Summary
Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kromatin immünorektasyon dizilimi (ChIP-seq), transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler), kromatin düzenleyicilerinin ve histone modifikasyonlarının tüm genom konumlarını haritalamak ve TF bağlama kalıplarını ve histone posttranslational modifikasyonlarını ortaya çıkarmak için tüm genomları tespit etmek için güçlü ve yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Histone metilasyonu gibi kromatin değiştirme faaliyetleri genellikle belirli gen düzenleyici dizilere alınarak kromatin yapılarında lokalize değişikliklere neden olmakta ve belirli transkripsiyon etkilerine neden olmaktadır. Pirinç patlaması, dünya çapında pirinç üzerinde yıkıcı bir mantar hastalığıdır ve mantar bitki etkileşimini incelemek için örnek bir sistemdir. Bununla birlikte, histone modifikasyonlarının Magnaporthe oryzae'deki virülans genlerini nasıl düzenlediğine dair moleküler mekanizmalar zor kalır. Daha fazla araştırmacı, histone epigenetik modifikasyonun hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemek için ChIP-seq'i kullanmaktadır. ChIP-seq, hayvanlarda ve bitkilerde protein ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için de yaygın olarak kullanılır, ancak bitki patolojisi alanında daha az kullanılır ve iyi gelişmemiştir. Bu yazıda, M. oryzae'deki fonksiyonel hedef genlere bağlanan histone metilasyonunun (H3K4me3 gibi) genom çapındaki dağılımını tanımlamak için ChIP-seq'in deneysel sürecini ve çalışma yöntemini açıklıyoruz. Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.
Introduction
Epigenetik, genlerin nükleotid dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunun kalıtsal değişimini ifade eden bir genetik araştırma dalıdır. Giderek artan sayıda çalışma, epigenetik regülasyonun, daha yüksek sıralı yapılara katlama ve montaj dinamik süreci ile gen ekspresyonını düzenleyen ve etkileyen kromatin de dahil olmak üzere ökaryotik hücrelerin büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir1,2. Kromatin remodeling ve kovalent histone modifikasyonu kromatin polimerlerinin varyasyonu yoluyla kromatin fonksiyonunu ve yapısını etkiler ve düzenler, böylece gen ekspresyonunu düzenlemeişlevineulaşılır 3 ,4,5,6. Histone posttransilasyon modifikasyonları arasında asetilasyon, fosforilasyon, metilasyon, monoubiquitination, sumoylation ve ADP ribosilasyon7,8,9bulunur. Histone H3K4 metilasyonu, özellikle trimetilasyon, ökaryot 10,11'detranskripsiyon replikasyonu, rekombinasyon, onarım ve RNA işleme ile ilişkili olduğu transkripsiyon başlangıç sitelerine eşlenmiştir.
ChIP-seq teknolojisi 2007 yılında piyasaya sürlenmiştir ve transkripsiyonel regülasyon ve epigenetik mekanizmaların genom çapında analizi için deneysel standart haline gelmiştir12,13. Bu yöntem genom çapında ölçekte ve DNA bağlayıcı proteinlerin DNA segmentleri de dahil olmak üzere histone veya transkripsiyon faktörü etkileşim bilgilerini elde etmek için uygundur. İlgi çekici proteinlere çapraz bağlı dna dizileri kromatin kompleksinin bir parçası olarak bir arada olacaktır. Yeni nesil dizileme teknikleri, daha sonra ilgili hedef genomla eşleşen 36-100 bp DNA'yı sıralamak için de kullanılır.
Fitopatojenik mantarlarda, araştırmalar son zamanlarda histone metilasyon modifikasyonlarının patojeniklik sürecinde hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemeye başlamıştır. Daha önceki bazı çalışmalar, histone metil ile ilgili genlerin düzenlenmesinin esas olarak sekonder metabolitlerin (SM) üretiminin gen susturma ve katalzingine yansıdığını kanıtlamıştır. MoSet1, M. oryzae'deki H3K4 metilatlazıdır. Bu genin nakavtı, H3K4me3 modifikasyonunun tamamen silinmesine neden olur14. Vahşi tip suşla karşılaştırıldığında, mutanttaki MoCEL7C geninin ekspresyolü CMC kaynaklı durumda ve indüklenmemiş durumda (glikoz veya selobiyoz) inhibe edilir, MoCEL7C ekspresyolü15arttı . Fusarium graminearumdaKMT6, H3K27me3'ün metilasyon modifikasyonuna kataliz edebilir, mantarların normal gelişimini düzenleyebilir ve SM gen kümesi16 , 17 , 18,19'uiçeren "şifreli genomu" düzenlemeye yardımcı olabilir. 2013 yılında Connolly, H3K9 ve H3K27 metilasyonunun, hedef genlerin inhibisyonunu düzenleyen ikincil metabolitler ve efektör faktörler yoluyla mantarların patojenik sürecini düzenlediğini bildirdi20. Aspergillus'ta,H3K4me2 ve H3K4me3 histonlarının modifikasyonu gen aktivasyonu ile ilgilidir ve SM gen kümelerinin kromatin seviyesi regülasyonunun kontrolinde önemli bir rol oynar21. M. oryzae, Tig1 (maya ve memelilerde Tig1'e homolog) bir HADC (histone deacetylase)22. Tig1 geninin nakavtı, boş mutantta patojenite ve spor üretim yeteneğinin tamamen kaybına yol açar. Enfektif hyphae22üretemeyen peroksijen ortamına karşı daha hassastır.
M. oryzae.'nin neden olduğu pirinç patlaması, dünyadaki çoğu pirinç yetiştirme alanında en ciddi pirinç hastalıklarından biridir19. Temsili enfeksiyon süreci nedeniyle, M. oryzae birçok önemli patojenik mantarın enfeksiyon sürecine benzer. Moleküler genetik operasyonları kolayca gerçekleştirebildiği için, mantar mantar-bitki etkileşimlerini incelemek için örnek bir organizma haline gelmiştir23. M. oryzae enfeksiyon sürecinin her adımını bloke edilmesi başarısız enfeksiyona neden olabilir. Enfeksiyon sürecindeki morfolojik değişiklikler, tüm genom fonksiyonu ve gen transkripsiyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bunlar arasında, histone metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar fonksiyonel genlerin transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli bir rol oynar24,25. Bununla birlikte, M. oryzae'deki patogenez genlerinin transkripsiyonunda histone metilasyonu ve histone asetilasyonu gibi epigenetik modifikasyonların moleküler mekanizması üzerinde şimdiye kadar çok az çalışma yapılmıştır. Bu nedenle, bu patojenik ilgili genlerin yukarı ve aşağı akış düzenleyici ağını araştırırken pirinç patlaması mantarının epigenetik düzenleme mekanizmasının daha da geliştirilmesi, pirinç patlaması önleme ve kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
ChIP-seq gibi fonksiyonel genomiklerin gelişmesiyle, özellikle epigenetikte, bu yüksek verimli veri toplama yöntemi kromozomlar üzerine araştırmaları hızlandırmıştır. ChIP-seq deneysel teknolojisini kullanarak, M. oryzae ve diğer filamentli mantarlarda histone metilasyonunun (H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3 gibi) genom çapındaki dağılımı tanımlanabilir. Bu nedenle, bu yöntem, epigenetik değişikliklerin bitki patolojisinde mantar patogenezinde aday hedef genlerini nasıl düzenlediğinin altında bulunan moleküler mekanizmaların aydınlatıcı yapılmasına yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. M. oryzae'den protoplastların hazırlanması
- Yulaf ezmesi-domates agarını (OTA) hazırlayın.
- 30-50 gr yulaf ezmesi ağırlığında ve 800 mL suda (ddH2O) 20 dakika kaynatın. İki kat gazlı bezle filtreleyin ve filtrat alın.
- Olgun domatesleri toplayın ve soyun. Suyu sıkın ve süzülen meyve suyunun 150 mL'lik kısmını toplamak için iki kat gazlı bezle filtreleyin.
- Tüm domates suyunu ve hazırlanan yulaf filtratını iyice karıştırın ve 1000 mL'ye kadar ddH2O ekleyin.
- 500 mL konik şişeye 250 mL OTA ve 2,5 g agar tozu ekleyin ve 20 dakika boyunca otoklavlayın. 25 °C'de saklayın.
- Otomatik kapatılmış OTA'nın 25 mL'lik kısmını 5 cm x 5 cm Petri kabına dökün. Toplam 10 Petri kabı hazırlayın. OTA Petri kaplarında katılaştıktan sonra, bulaşıkları 25 ° C'de baş aşağı saklayın.
- M. oryzae'den küçük bir miselyum parçası çıkarmak için sterilize edilmiş bir kürdan kullanın (vahşi tip Suş P131, nakavt suşları Δmobre2, Δmospp1 ve Δmoswd2)ve hazırlanan OTA yemeklerine yerleştirin. Hafif koşullar altında 28 ° C'de 4-6 gün boyunca kültür edin.
NOT: Kirliliği önlemek için Petri kabını ters çevirin. - 1000 μL pipet kullanarak OTA yemeklerine 1000 μL sıvı Komple Orta (CM) (%0,6 maya özü, %0,3 enzmatik kazein hidrolizat, %0,3 asidik kazein hidrolizat, %1 glikoz) ekleyin.
NOT: Hyphae, OTA yemeklerinde 4-6 gün boyunca büyüdü. - Vahşi tip suş ve nakavt suşunun miselini bir aşılama döngüsü ile kazıyın.
- Misel kalıntılarını toplayın ve 250 mL sıvı Komple Orta (CM) aktarın.
- Mantar kalıntılarını 28 °C'de üçgen bir şişede 36 saat boyunca 150 rpm'de sallanarak büyütün.
- Mantar hyphae'yi filtrelemek ve toplamak için bir huni kullanın.
- Mantar hyphae'yi 500 mL 0,7 M NaCl çözeltisi ile yıkayın.
- Mantar miselyum toplayın ve tartın.
NOT: Miselyumun tartılmadan önce kurutulması gerekmez. - Mantar miselyumunun 1 g'ı başına ~1 mL lizis enzim geçirgenlik çözeltisi ekleyin.
- Trichoderma harzianum'dan lizis enzimini 0,7 M NaCl'de eriterek 20 mg/mL lizis enzim geçirgenlik çözeltisini hazırlayın.
- Hyphae'yi 28 °C'de 3-4 saat boyunca 150 rpm'de sallanarak yerleştirin.
- Lislenmiş hyphae'yi 50 mL 0,7 M NaCl çözeltisi ile yıkayın.
- Protoplastları ve santrifüjleri 2.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca toplayın.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atın. Protoplastları 4 °C'de 0,7 M NaCI tamponunun 20 mL'sinde yeniden sunun.
2. In vivo çapraz bağlama ve sonication
- Çapraz bağlama için protoplast içeren 2 mL NaCI tamponuna 55 μL% 37 formaldehit ekleyin (son konsantrasyon% 1 olana kadar damla damla formaldehit ekleyin).
- Protoplastları 25 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Reaktif olmayan formaldehiti söndürmek için her tüpe 20 μL 10x glisin ekleyin.
- 25 °C'de 5 dakika boyunca karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için döndürün.
- 2.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atın. Peletin 1 mL 0,7 M NaCI çözeltisinde yeniden kullanın.
- 2.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atın. Peletin 750 μL RIPA tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, %1 NP-40, %0,5 sodyum deoksikolat, %0,1 SDS ve proteaz inhibitörleri) yeniden dürttü.
- 37,5 μL 20x proteaz inhibitörü ekleyin.
- Protoplastları önceki adımdan 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Sonication (%25 W, çıkış 3 s, stop 5 s, 4 °C) hemen bir sonicator ile yaklaşık 10 dakika gerçekleştirin. Bu adımın amacı, en iyi koşulları belirlemek için çapraz bağlı lisate'yi bir süre sonalat etmektir.
NOT: Bu adımda lisat -80 °C'de dondurulabilir. - Sonication için en uygun koşullar zaten belirlenmişse, bir sonraki adıma geçin.
- İstenirse, agarose jel analizi için 5 μL protoplast çıkarın (duyulmamış DNA).
- Kromatin 8 dakika boyunca ultrasonik homojenizatör ile sonication ile yamyun (25% W, çıkış 3 s, dur 5 s, 4 °C).
- Örnek ultrasonik olarak kırıldıktan sonra, numunenin bir kısmını "giriş" olarak alın.. Giriş ChIP deneyini gerçekleştirmez ve örnek sonicated sonra serbest tüm DNA ve protein içerir.
- Sonikasyondan sonra, DNA parçalarının uzunluğunu analiz etmek için% 1 agarose jel elektroforezi çalıştırın.
NOT: Agarose jel elektroforez sonuçları DNA parçasının uzunluğunun 200-500 bp olduğunu göstermektedir (Şekil 4). - Protein bozulmasını önlemek için sonicated tüpünü buza yerleştirin.
- 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj.
- Santrifüjleme işleminden sonra, santrifüjlü süpernatantı yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Bu adımda elde edilen kromatin çözeltisi sonraki IP için kullanılabilir.
- IP denemesini gerçekleştirmeden önce, her kromatin örneğini 1x RIPA tamponu ile 1:10 oranına seyreltin (örneğin, 1 μL 1×RIPA tampona 10 μL kromatin örneği ekleyin).
3. Çapraz bağlantılı protein/DNA IP'si
- Pipet 50 μL süperparamagnetik protein boncukları 2 mL santrifüj tüpüne. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Manyetik boncuklar çökelsin. Üsttekini çıkarın.
- Tüpe 1 mL 1x RIPA tamponu (buz üzerinde önceden soğutulmuş) ekleyin ve süperparamagnetik protein boncuklarını üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve üst standı çıkarın. Her tüpe 100 μL 1x RIPA tampon ekleyin.
- Tüpe 300 μL kormatin örneği (2 x10 7 hücre kullanıldı), 100 μL süperparamagnetik protein boncukları ve 4 μL H3K4me3 antikoru ekleyin.
- Negatif kontrol olarak Fare IgG ile örnekleri kullanın.
NOT: Bu protokolde kullanılan Fare IgG 0,01 M fosfat tamponu ve 0,15 M NaCl içerir ve 20 °C'nin altında dondurulur (bkz. Malzeme Tablosu). - İyice karıştırdıktan sonra, numuneleri bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve 4 °C, 30 x g'da gece boyunca kuluçkaya yatırın.
NOT: İmmün önkömürün (IP) kuluçka süresini azaltmak mümkün olabilir. Kuluçka süresi farklı faktörlere (örneğin antikor, gen hedefi, hücre tipi vb.) bağlıdır ve ampirik olarak test edilmesi gerekecektir.
4. IP ürünlerinin toplanması ve durulatır
- Süperparamagnetik protein boncuklarını manyetik bir standa yerleştirerek pelet edin. Aspirat ve üstnatant atmak.
- Boncukları 1 mL 1x RIPA tamponunda yeniden yağlayarak süperparamagnetik protein boncuk-antikor/kromatin kompleksini yıkayın.
- Tüpü bir döner çalkalayıcı üzerinde 5 dakika durulayın ve süpernatant 30 x g'daçıkarın.
- 1 mL düşük tuz immün kompleks yıkama tamponu ekleyin (%0,1 SDS, %1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 ve 150 mM NaCl).
- Tüpü bir döner çalkalayıcı üzerinde 5 dakika durulayın ve üstnatant çıkarın.
- Santrifüj tüpüne 1 mL yüksek tuz immün kompleks yıkama tamponu (%0,1 SDS, %1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 ve 500 mM NaCl) ekleyin.
- Tüpü 5 dakika boyunca bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve üst düğmeyi çıkarın.
- Santrifüj tüpünde 1 mL LiCl (0,25 M LiCl, %1 NP-40, %1 deoksikolik asit, 1 mM EDTA ve 10 mM Tris-HCl pH 8,1) ile durulayın.
- Tüpü 5 dakika boyunca bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve üst düğmeyi çıkarın.
- Test tüpünü 1 mL 0,25 M LiCI tamponu ile tekrar durulayın, süpernatant'ı bir pipetle çıkarın ve ardından süpernatant atın.
- 1 mL TE arabelleği ekleyin (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
- Tüpü 30 x g'da 5 dakika boyunca döner çalkalayıcıya yerleştirin.
- Tüpü 1 mL TE tampon ile tekrar yıkayın ve bir pipetle üstnatant çıkarın.
- Boncukları topla.
5. Protein/DNA komplekslerinin elüasyonu
- Tüm IP ve giriş tüpleri için elution tamponu (10 μL% 20 SDS, 20μL 1M NaHCO 3 , 170 μL steril damıtılmış H2O) hazırlayın.
- Her santrifüj tüpüne 100 μL elution tamponu ekleyin.
- 15 dakika boyunca 65 °C'de elution.
- 10.000 x g ve 4 °C'de 1 dakika santrifüj ve süpernatantı yeni santrifüj tüplerine toplayın.
- 5.2 - 5.4 adımlarını tekrarlayın ve eluatları birleştirin. Giriş DNA'sının 10 μL'sine 190 μL elution tamponu ekleyin. (toplam hacim = 200 μL).
6. Protein/DNA komplekslerinin ters çapraz bağlanması
- Tüm tüplere 8 μL 5 M NaCl ekleyin ve DNA-protein çapraz bağlantılarını tersine çevirmek için 4-5 saat veya bir gecede 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu adımdan sonra, numuneleri -20 °C'de saklayın ve gerekirse ertesi gün protokole devam edin. - 1 μL RNase A ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her tüpe 4 μL Proteinaz K(20mg/mL'de H 2 O'da çözülür ve -20 °C'de saklanır) ekleyin ve 1-2 saat boyunca 45 °C'de kuluçkaya yatırın.
7. DNA'nın saflaştırılması ve kurtarılması
- Santrifüj tüpüne 550 μL fenol/kloroform/izoamil alkol karışımı (25:24:1 oranı) ekleyin.
- Karışımı 1 dakika boyunca iyice girdaplayın.
- 10.000 x g'da 15 dakika santrifüj ve süpernatantı aspire edin.
- Çıkarılan süpernatantı önceki adımdan yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpe 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat çözeltisi, 2,5 cilt mutlak etanol ve 3 μL glikojen (20 mg/mL) ekleyin.
- Numuneyi yağış için gece boyunca -20 °C'de bir buzdolabına yerleştirin.
- 10.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj.
- Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın. Pelezi 10.000 x g'da 1 mL% 75 etanol (taze hazırlanması gerekir) ile üç kez yıkayın.
- Yıkanmış çökeltmeyi temiz bir tezgaha yerleştirin ve alkolün kurumasını bekleyin.
- Çökeltmeyi yeterince çözmek için 50 μL steril deiyonize H2O ekleyin.
- Sıralama adaptörunu DNA parçasına bağlayın ve DNA'yı sıralamak için yüksek verimli bir sıralama platformu kullanın.
8. DNA onarımı ve Solexa kütüphanesi inşaatı
- DNA uçlarını bir DNA uç onarım kiti (1-34 μL DNA, 5 μL 10x uç onarım tamponu, her dNTP'de 2,5 mM'nin 5 μL'si, 10 mM ATP'nin 5 μL'si, 1 μL uç onarım enzim karışımı ve reaksiyon hacmini 49 μL'ye ayarlamak için H2O) kullanarak künt uçlu DNA üretmek için onarın.
- DNA'yı arındırmak için bir PCR saflaştırma kiti veya fenol kullanın: kloroform ekstraksiyonu. DNA'nın 1x TE pH 7.4'ün 30 μL'sinde elute veya resuspend.
- 3' uçlara "A" ekleyin (adım 2'den 30 μL DNA, 2 μL H2O, 5 μL 10x Taq tampon, 10 μL 1 mM dATP ve 3 μL Taq DNA polimeraz). Reaktifleri 0,2 mL PCR santrifüj tüpüne ekleyin, iyice karıştırın ve 72 °C'de bir PCR makinesinde 10 dakika boyunca reaksiyona sokun.
- 10 μL DNA, 9,9 μL H 2 O,2,5 μLT4 DNA ligaz tamponu, 0,1 μL adaptör oligo karışımı ve 2,5 μL T4 DNA ligazını karıştırarak bağlayıcı ligasyonunu gerçekleştirin. Reaktifleri 0,2 mL PCR santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın. 16 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin protokolüne göre PCR saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı arındırın. 20-25 μL elution tampon ile elute.
- DNA kütüphanesi kurulmadan önce, sonraki sıralama deneyleri için kullanımını doğrulamak için saflaştırılmış DNA'nın konsantrasyonunu tanımlayın.
- Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonu tespit edin. Numuneyi buz üzerinde erittikten sonra, iyice karıştırın ve 1000 x g ve 4 °C'de 30 sn sn santrifüj karıştırın. Daha sonra uygun miktarda numune alın ve dalga boyu 260 nm olan bir florometrede ölçün.
- Sıralama için Illumina sıralama platformuna nitelikli kalite ve konsantrasyona sahip DNA örnekleri yerleştirin.
- Sıralamadan önce, PCR astarları, PE1.0 ve PE2.0 ve 2x yüksek doğrulukta ana karışım (10.5 μL DNA, 12.5 μL 2x yüksek doğruluk ana karışımı, 1 μL PCR astar PE1.0 ve 1 μL PCR astar PE2.0) kullanarak DNA'yı güçlendirin. Reaktifleri 0,2 mL PCR santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın.
- PCR makinesinde PCR reaksiyonunu çalıştırın: 2 dakika boyunca 95 °C predenatürasyon; daha sonra 10 s için 95 °C denatürasyon 35 döngü, 15 s için 60 °C'de tavlama, 5 s için 72 °C'de uzatma; 5 dakika boyunca 72 °C'de son bir uzatma. Son olarak, reaksiyonun 4 ° C'de kuluçkaya yatır.
- Küme üretimi için DNA'yı kullanın ve Illumina Hiseq 2000'de senteze göre sıralama gerçekleştirin.
NOT: Bu protokolde, küme oluşturma için Illumina akış hücreleri kullanılmıştır. Senteze göre sıralama, üreticinin talimatlarına uyarak bir Illumina Genom Analizörü üzerinde gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ChIP-seq yönteminin tüm akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. ChIP-seq deneyleri, vahşi tip Suş P131'de H3K4me3'e karşı antikorlar ve M. oryzae'dekihistone H3K4me3 dağılımının tüm genom çapındaki profilini doğrulamak için mobre2, mospp1ve moswd2 genlerinden yoksun üç boş mutant suşu kullanılarak gerçekleştirildi. Vahşi tip suşun protoplastları, Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2, % 25 W, çıkış 3 s, dur 5 s, 4 ° C'de hazırlandı ve sonicated. Ayrıca, kromatin H3K4me3 antikoru ve Dynabeads proteinI A /G ile immün olarak sulandı. Daha sonra, DNA parçaları bir sıralama kütüphanesi oluşturmak için fenol-kloroform yöntemi kullanılarak çıkarıldı ve yüksek verimli bir sıralama platformunda tek uçlarla sıralandı.
H3K4me3 antikoru kullanılarak ChIP-seq yöntemi ile vahşi tip, Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2 suşlarının temsili sonuçları Şekil 2'degösterilmiştir. fonksiyonel hedef bölgelerinde Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2 silme mutantlarının H3K4me3 sinyalleri önemli ölçüde azaldı. Şekil 2'degösterildiği gibi, H3K4me3 dağılımı için MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 ve MGG_04235 dahil olmak üzere seçilen bazı aday hedef genleri haritalanmıştır. P131 vahşi tip suşu ile karşılaştırıldığında, zenginleştirilmiş H3K4me3-ChIP-seq Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2 silme mutantlarındaki okuma sinyalleri büyük ölçüde azaltılmıştır (Şekil 2)26. Bu sonuçlar, H3K4me3 modifikasyonun M. oryzae'de hedef gen ekspresyonun düzenlenmesinde önemli roller oynadığını göstermektedir.
Şekil 1. M. oryzae'deki ChIP-seq yönteminin akış şeması. (A) M. oryzae'nin genomik DNA'sı %1 formaldehitile çaprazlandı. (B) Daha sonra lysed blast mantar hücreleri, kırık DNA, serbest DNA ve histone bağlayıcı DNA elde edildi. (C) Histonlara bağlı DNA parçaları ve H3K4me3 antikoru için spesifik bağlama ile çıkarıldı. (D) Ters çapraz bağlama yoluyla, saflaştırılmış DNA daha sonra H3K4me3 histonları tarafından modifiye edilmiş DNA parçaları elde etti. (E-F) DNA parçaları sıralandı, sıralama sonuçları karşılaştırıldı ve M. oryzae DNA grubunda diziler tespit edildi. (G) M. oryzae'deki H3K4me3 histonlarının spesifik genleri ve locileri alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2 silme mutantları hedef bölgelerindeki H3K4me3 profillerini önemli ölçüde azalttı. Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2 silme mutantlarındaki çakışmış genlerin kodlama bölgeleri etrafında zenginleştirilmiş zirvelerin H3K4me3-ChIP-seq dağılımı, MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 ve MGG_04235 genlerindekivahşi tip suşlara kıyasla çökmüşdurumdadır 26. WT 'deki (giriş) sayı [0-2074] olarak etiketlenmiştir, chip'in genomik DNA aralığındaki sonuçları anlamına gelir [0-2074]. [0-2074] Kromozom 6'nın 0-2074bp'sine atıfta bulunur.Şekil, yalnızca Kromozom 6'daki DNA dağılımını temsil eden sıralama sonuçlarının rastgele bir seçimini gösterir. Sıralama sonuçlarının tamamı Genbank'a sunulmuştur. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ katılım 649321) 26. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Seri numarası | Örnek ad | Örnek seri numarası | Tüp sayısı | Toplam (μg) | Parça dağılımı | Veritabanı türü | Açıklamalar | ||||
| 1 | girdi | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Ana tepe noktası 100bp'nin altındadır, ancak 100bp-500bp arasında DNA dağılımı vardır. | ChIP-seq | Parça çok küçük | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Girdi | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Ana tepe noktası 100bp'nin altındadır, ancak 100bp-500bp arasında DNA dağılımı vardır. | ChIP-seq | Parça çok küçük | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | giriş Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Ana tepe noktası 100bp'nin altındadır, ancak 100bp-500bp arasında DNA dağılımı vardır. | ChIP-seq | Parça çok küçük | ||||
| 4 | giriş Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Ana tepe noktası 100bp'nin altındadır, ancak 100bp-500bp arasında DNA dağılımı vardır. | ChIP-seq | Parça çok küçük | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Ana tepe noktası 100bp-500bp arasındadır | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Ana tepe noktası 100bp-500bp arasındadır | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Ana tepe noktası 100bp-500bp arasındadır | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Ana tepe noktası 100bp-500bp arasındadır | ChIP-seq | |||||
Tablo 1. Bu deneydeki toplam DNA miktarı. Toplam giriş P131(2) miktarı 2.7948 μg, toplam Δmobre2(3) (giriş) miktarı 2.4748 μg, toplam Δmospp1(4) (giriş) miktarı 3,22 μg, toplam Δmoswd2 (5) (giriş) miktarı 3,97 μg ve toplam P131(2) miktarı 0,0735 μg, toplam Δmobre2(3) miktarı 0,0491μg, toplam Δmospp1(4) miktarı 0.0288 μg, toplam Δmoswd2(5) miktarı 0.0527 μg'dir.
Şekil 3. Ultrasondan sonra DNA'nın elektroforez tespiti. Ultrason sonication sonra, DNA parçaların uzunluğunu analiz etmek için% 1 agarose jel deneyine tabi tutulur. Sonikleştirilmiş DNA parçası uzunluğu 200-500 bp'dir ve bu DNA parçaları ChIP-seq'in aşağıdaki adımları için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Giriş ve ChIP örneklerinin biyoanalyzer izi. Şekil, abscissa'nın parça boyutunu ve ordinatın tepe boyutunu temsil ettiği her örneğin parça dağılımını gösterir. Biyoanalizörde çalışan örnekler P131(2), Δmobre2(3) (giriş), Δmospp1(4) (giriş), Δmoswd2(5) (giriş), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5) girişidir. Bunlar arasında P131(2), Δmobre2(3) (giriş), Δmospp1(4) (giriş), Δmoswd2(5) (giriş) girişinin dağılımı ana tepenin 100 bp'nin altında olduğunu gösterir, ancak 100-500 bp'de DNA dağılımı vardır. P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) ve Δmoswd2'nin (5) gerçek dağılımı ana tepe26olarak 100-500 bp arasındadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son zamanlarda, ChIP-seq, belirli histonlar tarafından değiştirilen TF'lerin veya zenginleştirme sitelerinin bağlama alanlarını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir genomik analiz yöntemi haline gelmiştir. Önceki ChIP-seq teknolojisine kıyasla, yeni ChIP-seq teknolojisi son derece hassas ve esnektir. Sonuçlar, nükleik asitlerin spesifik olmayan melezleştirilmesinden kaynaklanan gürültü sinyali gibi olumsuz etkiler olmadan yüksek çözünürlükte sağlanır. Bu yaygın bir gen ekspresyon analizi olmasına rağmen, birçok hesaplama yöntemi doğrulanmıştır ve ChIP-seq verilerinin gürültü ve değişkenlik açısından karmaşıklığı, chIP-seq'in üstesinden gelmesi için bu sorunu özellikle zorlaştırmaya koymaktadır. Veri analizi açısından, ChIP-seq deneyleri tarafından oluşturulan büyük miktarda verinin yönetilmesi ve analiz edilmesi de henüz yeterince ele alınmamış bir zorluktur.
ChIP-seq deneyinde birkaç önemli adım vardır. Her şeyden önce, protoplastların hazırlanması çok önemlidir. Yüksek kaliteli protoplastların toplanabilmesi için çökme süresini kontrol etmek gerekir. Ultrason da çok önemlidir, ultrason süresi kontrol edilmelidir, çok uzun veya çok kısa çalışmaz. İkincisi, eklenen antikor miktarı proteine bağlanan daha fazla DNA parçasının zenginleştirilmesini kolaylaştırmak için yeterli olmalıdır. ChIP-seq deneyinde çöken DNA'nın kalitesi ve miktarı doğrulanırken Qubit Fluorometer kullanılmıştır. Agilent 2100, dna'nın kütle konsantrasyonu ve parça dağılımını tespit etmek için kullanıldı, bu da örneğin sonraki kütüphane kurma ve sıralama deneyleri için kullanılıp kullanılamayacağına temel teşkil ediyor.
Genel olarak, bu protokol patojen enfeksiyonu sırasında patojenik genleri düzenleyen epigenetik modifikasyonların tüm genom çapındaki dağılımının anlaşılmasını geliştirir. Bu yöntem, M. oryzae ve diğer filamentli mantarlarda mantar gelişimi ve patojen kaynaklı patogenez sırasında epigenetik modifikasyonların moleküler mekanizmalarının belirlenmesine ve yeni hedef genlerin tanımlanmasına katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarların olmadığını açıkladılar.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (grant no. 31871638), Pekin Tarım Üniversitesi Özel Bilimsel Araştırma Projesi (YQ201603), Pekin Eğitim Komitesi Bilimsel Projesi (KM201610020005), BUA'nın üst düzey bilimsel araştırma yetiştirme projesi (GJB2021005) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
