en un Illumina Hiseq 2000.
NOTA: En este protocolo, las células de flujo illumina se utilizaron para la generación de clústeres. La secuenciación por síntesis se realizó en un analizador del genoma de Illumina siguiendo las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Todo el diagrama de flujo del método ChIP-seq se muestra en la Figura 1. Los experimentos ChIP-seq se realizaron utilizando anticuerpos contra H3K4me3 en la cepa de tipo salvaje P131 y tres cepas mutantes nulas que carecían del gen mobre2, mospp1y moswd2 para verificar el perfil completo del genoma completo de la distribución de la histona H3K4me3 en M. oryzae. Los protoplastos de la cepa de tipo salvaje, Δmobre2, Δmospp1y Δmoswd2, se prepararon y sonicaron al 25% W, salida 3 s, parada 5 s, a 4 °C. Además, la cromatina fue inmunopurificada con el anticuerpo H3K4me3 y la proteína Dynabeads A/G. Posteriormente, los fragmentos de ADN se extrajeron utilizando el método de fenol-cloroformo para construir una biblioteca de secuenciación y se secuenciaron con extremos únicos en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento.
Los resultados representativos de las cepas de tipo salvaje, Δmobre2,Δ mospp1y Δmoswd2 con el método ChIP-seq utilizando el anticuerpo H3K4me3 se muestran en la Figura 2. Las señales H3K4me3 de los mutantes de deleción Δmobre2,Δ mospp1y Δmoswd2 disminuyeron significativamente en sus regiones diana funcionales. Como se muestra en la Figura 2,algunos genes diana candidatos seleccionados, incluidos MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 y MGG_04235, se mapearon para la distribución H3K4me3. En comparación con la cepa de tipo salvaje P131, las señales de las lecturas enriquecidas de H3K4me3-ChIP-seq en los mutantes de deleción Δmobre2, Δ mospp1yΔ moswd2 disminuyeron en gran medida (Figura 2)26. Estos resultados sugieren que la modificación H3K4me3 juega un papel importante en la regulación de la expresión génica objetivo en M. oryzae.
Figura 1. El diagrama de flujo del método ChIP-seq en M. oryzae. (A) El ADN genómico de M. oryzae sereticulaba con formaldehído al 1%. (B) Posteriormente se obtuvieron células de hongos blásicos lisados, ADN roto, ADN libre y ADN de unión a histonas. (C) Fragmentos de ADN unidos a histonas y extraídos por unión específica al anticuerpo H3K4me3. (D) A través de la reticulación inversa, el ADN purificado obtuvo posteriormente fragmentos de ADN modificados por histonas H3K4me3. (E-F) Se secuenciaron fragmentos de ADN, se compararon los resultados de la secuenciación y se identificaron secuencias en el grupo de ADN de M. oryzae. (G) Se recuperaron genes específicos y loci de histonas H3K4me3 en M. oryzae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los mutantes de deleción Δmobre2,Δ mospp1yΔ moswd2 disminuyeron significativamente los perfiles H3K4me3 en sus regiones objetivo. La distribución H3K4me3-ChIP-seq de picos enriquecidos alrededor de las regiones codificantes de genes superpuestos en mutantes de deleción Δmobre2,Δmospp1yΔ moswd2 se decresa en comparación con la cepa de tipo salvaje en los genes MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 y MGG_0423526. El número en WT (entrada) etiquetado como [0-2074] significa los resultados de ChIP en el rango de ADN genómico [0-2074]. [0-2074] se refiere a 0-2074bp del cromosoma 6.La figura muestra una selección aleatoria de los resultados de la secuenciación, que solo representa la distribución del ADN en el cromosoma 6. Los resultados completos de la secuenciación se han presentado a Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ accession 649321) 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de serie | Nombre de ejemplo | Número de serie de la muestra | Número de tubos | Total (μg) | Distribución de fragmentos | Tipo de base de datos | Observaciones | ||||
| 1 | entrada | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | El pico principal está por debajo de 100bp, pero hay distribución de ADN entre 100bp-500bp | ChIP-seq | El fragmento es demasiado pequeño | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Entrada | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | El pico principal está por debajo de 100bp, pero hay distribución de ADN entre 100bp-500bp | ChIP-seq | El fragmento es demasiado pequeño | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | entrada Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | El pico principal está por debajo de 100bp, pero hay distribución de ADN entre 100bp-500bp | ChIP-seq | El fragmento es demasiado pequeño | ||||
| 4 | entrada Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | El pico principal está por debajo de 100bp, pero hay distribución de ADN entre 100bp-500bp | ChIP-seq | El fragmento es demasiado pequeño | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | El pico principal está entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | El pico principal está entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | El pico principal está entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | El pico principal está entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabla 1. La cantidad total de ADN en este experimento. La cantidad total de entrada P131(2) es de 2.7948 μg, la cantidad total de Δmobre2(3) (entrada) es 2.4748 μg, la cantidad total de Δmospp1(4) (entrada) es de 3.22 μg, la cantidad total de Δmoswd2 (5) (entrada) es de 3.97 μg, y la cantidad total de P131(2) es de 0.0735 μg, la cantidad total de Δmobre2(3) es de 0.0491μg, la cantidad total de Δmospp1(4) es de 0,0288 μg, la cantidad total de Δmoswd2(5) es de 0,0527 μg.
Figura 3. Detección por electroforesis de ADN después de la ecografía. Después de la sonicación por ultrasonido, el ADN se somete a un experimento de gel de agarosa al 1% para analizar la longitud de los fragmentos de ADN. La longitud del fragmento de ADN sonicado es de 200-500 pb, y estos fragmentos de ADN se pueden utilizar para los siguientes pasos de ChIP-seq. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Traza de bioanalizador de muestras de entrada y ChIP. La figura muestra la distribución de fragmentos de cada muestra, donde la abscisa representa el tamaño del fragmento y la ordenada representa el tamaño máximo. Las muestras que se ejecutan en el bioanalizador son entrada P131(2), Δmobre2(3) (entrada),Δ mospp1(4) (entrada),Δ moswd2(5) (entrada), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Entre ellos, la distribución de la entrada P131(2), Δmobre2(3) (entrada), Δmospp1(4) (entrada), Δmoswd2(5) (entrada) muestra que el pico principal está por debajo de 100 pb, pero hay distribución de ADN a 100-500 pb. La verdadera distribución de P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) y Δmoswd2(5) está entre 100-500 pb como pico principal26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Recientemente, ChIP-seq se ha convertido en un método de análisis genómico ampliamente utilizado para determinar los sitios de unión de TFs o sitios de enriquecimiento modificados por histonas específicas. En comparación con la tecnología ChIP-seq anterior, la nueva tecnología ChIP-seq es altamente sensible y flexible. Los resultados se proporcionan en alta resolución sin efectos negativos, como la señal de ruido causada por la hibridación inespecífico de ácidos nucleicos. Aunque este es un análisis de expresión génica común, se han validado muchos métodos computacionales, y la complejidad de los datos de ChIP-seq en términos de ruido y variabilidad hace que este problema sea particularmente difícil de superar para ChIP-seq. En términos de análisis de datos, la gestión y el análisis de la gran cantidad de datos generados por los experimentos ChIP-seq también es un desafío que aún no se ha abordado adecuadamente.
Hay varios pasos clave en el experimento ChIP-seq. En primer lugar, la preparación de los protoplastos es muy importante. Es necesario controlar el tiempo de colapso para que se puedan recolectar protoplastos de alta calidad. El ultrasonido también es muy importante, el tiempo de ultrasonido debe ser controlado, demasiado largo o demasiado corto no funcionará. En segundo lugar, la cantidad de anticuerpos añadidos debería ser suficiente para facilitar el enriquecimiento de más fragmentos de ADN que se unan a la proteína. Al verificar la calidad y cantidad de ADN precipitado en el experimento ChIP-seq se utilizó qubit fluorómetro. Agilent 2100 se utilizó para detectar la concentración de masa y la distribución de fragmentos de ADN, lo que proporciona una base para determinar si la muestra se puede utilizar para el establecimiento posterior de la biblioteca y los experimentos de secuenciación.
En general, este protocolo mejora la comprensión de la distribución de todo el genoma de las modificaciones epigenéticas que regulan los genes patógenos durante la infección por patógenos. Este método contribuirá a identificar los mecanismos moleculares de las modificaciones epigenéticas e identificar nuevos genes diana durante el desarrollo de hongos y la patogénesis inducida por patógenos en M. oryzae y otros hongos filamentosos.
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Disclosures
Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención no. 31871638), el Proyecto Especial de Investigación Científica de la Universidad de Agricultura de Beijing (YQ201603), el Proyecto Científico del Comité Educativo de Beijing (KM201610020005), el proyecto de cultivo de investigación científica de alto nivel de BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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