Summary
Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.
Abstract
Het succes van steriele of incompatibele op insectentechnieken gebaseerde populatieonderdrukkingsprogramma's hangt af van het vermogen van vrijgelaten mannetjes om te concurreren om vrouwtjes van het wilde type en steriliteit in de doelpopulatie te induceren. Daarom is laboratoriumbeoordeling van het concurrentievermogen van de mannelijke paring essentieel voor het evalueren van de geschiktheid van de vrijgavestam vóór veldafgifte. Conventioneel wordt een dergelijke test uitgevoerd door het bepalen van het aandeel levensvatbare eieren dat door de vrouwtjes wordt geproduceerd nadat ze tegelijkertijd zijn blootgesteld aan twee sets mannetjes (wild-type en release-stammen) voor copulatie. Dit proces is echter tijdrovend en arbeidsintensief vanwege de noodzaak om eerst de vrouwtjes te bloeden voor de productie van eieren en vervolgens uit te komen en de uitgekomen eieren op te sommen om de levensvatbaarheid van het ei te bepalen.
Bovendien kan deze methode de mate van concurrentie tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerdemuggenlijnen niet onderscheiden, omdat wilde vrouwelijke muggen alleen niet-levensvatbare eieren zullen produceren bij paring met beide. Om deze beperkingen te omzeilen, beschrijft dit artikel een meer directe methode voor het meten van het concurrentievermogen van mannelijke muggen in laboratoriumomgevingen met behulp van de fluorescerende kleurstof rhodamine B (RhB), die kan worden gebruikt om mannetjes te markeren door ze te voeden in sucrose-oplossing die RhB bevat. Na de paringstest kan de aanwezigheid van fluorescerende spermacellen in de spermathecae van een vrouw worden gebruikt om haar paringspartner te bepalen. Deze methode is kosteneffectief, vermindert de experimentele tijd met 90% en maakt vergelijking van de paringsgeschiktheid tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerdelijnen mogelijk.
Introduction
Het fokken en vrijgeven van steriele of incompatibele mannetjes voor onderdrukking van Aedes-muggenpopulaties wordt momenteel in het veld geëvalueerd als een nieuw hulpmiddel om uitbraken van dengue en andere door Aedesovergedragen ziekten te voorkomen1. Onderdrukkingsstrategieën voor mannelijke vrijlating die momenteel in veldproeven zijn, omvatten het gebruik van de genetische methode2, bestraling (Steriele Insect Techniek, SIT)3, endosymbiotische bacteriën Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, of een combinatie van de laatste twee technieken5,6. Het succes van deze benaderingen is grotendeels afhankelijk van het vermogen van de vrijgelaten mannetjes om wilde mannetjes te overtreffen en vrouwtjes te zoeken om copulatie te garanderen. Anders kan steriliteit niet worden geïnduceerd in de doelpopulatie.
In een klassiek SIT-programma kan de mannelijke paringsconditie bijvoorbeeld worden beïnvloed door factoren zoals bestralingsdosis7,8,9,massaopfokprotocol en de mate van inteelt in de kolonie10,11,12,13,14. Bovendien kunnen studies over het concurrentievermogen van de paring belangrijke kennis opleveren over het paringsgedrag van muggen die kan worden gebruikt om vectorbestrijdingsstrategieën te informeren.
In SIT en IIT wordt de paringsconcurrentie van mannelijke muggen meestal beoordeeld door zowel wild-type als release-stam te laten concurreren om wild-type vrouwtjes in een kooi8,11,15,16. Vrouwtjes worden vervolgens met bloed gevoed en hun eieren uitgebroed om de levensvatbaarheid te bepalen. Vrouwtjes die niet-levensvatbare eieren of eieren met een lage broedsnelheid leggen, worden verondersteld te hebben gepaard met mannetjes van de lossingsstam, terwijl vrouwtjes die levensvatbare eieren produceren, worden verondersteld te hebben gepaard met mannetjes van het wildtype. Paring concurrentievermogen wordt vervolgens berekend met de Fried Index17. Helaas is deze methode resource-intensief en tijdrovend, en de algehele Fried Index kan worden beïnvloed door externe verstorende factoren die de levensvatbaarheid van eieren beïnvloeden, zoals slechte verwerking van eieren en overdroging, kan resulteren in een lage uitkomstsnelheid in de compatibiliteitskruising die vervolgens kan leiden tot een kunstmatig lage Fried Index.
Bovendien maakt deze methode het niet mogelijk om de paringsconcurrentie te vergelijken tussen Aedes-muggen die zijn geïnfecteerd met verschillende stammen van Wolbachia of die worden blootgesteld aan verschillende doses bestraling. Daarom is een meer directe methode nodig om deze uitdagingen aan te pakken. Recente studies18,19 hebben de effectiviteit aangetoond van het gebruik van de fluorescerende kleurstof, RhB, om de zaadvloeistof van mannelijke muggen te markeren. Gemarkeerde zaadvloeistof wordt overgebracht en opgeslagen in de spermathecae van de vrouwelijke muggen na succesvolle paring, waardoor directe meting van vrouwelijke paringsinteractie met gemarkeerde mannetjes mogelijk is. Rhodamine B is een thiol-reactieve fluorone kleurstof die vaak wordt gebruikt als biomarker voor ecologische en gedragsonderzoeksstudies bij dieren, waaronder insecten20. Voor muggenstudies wordt RhB geïntroduceerd door te voeden met suiker- of honingwater dat opgelost RhB-poederbevat 18,19,21,22,23,24. Bij opname bindt de RhB-kleurstof zich aan eiwitten en kleurt lichaamsweefsel met een roodachtig roze vlek die feloranje fluoresceert onder een fluorescerende lichtbron.
Het sterke fluorescentiesignaal en de stabiliteit van de markering, in combinatie met het vermogen om zaadvloeistoffen van insecten te kleuren, maakt het mogelijk om de overdracht van gemarkeerde zaadvloeistof van het gelabelde mannetje naar de spermaopslagorganen van het vrouwelijke insect te controleren voor paringsstudies18,19,21,24. Het gebruik van RhB in een mannelijke paringsconcurrentietest maakt niet alleen directe meting van de paringsinteractie van vrouwtjes met gemarkeerde en ongemarkeerde mannetjes mogelijk, maar de resultaten kunnen ook binnen 24 uur worden verkregen, omdat het het proces van het bepalen van de levensvatbaarheid van het ei, dat meestal ongeveer 10 tot 14 dagen vereist, overbodig maakt. Bovendien overwint deze methode het potentiële verlies van gegevens wanneer de vrouwelijke muggen zich niet voeden of sterven voordat ze zich verplaatsen. Dit is vooral cruciaal omdat in semi-veldproeven, waar vrouwelijke muggen gevoelig zijn voor schade en dood tijdens het verzamelen na de paring met behulp van een rugzak of mechanische aspirator. Om de huidige beperkingen van het gebruik van vrouwelijke vruchtbaarheid aan te pakken, presenteren we een alternatieve methode die RhB-kleuring gebruikt om het concurrentievermogen van mannelijke muggenparing direct te meten. De methode vereenvoudigt de workflow, verkort de experimentele tijd van ongeveer twee weken tot één dag, waardoor meer experimentele replicaties kunnen worden uitgevoerd en vergelijking tussen twee vrijgavestammen mogelijk is. Dit protocol zal geschikt zijn voor laboratoria die beginnen met op mannelijke vrijlating gebaseerde muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma's en kan worden gebruikt voor routinematige kwaliteitscontrole en stamevaluatie.
Protocol
1. Opfok van muggen
- Voer alle muggenopfok en de mannelijke paringsconcurrentietest uit onder standaard insectachtige omstandigheden van 27 ± 1 °C en 75-80% relatieve vochtigheid, met een fotoperiode van 12 h:12 h licht: donkere cycli.
- Wijs de twee sets concurrerende mannetjes aan als Set A en Set B voor eenvoudige referentie in de methodologie die in dit artikel wordt beschreven. Kweek de muggen onder gestandaardiseerde omstandigheden om een eerlijke vergelijking van hun fitheid tijdens de test te garanderen. Kweek de muggen met een larvale dichtheid van 500 larven in 2 L water en voed ze met gemalen visvoerpoeder ad libitum.
OPMERKING: Voor het genereren van de representatieve resultaten waren Set A en Set B de inteelt- en outcross-mannetjes van de Wolbachia-geïnfecteerde Ae. Aegypti, respectievelijk. - Geslacht mannelijke en vrouwelijke muggen in het popstadium, en bevatten ze afzonderlijk in kooien (zie de tabel met materialen) met afmetingen B 32,5 cm x D 32,5 cm x H 32,5 cm, met een maaswijdte van 150 x 150 en een diafragma van 160 μm. Onderhoud alle volwassen muggen met 10% sucrose-oplossing.
2. Bereiding van mannelijke en vrouwelijke muggen
- Geslacht de mannelijke en vrouwelijke muggen in het popstadium volgens hun grootteverschillen (mannelijke poppen zijn kleiner dan vrouwelijke poppen) (figuur 1).
- Breng voor elke set muggen (set A of set B) 100 mannelijke poppen elk over in een vooraf gelabelde kooi voor sucrosevoeding of RhB-sucrosevoeding.
- Plaats de vrouwelijke poppen in kleine batches van 40-50 per kooi. Controleer bij het verschijnen van de imago's de kooien op de aanwezigheid van mannelijke muggen.
OPMERKING: Volwassen mannelijke muggen zijn kleiner dan vrouwtjes en hebben borsteligere en harigere antennes(figuur 2). Gebruik alleen maagdelijke vrouwelijke muggen voor de paringsconcurrentietests. Het gebruik van gepre-geïnsemineerde vrouwtjes maakt alle resulterende gegevens ongeldig. Er moet dus uiterste zorg worden besteed tijdens het vrijen in het poppenstadium. Gebruik de vrouwelijke muggen niet uit een kooi die is besmet met mannelijke muggen. Extra kooien van vrouwtjes moeten worden voorbereid.
3. Bereiding van 0,2% RhB - sucrose-oplossing
OPMERKING: RhB is een groen poeder in droge vorm en roodachtig roze in oplossing. Standaard persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM: laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en oogbescherming) moeten worden gedragen bij het hanteren van deze chemische stof. Om inademing te voorkomen, weegt u het RhB-poeder in een zuurkast.
- Om een 0,2% w/v RhB-sucrose-oplossing te bereiden, lost u 200 mg RhB-poeder op voor elke 100 ml 10% w/v/sucrose-oplossing. Meng goed om ervoor te zorgen dat al het poeder is opgelost.
OPMERKING: Omdat RhB lichtgevoelig is, gebruikt u amberkleurige flessen of wikkelt u heldere flessen volledig in met aluminiumfolie.
4. Voeding van mannelijke muggen
OPMERKING: Gegevens van RhB-sucrose voedingsoptimalisatie worden gepresenteerd in Supplemental Material, sectie 1.
- Bereid 20 suikervoederflessen voor met een lont. Voeg 10 ml 10% sucrose toe aan 10 feederflessen en 10 ml 0,2% RhB-sucrose-oplossing in de andere 10 feederflessen (gebruik amberflessen of wikkel de flessen in aluminiumfolie).
- Plaats de voederflessen in de respectieve mannelijke kooien (5 flessen per kooi) die zijn bereid in stappen 2.2 en 2.3. Laat de mannelijke muggen zich drie dagen voeden voor het paringsexperiment.
5. Controleren op RhB-fluorescentie bij mannelijke muggen
- Adem RhB-sucrose-gevoede mannelijke muggen op en observeer ze onder een fluorescentie-stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat alle RhB-sucrose-gevoede mannelijke muggen met succes zijn gemarkeerd met RhB.
- Zet de kwikbranderlamp en de stereomicroscoop aan. Laat de lichtbron van de kwikbranderlamp gedurende 10 minuten stabiliseren. Stel de fluorescentiefilters in voor rood fluorescentie-eiwit 1 (RFP1) (excitatiegolflengte 540 nm, emissiegolflengte 625 nm).
- Aspirateer een klein aantal muggen (vier of vijf) tegelijk in de glazen buis van de orale aspirator. Observeer door de glazen buis het lichaam van de mannelijke muggen onder de fluorescentie-stereomicroscoop. Sluit mannelijke muggen die niet zijn gemarkeerd met RhB uit van het experiment.
OPMERKING: De buik van mannelijke muggen gemarkeerd met RhB ziet er roze uit onder wit licht(figuur 3A)en gloeit feloranje onder fluorescerend licht(figuur 3B). - Zet set een mannelijke muggen over in 12 papieren bekers die zijn vastgezet met gaas (maaswijdte 150 x 150, diafragma van 160 μm); 6 kopjes elk met 10 sucrose-gevoede mannelijke muggen en de andere 6 kopjes elk met 10 RhB-sucrose-gevoede mannelijke muggen. Herhaal deze stap voor Set B mannelijke muggen.
6. Paring concurrentievermogenstest
- Stel 12 B 60 cm x D 60 cm x H 60 cm kooien op met maaswijdte 44 x 32, 650 μm opening voor de paringstest. In elk van de zes kooien, omvatten 10 Set A (RhB-gemarkeerde) mannelijke muggen, 10 Set B (ongemarkeerde) mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen. In de andere zes kooien, omvatten 10 Set A (ongemarkeerde) mannelijke muggen, 10 Set B (RhB-gemarkeerde) mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen. Label deze kooien om duidelijk onderscheid te maken tussen de twee paringscombinaties.
OPMERKING: Op basis van ervaring werd een kooi van 60 cm x 60 cm x 60 cm gebruikt voor de paringstest, omdat een kleinere kooi gemengde paring kan aanmoedigen. - Plaats de respectievelijke kopjes mannetjes die in stap 5.4 zijn bereid in de paringskooien volgens het etiket in stap 6.1. Verwijder het gaas en tik zachtjes op de beker om de mannetjes uit de beker te duwen. Verwijder voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen. Laat de mannelijke muggen minstens een uur acclimatiseren in de paringskooi.
- Breng met behulp van een orale aspirator maagdelijke wilde vrouwelijke muggen over in 12 papieren bekers, waarbij elke beker 10 muggen bevat.
- Na de acclimatisatieperiode voor de mannelijke muggen, breng een kopje vrouwtjes over in elke paringskooi en verwijder het gaas. Duw de beker voorzichtig om eventuele resterende vrouwelijke muggen uit de beker te stimuleren. Verwijder voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen.
- Laat de paring 3 uur duren.
OPMERKING: De aanbevolen paringsduur werd bepaald door eerdere waarnemingen van wild-type Ae. aegypti. In experimenten met 10 vrouwtjes en 20 mannetjes die in een kooi van 60 cm x 60 cm x 60 cm werden gehouden, werd 90% vrouwelijke inseminatie bereikt in 3 uur(aanvullend materiaal, sectie 2). Verstoor de kooi tijdens deze periode niet, omdat agitatie kan leiden tot onderbroken en gemengde paring. Gemengde paring (waarbij het vrouwtje heeft gepaard met zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes) resulteert in een voorkeur voor RhB-gemarkeerde mannetjes, omdat het moeilijk is om ongemarkeerde spermacellen te onderscheiden van RhB-gemarkeerde spermacellen onder een fluorescentiemicroscoop. - Om het paringsexperiment te beëindigen, verwijdert u alle muggen uit elke kooi met behulp van een mechanische aspirator. Verdoving de muggen op ijs gedurende ten minste 5 minuten. Wanneer de muggen volledig zijn verdoofd, pak je de vrouwelijke muggen voorzichtig op en huisvest je ze in een aparte papieren beker die is beveiligd met gaas (maaswijdte 150 x 150, 160 μm diafragma). Label de papieren beker door het betreffende etiket van de paringskooi over te brengen naar de papieren beker.
OPMERKING: Het is mogelijk om het experiment op dit punt te pauzeren en de vrouwtjes te behouden met 10% sucrose-oplossing. De RhB-gemarkeerde zaadvloeistof blijft minstens een week stabiel in de vrouwelijke spermathecae. Het is het beste om de vrouwtjes in leven te houden voordat ze worden gediscedeerd, omdat dode en uitgedroogde exemplaren moeilijk te ontleden zijn. - Om de vrouwelijke spermathecae te scoren, verdoving koud de vrouwelijke muggen op ijs gedurende ten minste 5 minuten voordat ze onder een stereomicroscoop worden gediscedeerd (Video 1). Onderzoek de spermathecae onder een samengestelde lichtmicroscoop (vergroting 100x) op hun inseminatiestatus(figuur 4). Voor geïnsemineerde individuen, bepaal of de spermathecae RhB-gemarkeerde zaadvloeistof bevatten door ze te onderzoeken onder de fluorescentie stereomicroscoop uitgerust met een RFP1-filter en een camerabeeldsysteem.
OPMERKING: Bij gebruik van een fluorescentie stereomicroscoop met een aangesloten beeldvormingssysteem, wordt aanbevolen om een verlengde belichtingstijd (5 s) te gebruiken om de detectiegevoeligheid te verhogen. Als de vrouwelijke mug heeft gepaard met een gemarkeerd mannetje, zal haar spermathecae feloranje fluoresceren(figuur 5A). Als de vrouwelijke mug echter heeft gepaard met een ongemarkeerd mannetje, zal haar geïnsemineerde spermathecae niet fluoresceren (figuur 5B).
7. Verwijdering van RhB-afval
- Behandel waterig RhB-afval met actieve kool25 voordat u het als algemeen afvalwater afgeeft. Gooi vast RhB-afval (muggen gemarkeerd met RhB, papieren handdoeken en lonten gedrenkt met RhB) weg als chemisch afval. Trek standaard PBM's aan bij het hanteren van RhB-afval.
Representative Results
w AlbB-SG is een gelokaliseerde (Singapore) Ae. aegypti-lijn die stabiel is geïnfecteerd met de wAlbB-stam van Wolbachia. Met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, evalueerden we de mannelijke paringsconcurrentiekracht van een inteelt en een gekruiste lijn van wAlbB-SG om te bepalen of inteelt resulteert in een verlies van mannelijke paringsfitheid. De inteeltlijn was 11 generaties lang in het insectarium gehandhaafd, terwijl de uitgekruiste lijn werd gegenereerd door de vrouwtjes terug te kruisen met wildtype mannelijke Ae. aegypti. Mannetjes uit de inteelt en outcrossed lijnen werden tegen elkaar beconcurreerd voor paring met wild-type wild-type vrouwtje Ae. aegypti. De paringsconcurrentietest werd in drievoud uitgevoerd.
De resultaten gaven aan dat RhB geen invloed had op de fitheid van de mannetjes, aangezien de gegevens voor vrouwelijke inseminatie niet gericht waren op of tegen paring met RhB-sucrose-gevoede mannetjes (Tabel 1 en figuur 6) Aangezien RhB de paringsgeschiktheid van de mannetjes niet beïnvloedt, gaan we verder met het analyseren van de gegevens op basis van het percentage geïnsemineerde vrouwtjes dat wordt gedekt door de inteelt- of uitgekruiste lijn (Tabel 2 en figuur 7). Het resultaat over de experimentele drievoud was consistent; er was een significant hoger percentage vrouwtjes gepaard met de outcross mannetjes dan met de inteelt mannetjes in alle drie de replicaties (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Deze resultaten suggereren een mogelijk verlies van mannelijke paringsfitheid na verschillende generaties inteelt in het laboratorium.
Figuur 1: Zijdelings beeld van mannetje (links) en vrouwtje (rechts) Aedes aegypti poppen. Onder dezelfde opvoedingsomstandigheden kan Ae. aegypti in het popstadium worden gesekseerd op basis van grootte; mannetjes zijn aanzienlijk kleiner dan vrouwtjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Differentiatie van mannelijke (links) en vrouwelijke (rechts) Aedes aegypti volwassenen. Volwassen mannelijke muggen (links) hebben bossigere en harigere antennes dan het volwassen vrouwtje; de rode pijlen geven de antennes aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Rhodamine B markering van mannelijke mug. (A) Lichte microscopie; (B) fluorescentiemicroscopie. De mug aan de linkerkant is ongemarkeerd (gevoed met 10% w / v sucrose), terwijl die aan de rechterkant is gemarkeerd (gevoed met 0,2% RhB-sucrose). Gemarkeerde muggen hebben een zichtbare roze buik onder wit licht (de mug rechts in A), die feloranje fluoresceert onder fluorescentiemicroscopie (B). Schaalbalken = 5 mm. Afkorting: RhB = Rhodamine B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Geïnsemineerde en niet-geïnsemineerde vrouwelijke spermathecae onder een samengestelde lichtmicroscoop (100x vergroting). De inseminatiestatus van een vrouwelijke mug kan worden bepaald door zijn spermathecae te observeren onder een samengestelde lichtmicroscoop. Een geïnsemineerde vrouwelijke mug zal ten minste één gevulde spermatheca bevatten, terwijl alle drie de spermathecae van een niet-geïnsemineerde vrouwelijke mug leeg zullen zijn. Draadachtig, beweeglijk sperma zal zichtbaar zijn in een gevulde spermatheca onder een samengestelde lichtmicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vrouwelijke muggenspijsthecae geïnsemineerd met zaadvloeistoffen onder een fluorescentie stereomicroscoop. (A) RhB-gemarkeerde en (B) ongemarkeerde spermathecae geïnsemineerd met RhB-gemarkeerde zaadvloeistoffen fluoresceren feloranje onder fluorescentiemicroscopie. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Aantal in het wild levende vrouwtjes geïnsemineerd door de inteelt- of outcross-mannetjes in de experimentele drievoud met wederzijdse markering. (A) De inteeltmannetjes werden gemarkeerd met RhB terwijl de outcross-mannetjes ongemarkeerd waren. (B) De outcross mannetjes werden gemarkeerd met RhB terwijl de inteelt mannetjes ongemarkeerd waren. Een hoger aantal vrouwtjes werd waargenomen om te hebben gepaard met outcross mannetjes, ongeacht hun markeringsstatus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Aandeel geïnsemineerde vrouwtjes gepaard met inteelt- of outcross-mannetjes in de 3 experimentele replicaties. Voor elke experimentele replicaat is er een significant hoger percentage vrouwtjes dat gepaard is met de outcross-mannetjes (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Dissectie van vrouwelijke Aedes aegypti voor spermathecae onder een lichtstereomicroscoop. Klik hier om deze video te downloaden.
| ♀ x Inteelt (RhB) ♂ een | ♀ x Outcross (ongemarkeerd) ♂ b | ♀ x Inteelt (ongemarkeerd) ♂ c | ♀ x Outcross (RhB) ♂ d | Totaal inseminatiepercentage (a+b+c+d/120) |
|
| Repliceren 1 | 11 | 35 | 7 | 40 | 77.5% (93/120) |
| Repliceren 2 | 6 | 29 | 8 | 31 | 61.7% (74/120) |
| Repliceren 3 | 6 | 36 | 6 | 33 | 67.5% (81/120) |
Tabel 1: Aantal vrouwtjes gepaard met RhB-gemarkeerde en ongemarkeerde metAlbB-Sg Aedes aegypti inteelt en outcross mannetjes. Een totaal aantal van 120 vrouwtjes werden gebruikt in elke replica.
| Percentage geïnsemineerde vrouwen | ||
| Inteelt mannetjes | Outcross reuen | |
| Repliceren 1 | 19% (18/93) | 81% (75/93) |
| Repliceren 2 | 19% (14/74) | 81% (60/74) |
| Repliceren 3 | 15% (12/81) | 85% (69/81) |
Tabel 2: Percentage geïnsemineerde vrouwtjes gepaard met albB-Sg Aedes aegypti inteelt en outcross mannetjes.
Aanvullende figuur S1: Vergelijking van de workflow voor rhb-gebaseerde en conventionele paring concurrentievermogen assay. In vergelijking met de conventionele paringsconcurrentietest, vermindert de vereenvoudigde en verkorte workflow voor rhb-gebaseerde paringsconcurrentietest de experimentele duur aanzienlijk. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Kaplan Meier overlevingscurven van mannelijke volwassen Aedes aegypti tijdens en na het voeden met 0,2% en 0,4% rhodamine B-sucrose voeding. Procentuele overleving van (A) mannelijke wild-type en (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti tijdens en na drie dagen voeden met 0,2% en 0,4% RhB-sucrose, vergeleken met controles die alleen met sucrose werden gevoed. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Inseminatiesnelheid van vrouwtjes in een kooi van B 60 cm x D 60 cm x H 60 cm (verhouding van 10 vrouwtjes tot 20 mannetjes) op tijdstippen van 1, 2 en 3 uur. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Markering wordt vaak gebruikt in entomologisch onderzoek om de dynamiek, verspreiding, gedrag en paringsbiologie van insectenpopulaties te bestuderen26. In SIT- en IIT-programma's wordt markering uitgevoerd om de vrijgavestam te onderscheiden van de veldpopulatie om hun verspreiding te bestuderen en de afgifteverhouding te optimaliseren. De gebruikte markeringsmethoden omvatten genetische markering27,28,het opnemen van isotopen in larvaal voedsel29,30,fluorescerend stof31en kleurstof32. Voor de onderdrukking van muggenpopulaties met behulp van SIT of IIT, waarbij mannelijke paringsfitness een cruciaal onderdeel is, zijn fluorescerende kleurstoffen gebruikt als markers om de biologie van de paring van muggen te bestuderen18,19.
Conventioneel is de beoordeling van het mannelijke paringsconcurrentievermogen van de vrijgavestam beoordeeld met behulp van vrouwelijke vruchtbaarheidstests. Deze test is echter tijdrovend en arbeidsintensief vanwege downstream experimentele processen na de paring(aanvullende figuur S1). Deze processen omvatten bloedvoeding van de vrouwtjes, het verzamelen van eieren, het uitkomen van de eieren en het opsommen van het aandeel uitgekomen eieren om de levensvatbaarheid van het ei te bepalen. Gemiddeld vereist deze test 30 manuren en twee weken experimenteel werk (te beginnen met het opzetten van de concurrentievermogenstestkooien) tot de uiteindelijke bepaling van de mannelijke paringsconcurrentie.
zijn paper presenteert het gebruik van een fluorescerende kleurstof, RhB, (gevoed als 0,2% RhB-sucrose aan de muggen, aanvullende figuur S2) om paringsinteracties tussen vrouwtjes en RhB-gemarkeerde mannetjes direct te meten. Hoewel dit protocol een fluorescentie-stereomicroscoop vereist, voorkomt het de noodzaak om de hierboven genoemde tijdrovende experimentele procedures uit te voeren. Gemiddeld heeft deze op RhB gebaseerde test ongeveer 10 manuren en ongeveer een dag nodig om gegevens te verkrijgen die gelijkwaardig zijn aan die van vrouwelijke vruchtbaarheidstests. Dit > 90% tijdsbesparing stelt onderzoekers in staat om meerdere experimentele replicaties uit te voeren, wat een robuustere validatie van mannelijke paringsfitness oplevert. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de paringsconcurrentie tussen twee steriele of wolbachia-geïnfecteerde muggenlijnen te vergelijken.
Dit type vergelijking is niet mogelijk met conventionele vrouwelijke vruchtbaarheidstests, omdat vrouwtjes niet-levensvatbare eieren zouden opleveren bij paring met beide lijnen. Desondanks zal elke gemengde paring in het experiment resulteren in vertekening ten opzichte van de gemarkeerde populatie, omdat het moeilijk is om ongemarkeerde spermacellen in vrouwelijke spermathecae te identificeren die zaadvloeistof bevatten van zowel RhB-gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes. Een vergelijkbare conclusie werd getrokken in een onderzoek naar de paringsconcurrentie van Anopheles gambiae met rhB18, waarbij een groter deel van de vrouwtjes in de paringstest werd gedekt door gemarkeerde mannetjes. Omdat polyandrie vaker voorkomt bij vrouwtjes die eerder een onderbroken paring hadden uitgevoerd33, werd de kans dat dit zou gebeuren in deze studie verminderd door minder muggen (20 mannetjes tot 10 vrouwtjes) te gebruiken in een groter kooivolume (0,216 m3) in deze experimenten.
De resultaten toonden geen voorkeur voor de RhB-gemarkeerde populatie, wat aangeeft dat gemengde paring beperkt was. Samenvattend is de opname van RhB om mannetjes te markeren in een paringsconcurrentietest een economische en snelle manier om de mannelijke paringsgeschiktheid te evalueren. Deze methode maakt ook de directe vergelijking mogelijk van paringsconcurrentievermogen tussen mannetjes die zijn blootgesteld aan verschillende doses bestraling, grootgebracht in verschillende opfokregimes of die zijn geïnfecteerd met verschillende stammen van Wolbachia, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor de evaluatie van mannelijke paringsfitness voor elk op mannelijke vrijlating gebaseerd muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door het National Environment Agency (NEA), Singapore. We bedanken de heer Chew Ming Fai, Deputy Chief Executive Officer (Public Health), NEA, voor zijn goedkeuring om de studie te publiceren, en A / Prof Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, voor haar steun in deze studie. We bedanken ook Dr Shuzhen Sim en Dr Denise Tan voor het proeflezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
| Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
| Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
| Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
| 6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
| Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
| Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
| Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
| TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |
References
- Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655 (2015).
- Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964 (2015).
- Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194 (2015).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
- Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
- Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 6 (2009).
- Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357 (2019).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4 (2009).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124 (2017).
- Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
- Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864 (2016).
- Fried, M. Determination of sterile-insect competitiveness. Journal of Economic Entomology. 64 (4), 869-872 (1971).
- Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236 (2020).
- Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902 (2017).
- Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5 (2006).
- Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
- Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
- South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
- Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
- Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85 (2019).
- Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921 (2018).
- Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
- Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
- Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
- Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).
