Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera genomomfattande fördelning av histonmodifieringar, som kan identifiera nya målgener i patogenesen vid M. oryzae och andra filamentösa svampar.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq) är en kraftfull och allmänt använd molekylär teknik för kartläggning av hela genom platser av transkription faktorer (TFs), kromatin regulatorer och histon modifieringar, samt upptäcka hela genom för att avslöja TF bindande mönster och histon posttranslational modifieringar. Kromatinmodifierande aktiviteter, såsom histonmetylering, rekryteras ofta till specifika genreglerande sekvenser, vilket orsakar lokaliserade förändringar i kromatinstrukturer och resulterar i specifika transkriptionella effekter. Risexplosionen är en förödande svampsjukdom på ris över hela världen och är ett modellsystem för att studera svamp-växtinteraktion. De molekylära mekanismerna i hur histonmodifieringarna reglerar deras virulensgener i Magnaporthe oryzae förblir dock svårfångade. Fler forskare behöver använda ChIP-seq för att studera hur histonepigenetisk modifiering reglerar deras målgener. ChIP-seq används också i stor utsträckning för att studera interaktionen mellan protein och DNA hos djur och växter, men det används mindre inom växtpatologi och har inte utvecklats väl. I detta dokument beskriver vi den experimentella processen och driftmetoden för ChIP-seq för att identifiera genomomfattande fördelning av histonmetylering (såsom H3K4me3) som binder till de funktionella målgenerna i M. oryzae. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera genomomfattande fördelning av histonmodifieringar, som kan identifiera nya målgener i patogenesen vid M. oryzae och andra filamentösa svampar.
Introduction
Epigenetik är en gren av genetisk forskning som hänvisar till den ärftliga förändringen av genuttryck utan att ändra nukleotidsekvensen av gener. Ett ökande antal studier har visat att epigenetisk reglering spelar en viktig roll för tillväxten och utvecklingen av eukaryota celler, inklusive kromatin som reglerar och påverkar genuttryck genom den dynamiska vikningsprocessen och monteringen i högre ordning strukturer1,2. Kromatinombyggnad och kovament histonmodifiering påverkar och reglerar kromatins funktion och struktur genom variationen av kromatinpolymerer, vilket uppnår funktionen att reglera genuttryck3,4,5,6. Posttranslational modifieringar av histon inkluderar acetylering, fosforylering, metylering, monoubiquitination, sumoylering och ADP ribosylation7,8,9. Histone H3K4 metylering, särskilt trimetylering, har mappats till transkription start platser där det är associerat med transkription replikering, rekombination, reparation och RNA bearbetning i eukaryotes10,11.
ChIP-seq-tekniken introducerades 2007 och har blivit den experimentella standarden för genomomfattande analys av transkriptionell reglering och epigenetiskamekanismer 12,13. Denna metod är lämplig i genomomfattande skala och för att erhålla information om interaktion med histon- eller transkriptionsfaktorer, inklusive DNA-segment av DNA-bindande proteiner. Alla DNA-sekvenser som är korslänkade till proteiner av intresse kommer att koprecipitera som en del av kromatinkomplexet. Nya generationens sekvenseringstekniker används också för att sekvensera 36-100 bp DNA, som sedan matchas med motsvarande målgenom.
Inom fytopatiska svampar har forskningen nyligen börjat studera hur stenmethyleringsmodifieringar reglerar deras målgener i patogenicitetsprocessen. Vissa tidigare studier visade att regleringen av histonmetylasrelaterade gener främst återspeglas i gensilencing och katalysering av produktionen av sekundära metaboliter (SM). MoSet1 är H3K4 metylas i M. oryzae. Knockout av denna gen resulterar i fullständig radering av H3K4me3 modifiering14. Jämfört med den vilda stammen hämmas uttrycket av genen MoCEL7C i mutanten i CMC-inducerat tillstånd och i icke-inducerat tillstånd (glukos eller cellobiose), uttrycket av MoCEL7C ökade15. I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysera metyleringsmodifieringen av H3K27me3, reglera den normala utvecklingen av svampar och hjälpa till att reglera det "kryptiska genomet" som innehåller SM-genklustret16,17,18,19. År 2013 rapporterade Connolly att H3K9 och H3K27 metylering reglerar den patogena svampprocessen genom sekundära metaboliter och effektfaktorer som reglerar hämningen avmålgener 20. I Aspergillusär modifieringen av histonerna H3K4me2 och H3K4me3 relaterad till genaktivering och spelar en viktig roll för att kontrollera kromatinnivåregleringen av SM-genkluster21. I M. oryzaeär Tig1 (homologt till Tig1 i jäst och däggdjur) en HADC (histondeacetylas)22. Knockout av Tig1 genen leder till fullständig förlust av patogenicitet och spor produktion förmåga i null mutant. Det är känsligare för en peroxygen miljö, som inte kan producera smittsam hyphae22.
Risexplosionen orsakad av M. oryzae. är en av de allvarligaste rissjukdomarna i de flesta risodlingsområden i världen19. På grund av sin representativa infektionsprocess liknar M. oryzae infektionsprocessen hos många viktiga patogena svampar. Eftersom det lätt kan utföra molekylärgenetiska operationer har svampen blivit en modellorganism för att studera svampväxtinteraktioner23. Blockering av varje steg i infektionsprocessen av M. oryzae kan leda till misslyckad infektion. De morfologiska förändringarna under infektionsprocessen regleras strikt av hela genomfunktionen och genutskriften. Bland dem spelar epigenetiska modifieringar som histonmetylering en viktig roll i transkriptionsregleringen av funktionellagener 24,25. Hittills har dock få studier gjorts på den molekylära mekanismen för epigenetiska modifieringar såsom histon metylering och histon acetylering i transkription av patogenes gener i M. oryzae. Att vidareutveckla den epigenetiska regleringsmekanismen för rissvampen medan forskning i det överordnade och nedströms regleringsnätverket för dessa patogena relaterade gener kommer därför att bidra till att utveckla strategier för förebyggande och kontroll av risblästring.
Med utvecklingen av funktionell genomik som ChIP-seq, särskilt inom epigenetik, har denna datainsamlingsmetod med hög genomströmning påskyndat forskningen om kromosomer. Med hjälp av chIP-seq-experimentell teknik kan den genomomfattande fördelningen av histonmetylering (såsom H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae och andra filamentösa svampar identifieras. Därför kan denna metod hjälpa till att belysa de molekylära mekanismerna bakom hur epigenetiska modifieringar reglerar deras kandidatmålgener under svamppatogenes i växtpatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av protoplaster från M. oryzae
- Förbered havregryns-tomatagar (OTA).
- Väg 30-50 g havregryn och koka den i 800 ml vatten (ddH2O) i 20 min. Filtrera genom två lager gasväv och ta filtratet.
- Plocka mogna tomater och skala dem. Pressa saften och filtrera genom två lager gasväv för att samla 150 ml av den filtrerade saften.
- Blanda all tomatjuice och den beredda havrefilratet noggrant och tillsätt ddH2O upp till 1000 ml.
- Tillsätt 250 ml OTA och 2,5 g agarpulver till en konisk kolv på 500 ml och autoklav i 20 minuter. Förvaras vid 25 °C.
- Häll 25 ml av den autoklaverade OTA i ett glas 5 cm x 5 cm Petri skål. Förbered 10 av dessa petriskålar totalt. När OTA har stelnat på Petri-disken, förvara disken upp och ner vid 25 °C.
- Använd en steriliserad tandpetare för att gräva fram en liten bit mycelium från M. oryzae (den vilda stammen P131, knockoutstammarna Δmobre2, Δmospp1 och Δmoswd2) och placera dem på de beredda OTA-diskarna. Odla dem i 4-6 dagar vid 28 °C under ljusförhållanden.
OBS: Vänd petriskålen upp och ner för att förhindra föroreningar. - Tillsätt 1000 μL flytande Complete Medium (CM) (0,6% jästextrakt, 0,3% enzymatiskt caseinhydrolysat, 0,3% surt casein hydrolysat, 1% glukos) till OTA-disken med en 1000 μL-pipett.
OBS: Hyphae växte på OTA-disken i 4-6 dagar. - Skrapa mycelia av den vilda typen stam och knockout stam med en inokulering slinga.
- Samla mycelia skräp och överföra dem till 250 ml flytande Complete Medium (CM).
- Odla svampskräpet i en triangulär kolv vid 28 °C i 36 timmar med skakningar vid 150 varv/min.
- Använd en tratt för att filtrera och samla svamphyphae.
- Tvätta svamphyfaen med 500 ml 0,7 M NaCl-lösning.
- Samla svampmyceliumet och väg det.
OBS: Myceliet behöver inte torkas innan du väger. - Tillsätt ~1 ml lysis enzympermeationslösning per 1 g av svampmyceliet.
- Förbered 20 mg/mL lysis enzympermeation lösning genom att lösa upp lysis enzymet från Trichoderma harzianum i 0,7 M NaCl.
- Placera hyphaen för lysning vid 28 °C i 3-4 timmar med skakningar vid 150 varv/min.
- Tvätta den lysade hyphaen med 50 ml 0,7 M NaCl-lösning.
- Samla protoplasterna och centrifugen i 15 min vid 2 000 x g och 4 °C.
- Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugation. Återanvänd protoplasterna i 20 ml 0,7 M NaCI-buffert vid 4 °C.
2. In vivo korslänkning och ultraljudsbehandling
- Tillsätt 55 μL 37% formaldehyd (tillsätt formaldehydd droppe för droppe tills den slutliga koncentrationen är 1%) till 2 ml NaCI-buffert som innehåller protoplast för korslänkning.
- Inkubera protoplasterna vid 25 °C i 10 min.
- Tillsätt 20 μL 10x glycin till varje rör för att släcka den oredovisade formaldehyden.
- Snurra för att blanda och inkubera vid 25 °C i 5 min.
- Centrifugera i 15 min vid 2 000 x g och 4 °C.
- Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugation. Återanvänd pelleten i 1 ml 0,7 M NaCI-lösning.
- Centrifugera i 10 min vid 2 000 x g och 4 °C.
- Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugation. Återanvänd pelleten i 750 μL RIPA-buffert (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0, 5% natriumdeoxycholat, 0, 1% SDS och proteashämmare).
- Tillsätt 37,5 μL 20x proteashämmare.
- Överför protoplasterna från föregående steg till ett 1,5 ml centrifugeringsrör.
- Utför ultraljudsbehandling (25% W, utgång 3 s, stopp 5 s, 4 °C) omedelbart med en ljuddator i ca 10 min. Syftet med detta steg är att ultraljudsbestäma det korslänkade lysatet under en tidsperiod för att bestämma de bästa förutsättningarna.
OBS: Lyset kan frysas vid -80 °C i detta steg. - Om optimala villkor för ultraljudsbehandling redan har fastställts, fortsätt till nästa steg.
- Om så önskas, ta bort 5 μL protoplaster för analys av agarosegel (oförsemat DNA).
- Skjuv kromatin genom ultraljudsbehandling med en ultraljud homogenisator i 8 min (25% W, utgång 3 s, stopp 5 s, 4 °C).
- När provet är ultraljud bruten, ta ut en del av provet som "ingång".. Indata utför inte ChIP-experimentet och innehåller allt DNA och protein som frigörs efter att provet har sonikerats.
- Efter ultraljudsbehandling, kör en 1% agarose gel elektrofores för att analysera längden på DNA-fragmenten.
OBS: Resultaten av agarose gelelektrofores visar att DNA-fragmentets längd är 200-500 bp (Figur 4). - Placera det sonikerade röret på is för att förhindra proteinnedbrytning.
- Centrifugera i 10 min vid 10 000 x g och 4 °C.
- Efter centrifugering överför du den centrifugerade supernaten till ett nytt 1,5 ml centrifugeringsrör och förvara det vid -80 °C för senare användning. Kromatinlösningen som erhålls i detta steg kan användas för efterföljande IP.
- Innan ip-experimentet utförs, späd varje kromatinprov till ett förhållande av 1:10 med 1x RIPA-buffert (t.ex. tillsätt 10 μL kromatinprov till 1 μL 1×RIPA-buffert).
3. IP av korslänkat protein/DNA
- Pipett 50 μL superparamagnetiska proteinpärlor i ett 2 ml centrifugeringsrör. Placera rören på ett magnetiskt stativ. Låt magnetpärlorna fälla ut. Ta bort supernaten.
- Tillsätt 1 ml 1x RIPA-buffert (förkyld på is) i röret och tvätta superparamagnetiska proteinpärlor tre gånger. Efter tvätten, placera rören på ett magnetiskt stativ och ta bort supernaten. Tillsätt 100 μL 1x RIPA-buffert till varje rör.
- Tillsätt 300 μL chormatinprov (2 x 107 celler användes), 100 μL superparamagnetiska proteinpärlor och 4 μL H3K4me3-antikroppar mot röret.
- Använd exempel med Mus IgG som negativ kontroll.
OBS: Mus-IgG som används i detta protokoll innehåller 0,01 M fosfatbuffert och 0,15 M NaCl och förblir frusen under 20 °C (se materialförteckning). - Efter blandning av brunn, placera proverna på en roterande skakapparat och inkubera över natten vid 4 °C, 30 x g.
OBS: Det kan vara möjligt att minska inkubationstiden för immunprecipitation (IP). Inkubationstiden beror på olika faktorer (t.ex. antikroppar, genmål, celltyp etc.) och måste empiriskt testas.
4. Insamling och sköljning av IP-produkter
- Pellet de superparamagnetiska proteinpärlorna genom att placera dem på ett magnetiskt stativ. Aspirera och kassera supernaten.
- Tvätta det superparamagnetiska proteinet pärla-antikropp/kromatin komplex genom att återanvända pärlor i 1 ml 1x RIPA buffert.
- Skölj röret på en roterande skakapparat i 5 minuter och ta bort supernaten vid 30 x g.
- Tillsätt 1 ml låg salt immunkomplex tvättbuffert (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 och 150 mM NaCl).
- Skölj röret på en roterande skakapparat i 5 minuter och ta bort supernaten.
- Tillsätt 1 ml hög salt immun komplex tvättbuffert (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 och 500 mM NaCl) till centrifugröret.
- Placera röret på en roterande skakapparat i 5 minuter och ta bort supernaten.
- Skölj med 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxykolsyra, 1 mM EDTA och 10 mM Tris-HCl pH 8,1) i centrifugröret.
- Placera röret på en roterande skakapparat i 5 minuter och ta bort supernaten.
- Skölj provröret igen med 1 ml liCI-buffert på 0,25 M, ta bort supernaten med en pipett och kassera sedan supernaten.
- Tillsätt 1 ml TE-buffert (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Placera röret på en roterande skakapparat i 5 min vid 30 x g.
- Tvätta röret igen med 1 ml TE-buffert och ta bort supernaten med en pipett.
- Samla pärlor.
5. Eluering av protein/DNA-komplex
- Förbered elueringsbufferten (10 μL 20% SDS, 20 μL 1 M NaHCO3,170 μL steril destillerad H2O) för alla IP- och ingångsrör.
- Tillsätt 100 μL elueringsbuffert till varje centrifugrör.
- Eluering vid 65 °C i 15 min.
- Centrifug i 1 min vid 10 000 x g och 4 °C och samla supernaten i nya centrifuger.
- Upprepa steg 5.2 - 5.4 och kombinera eluaterna. Tillsätt 190 μL elueringsbuffert till 10 μL av indata-DNA: t. (total volym = 200 μL).
6. Omvänd korskoppling av protein/DNA-komplex
- Tillsätt 8 μL 5 M NaCl till alla rör och inkubera vid 65 °C i 4-5 timmar eller över natten för att vända DNA-proteinkorslänkarna.
OBS: Förvara proverna vid -20 °C efter detta steg och fortsätt protokollet följande dag om det behövs. - Tillsätt 1 μL RNase A och inkubera i 30 min vid 37 °C.
- Tillsätt 4 μL Proteinas K (upplöst i H2O vid 20 mg/ml och förvaras vid -20 °C) i varje rör och inkubera vid 45 °C i 1-2 timmar.
7. Rening och återvinning av DNA
- Tillsätt 550 μL fenol/kloroform/isoamylalkoholblandning (förhållandet 25:24:1) i centrifugröret.
- Virvelblandningen noggrant i 1 min.
- Centrifug i 15 min vid 10 000 x g och aspirera supernaten.
- Överför det extraherade supernatanten från föregående steg till ett nytt 1,5 mL centrifugeringsrör.
- Tillsätt 1/10 volym 3 M natriumacetatlösning, 2,5 volymer absolut etanol och 3 μL glykogen (20 mg/ml) i röret.
- Placera provet i kylskåp vid -20 °C över natten för nederbörd.
- Centrifugera i 15 min vid 10 000 x g och 4 °C.
- Kassera supernaten efter centrifugation. Tvätta pelleten tre gånger med 1 ml 75% etanol (måste beredas färskt) vid 10 000 x g.
- Placera den tvättade fällningen på en ren bänk för att låta alkoholen torka.
- Tillsätt 50 μL sterilt avjoniserat H2O för att lösa upp fällningen i tillräcklig utsträckning.
- Ligatera sekvenseringsadaptern till DNA-fragmentet och använd en sekvenseringsplattform med hög genomströmning för att sekvensera DNA: t.
8. DNA-reparation och Solexa bibliotekskonstruktion
- Reparera DNA-ändarna för att generera trubbigt DNA med hjälp av ett DNA-slutreparationskit (1-34 μL DNA, 5 μL 10x slutreparationsbuffert, 5 μL 2,5 mM varje dNTP, 5 μL 10 mM ATP, 1 μL av enzymblandning för slutreparation och H2O för att justera reaktionsvolymen till 49 μL).
- Använd ett PCR-reningskit eller fenol: kloroformextraktion för att rena DNA: t. Elute eller återanvänd DNA i 30 μL 1x TE pH 7.4.
- Tillsätt "A" till 3 ändar (30 μL DNA från steg 2, 2 μL H2O, 5 μL 10x Taq-buffert, 10 μL 1 mM dATP och 3 μL Taq DNA-polymeras). Tillsätt reagenserna i ett 0,2 ml PCR-centrifugeringsrör, blanda väl och reagera i en PCR-maskin vid 72 °C i 10 min.
- Utför linker ligatur genom att blanda 10 μL DNA, 9,9 μL H2O, 2,5 μL T4 DNA-ligasbuffert, 0,1 μL adapter oligoblandning och 2,5 μL T4 DNA-ligas. Tillsätt reagenserna i ett 0,2 ml PCR-centrifugeringsrör och blanda väl. Inkubera dem vid 16 °C i 4 timmar.
- Rena DNA:t med hjälp av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens protokoll. Eluera med 20-25 μL elueringsbuffert.
- Innan DNA-biblioteket upprättas, identifiera koncentrationen av det renade DNA:t för att bekräfta dess användning för de efterföljande sekvenseringsexperimenten.
- Detektera DNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometer. Efter smältning av provet på is, blanda det noggrant och centrifugera i 30 s vid 1000 x g och 4 °C. Ta sedan en lämplig mängd prov och mät det i en fluorometer med en våglängd på 260 nm.
- Placera DNA-prover med kvalificerad kvalitet och koncentration på sekvenseringsplattformen Illumina för sekvensering.
- Före sekvensering, förstärk DNA med PCR-primers, PE1.0 och PE2.0 och 2x hög återgivning master mix (10,5 μL DNA, 12,5 μL 2x hög återgivning master mix, 1 μL PCR primer PE1.0 och 1 μL PCR primer PE2.0). Tillsätt reagenserna i ett 0,2 ml PCR-centrifugeringsrör och blanda väl.
- Kör PCR-reaktionen i PCR-maskinen: 95 °C predenaturation i 2 min; därefter 35 cykler av 95 °C denaturering för 10 s, glödgning vid 60 °C för 15 s, förlängning vid 72 °C för 5 s, en slutlig förlängning vid 72 °C i 5 min. Inkubera slutligen reaktionen vid 4 °C.
- Använd DNA för klustergenerering och utför sekvensering för syntes på en Illumina Hiseq 2000.
OBS: I det här protokollet användes Illumina flödesceller för klustergenerering. Sekvensering-för-syntes utfördes på en Illumina Genome Analyzer enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela flödesschemat för ChIP-seq-metoden visas i figur 1. ChIP-seq experiment utfördes med antikroppar mot H3K4me3 i vilda stammen P131 och tre null mutant stammar som saknade mobre2, mospp1, och moswd2 genen för att verifiera hela genom-wide profilen av histon H3K4me3 distribution i M. oryzae. Protoplasterna av den vilda stammen, Δmobre2, Δmospp1och Δmoswd2, förbereddes och sonikerades vid 25% W, utgång 3 s, stopp 5 s, vid 4 °C. Kromatin var vidare immunpurifierad med H3K4me3 antikroppar och Dynabeads protein A/G. Därefter extraherades DNA-fragment med fenol-kloroformmetoden för att konstruera ett sekvenseringsbibliotek och sekvenseras med enkla ändar på en hög genomströmningssekvenseringsplattform.
De representativa resultaten av stammarna wild-type, Δmobre2,Δmospp1och Δmoswd2 med ChIP-seq-metoden med H3K4me3-antikroppen visas i figur 2. H3K4me3-signalerna från Δmobre2,Δmospp1och Δ moswd2-borttagningsmutanterna minskade signifikant i dess funktionella målregioner. Som visas i figur 2kartlades vissa utvalda kandidatmålgener, inklusive MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 och MGG_04235, för H3K4me3-distribution. Jämfört med den vilda stammen P131 minskades signalerna från berikade H3K4me3-ChIP-seq-läsningar i Δmobre2, Δmospp1och Δ moswd2-borttagningsmutanterna till stor del (figur 2)26. Dessa resultat tyder på att H3K4me3 modifiering spelar viktiga roller i regleringen av mål gen uttryck i M. oryzae.
Figur 1. Flödesschemat för ChIP-seq-metoden i M. oryzae. A) Genomiskt DNA från M. oryzae var korslänkade med 1% formaldehyd. B) Lysed blast svamp celler, brutet DNA, fritt DNA och histon bindande DNA erhölls därefter. c) DNA-fragment som var bundna till histoner och extraherades genom särskild bindning till H3K4me3-antikroppen. D) Genom omvänd korskoppling erhöll renat DNA dna-fragment som modifierats av H3K4me3-histoner. Jag är inte så bra på att se till att det finns en DNA-fragmenten sekvenserades, sekvenseringsresultaten jämfördes och sekvenser identifierades i DNA-gruppen M. oryzae. G) Specifika gener och lokus av H3K4me3 histoner i M. oryzae hämtades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Δmobre2, Δmospp1, och Δmoswd2 borttagning mutanter minskade avsevärt H3K4me3 profiler i sina målregioner. H3K4me3-ChIP-seq fördelningen av berikade toppar runt kodningsregionerna av överlappade gener i Δmobre2, Δmospp1, och Δmoswd2 borttagning mutanter decresased jämfört med vilda typ stam i MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 och MGG_04235 gener26. Med siffran i WT (input) märkt som [0–2074] avses resultaten av ChIP i intervallet för genomiskt DNA [0–2074]. [0-2074] ser till 0-2074bp av Kromosom 6.Figurerar visar ett slumpmässigt val av sekvenseringresultaten, som föreställer endast DNA-fördelningen på Kromosom 6. De fullständiga sekvenseringsresultaten har lämnats till Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioprojekt/ anslutnings- 649321) 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Serienummer | Exempelnamn | Exempel på serienummer | Antal rör | Totalt (μg) | Fördelning av fragment | Typ av databas | Anmärkningar | ||||
| 1 | inmatning | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Huvudtoppen är under 100bp, men det finns DNA-fördelning mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | Fragmentet är för litet | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Inmatning | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Huvudtoppen är under 100bp, men det finns DNA-fördelning mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | Fragmentet är för litet | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | ingång Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Huvudtoppen är under 100bp, men det finns DNA-fördelning mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | Fragmentet är för litet | ||||
| 4 | ingång Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Huvudtoppen är under 100bp, men det finns DNA-fördelning mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | Fragmentet är för litet | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Huvudtoppen är mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Huvudtoppen är mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Huvudtoppen är mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Huvudtoppen är mellan 100bp-500bp | ChIP-seq (olika personer) | |||||
Tabell 1. Den totala mängden DNA i detta experiment. Den totala indatamängden P131(2) är 2,7948 μg, den totala mängden Δmobre2(3) (ingång) är 2,4748 μg, Den totala mängden Δmospp1(4) (ingång) är 3,22 μg, den totala mängden Δmoswd2 (5) (ingång) är 3,97 μg och den totala mängden P131(2) är 0,0735 μg, den totala mängden Δmobre2(3) är 0,0491μg, den totala mängden Δmospp1(4) är 0,0288 μg, den totala mängden Δmoswd2(5) är 0,0527 μg.
Bild 3. Elektrofores detektering av DNA efter ultraljud. Efter ultraljud ultraljud ultraljud, DNA utsätts för en 1% agarose gel experiment för att analysera längden på DNA fragment. Den sonikerade DNA-fragmentlängden är från 200-500 bp, och dessa DNA-fragment kan användas för följande steg i ChIP-seq. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Bioanalyzer spår av indata och ChIP prover. Figuren visar fragmentfördelningen för varje prov, där abscissa representerar fragmentstorleken, och koordinaten representerar toppstorleken. Proverna som körs på bioanalyzern är ingång P131(2), Δmobre2(3) (ingång), Δmospp1(4) (ingång), Δmoswd2(5) (ingång), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Bland dem visar fördelningen av insats P131(2), Δmobre2(3) (input), Δmospp1(4) (input), Δmoswd2(5) (input) att huvudtoppen är under 100 bp, men det finns DNA-fördelning vid 100-500 bp. Den verkliga fördelningen av P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) och Δmoswd2(5) är mellan 100-500 bp som huvudtoppen26. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyligen har ChIP-seq blivit en allmänt använd genomisk analysmetod för att bestämma bindningsplatserna för TFs eller anrikningsplatser som modifierats av specifika histoner. Jämfört med tidigare ChIP-seq-teknik är ny ChIP-seq-teknik mycket känslig och flexibel. Resultaten tillhandahålls i hög upplösning utan negativa effekter, såsom ljudsignalen som orsakas av den icke-specifika hybridiseringen av nukleinsyror. Även om detta är en gemensam genuttrycksanalys, har många beräkningsmetoder validerats, och komplexiteten hos ChIP-seq-data när det gäller buller och variabilitet gör detta problem särskilt svårt för ChIP-seq att övervinna. När det gäller dataanalys är hanteringen och analysen av den stora mängden data som genereras av ChIP-seq-experiment också en utmaning som ännu inte har tagits upp på ett tillfredsställande sätt.
Det finns flera viktiga steg i ChIP-seq-experimentet. Först och främst är beredningen av protoplasterna mycket viktig. Det är nödvändigt att kontrollera kollapstiden så att högkvalitativa protoplaster kan samlas in. Ultraljud är också mycket viktigt, ultraljudstiden bör kontrolleras, för lång eller för kort kommer inte att fungera. För det andra bör mängden antikroppar som tillsätts vara tillräcklig för att underlätta anrikningen av fler DNA-fragment som binder till proteinet. Vid kontroll av kvaliteten och mängden DNA som fällts ut i ChIP-seq-experimentet användes Qubit Fluorometer. Agilent 2100 användes för att upptäcka masskoncentration och fragmentfördelning av DNA, vilket ger en grund för om provet kan användas för efterföljande biblioteksetablerings- och sekvenseringsexperiment.
Sammantaget förbättrar detta protokoll förståelsen av hela genomomfattande fördelningen av epigenetiska modifieringar som reglerar patogena gener under patogeninfektion. Denna metod kommer att bidra till att identifiera molekylära mekanismer för epigenetiska modifieringar och identifiera nya målgener under svamputveckling och patogeninducerad patogenes i M. oryzae och andra filamentösa svampar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), det särskilda vetenskapliga forskningsprojektet vid Beijing Agriculture University (YQ201603), det vetenskapliga projektet i Pekings utbildningskommitté (KM201610020005), BUA:s vetenskapliga forskningsodlingsprojekt på hög nivå (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
