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Biology

फ्लोरोसेंट डाई, रोडामाइन बी का उपयोग करना, पुरुष एडीज एजिप्टी मच्छरों में संभोग प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए

Published: May 7, 2021 doi: 10.3791/62432
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके पुरुष एडीज एजिप्टी की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मादा मच्छरों को मैथुन के लिए चिह्नित और अचिह्नित दोनों पुरुषों के संपर्क में आता है। संभोग के बाद, उनके शुक्राणुओं की जांच फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत की जाती है ताकि उनके संभोग साथी का निर्धारण किया जा सके।

Abstract

बाँझ या असंगत कीट तकनीक आधारित जनसंख्या दमन कार्यक्रमों की सफलता जारी पुरुषों की क्षमता पर निर्भर करता है जंगली प्रकार की महिलाओं के लिए प्रतिस्पर्धा करने और लक्ष्य आबादी में बांझपन प्रेरित । इसलिए, क्षेत्र रिलीज से पहले रिलीज तनाव की फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा का प्रयोगशाला मूल्यांकन आवश्यक है। परंपरागत रूप से, इस तरह की परख मादाओं द्वारा उत्पादित व्यवहार्य अंडों के अनुपात का निर्धारण करके किया जाता है, जो एक साथ पुरुषों के दो सेट (जंगली-प्रकार और रिलीज उपभेदों) के संपर्क में मैथुन के लिए होता है। हालांकि, यह प्रक्रिया अंडे के उत्पादन के लिए महिलाओं को पहले रक्त-फ़ीड करने की आवश्यकता के कारण समय लेने वाली और श्रमसाध्य है और फिर अंडे की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची अंडे को हैच और गणना करती है।

इसके अलावा, यह विधि दो बाँझ या वुबाचिया-संक्रमितमच्छर लाइनों के बीच प्रतिस्पर्धा की डिग्री को नहीं समझ सकती है क्योंकि जंगली प्रकार की मादा मच्छर केवल दोनों के साथ संभोग पर गैर-व्यवहार्य अंडे का उत्पादन करेंगे। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, यह पेपर फ्लोरोसेंट डाई, रोडामाइन बी (आरएचबी) का उपयोग करके प्रयोगशाला सेटिंग्स में पुरुष मच्छर संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता को मापने की अधिक प्रत्यक्ष विधि का वर्णन करता है, जिसका उपयोग आरएचबी युक्त सुक्रोज समाधान में खिलाकर पुरुषों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। संभोग परख के बाद, मादा के शुक्राणुओं में फ्लोरेस्किंग शुक्राणुओं की उपस्थिति का उपयोग उसके संभोग साथी को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि लागत प्रभावी है, प्रायोगिक समय को 90% तक कम कर देती है और दो बाँझ या वुबाचिया-संक्रमित लाइनों के बीच संभोग फिटनेस की तुलना की अनुमति देती है।

Introduction

एडीज मच्छरों की आबादी के दमन के लिए बाँझ या असंगत पुरुषों के पालन और रिहाई वर्तमान में डेंगू और अन्य एडीजजनित रोग के प्रकोप को रोकने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में क्षेत्र में मूल्यांकन किया जा रहा है1। वर्तमान में क्षेत्र परीक्षणों में पुरुष-रिलीज दमन रणनीतियों में आनुवंशिक विधि2,विकिरण (बाँझ कीट तकनीक, एसआईटी)3,एंडोसिमियोटिक बैक्टीरिया वुलबाचिया (कीट असंगत तकनीक, आईआईटी)4,या बाद की दो तकनीकों का संयोजन5,6का उपयोग शामिल है। इन दृष्टिकोणों की सफलता काफी हद तक जारी किए गए पुरुषों की जंगली प्रकार के पुरुषों को मात देने और मैथुन सुरक्षित करने के लिए महिलाओं की तलाश करने की क्षमता पर निर्भर करती है। अन्यथा, लक्षित जनसंख्या में बंध्यता को प्रेरित नहीं किया जा सकता है।

उदाहरण के लिए, एक शास्त्रीय एसआईटी कार्यक्रम में, पुरुष संभोग फिटनेस विकिरण खुराक7, 8, 9,बड़े पैमाने पर पालन प्रोटोकॉल और कॉलोनी10, 11,12,13,14 जैसे कारकों से प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, संभोग प्रतिस्पर्धा पर अध्ययन मच्छर संभोग व्यवहार पर महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान कर सकते हैं जिसका उपयोग वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों को सूचित करने के लिए किया जा सकता है।

एसआईटी और आईआईटी में, पुरुष मच्छरों की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का आकलन आम तौर पर जंगली प्रकार दोनों की अनुमति देकरऔर एक पिंजरे8,11, 15, 16में जंगली प्रकार की महिलाओं के लिए प्रतिस्पर्धा करने के लिए तनाव जारी करकेकिया जाताहै। महिलाओं को तब रक्त-खिलाया जाता है और उनके अंडे व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची जाती हैं। महिलाओं कि कम हैच दर के साथ गैर व्यवहार्य अंडे या अंडे रखना रिलीज तनाव पुरुषों के साथ संभोग किया है माना जाता है, जबकि महिलाओं कि व्यवहार्य अंडे का उत्पादन जंगली प्रकार के पुरुषों के साथ संभोग किया है माना जाता है । इसके बाद तला हुआ सूचकांक17के साथ संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की गणना की जाती है । दुर्भाग्य से, यह विधि संसाधन-प्रधान और समय लेने वाली है, और समग्र फ्राइड इंडेक्स को बाहरी भ्रामक कारकों से प्रभावित किया जा सकता है जैसे कि खराब अंडे से निपटने और अधिक-desiccation के परिणामस्वरूप अनुकूलता क्रॉस में कम हैच दर हो सकती है जो तब कृत्रिम रूप से कम फ्राइड इंडेक्स का कारण बन सकती है।

इसके अलावा, यह विधि एडीज मच्छरों के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की सीधी तुलना के लिए अनुमति नहीं देती है जो वुबाचिया के विभिन्न उपभेदों से संक्रमित हैं या जो विकिरण की विभिन्न खुराकों के संपर्क में हैं। इसलिए, इन चुनौतियों से निपटने के लिए एक और प्रत्यक्ष विधि की आवश्यकता है । हाल के अध्ययनोंमें 18,19 ने नर मच्छरों के मौलिक तरल पदार्थ को चिह्नित करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई, आरएचबी का उपयोग करने की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है। चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ को सफल संभोग पर मादा मच्छरों के शुक्राणुओं में स्थानांतरित और संग्रहित किया जाता है, जिससे चिह्नित पुरुषों के साथ मादा संभोग बातचीत की प्रत्यक्ष माप की अनुमति होती है। रोडामाइन बी एक थिओल-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोन डाई है जो आमतौर पर कीड़े 20 सहित जानवरों में पारिस्थितिक और व्यवहार अनुसंधान अध्ययन के लिए बायोमार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। मच्छरों के अध्ययन के लिए, आरएचबी को चीनी या शहद के पानी के साथ भोजन करके पेश किया जाता है जिसमें घुलित आरएचबी पाउडर18,19,21,22,23, 24होता है। तेज होने पर, आरएचबी डाई प्रोटीन के लिए बांधता है, एक लाल-गुलाबी दाग के साथ शरीर के ऊतकों को धुंधला करता है जो फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के तहत उज्ज्वल नारंगी को फ्लोरेस्स्क करता है।

मार्किंग के मजबूत फ्लोरेसेंस सिग्नल और स्थिरता, कीट मौलिक तरल पदार्थों को दागने की क्षमता के साथ, लेबल किए गए पुरुष से मादा कीट के शुक्राणु भंडारण अंगों को चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ के हस्तांतरण की निगरानी के लिए अनुमति देताहै। एक पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा परख में RhB का उपयोग न केवल चिह्नित और अचिह्नित पुरुषों के साथ महिलाओं के संभोग बातचीत के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है, लेकिन परिणाम भी 24 घंटे के भीतर प्राप्त किया जा सकता है के रूप में यह अंडा व्यवहार्यता है, जो आम तौर पर लगभग 10 से 14 दिनों की आवश्यकता का निर्धारण करने की प्रक्रिया को obviates । इसके अलावा, यह विधि डेटा के संभावित नुकसान पर काबू पा जाती है जब मादा मच्छर रक्त-फ़ीड नहीं करते हैं या अंडाशय से पहले मर जाते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अर्ध-क्षेत्र परीक्षणों में, जहां मादा मच्छरों को बैग या यांत्रिक एस्पिरेटर का उपयोग करके पोस्ट-संभोग संग्रह के दौरान नुकसान और मौत का खतरा होता है। मादा प्रजनन क्षमता का उपयोग करने की वर्तमान सीमाओं को संबोधित करने के लिए हम एक वैकल्पिक विधि पेश करते हैं जो सीधे पुरुष मच्छर संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता को मापने के लिए आरएचबी धुंधला का उपयोग करता है। विधि कार्यप्रवाह को सरल बनाता है, प्रयोगात्मक समय को लगभग दो सप्ताह से एक दिन तक छोटा कर देता है, जिससे अधिक प्रयोगात्मक प्रतिकृति को बाहर किया जा सकता है और दो रिलीज उपभेदों के बीच तुलना की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल उन प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त होगा जो पुरुष रिलीज-आधारित मच्छर जनसंख्या दमन कार्यक्रमों पर तैयार कर रहे हैं, और नियमित गुणवत्ता नियंत्रण और तनाव मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Protocol

1. मच्छरों का पालन

  1. 12 घंटे:12 घंटे प्रकाश के फोटोपीरियोड के साथ, 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस और 75-80% सापेक्ष आर्द्रता की मानक कीटनाशक स्थितियों के तहत सभी मच्छर पालन और पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता परख का संचालन करें।
  2. इस पेपर में वर्णित पद्धति में आसान संदर्भ के लिए सेट ए और सेट बी के रूप में प्रतिस्पर्धी पुरुषों के दो सेट नामित करें। परख के दौरान उनकी फिटनेस की उचित तुलना सुनिश्चित करने के लिए मानकीकृत परिस्थितियों में मच्छरों को पीछे करें। मच्छरों को 2 एल पानी में 500 लार्वा के लार्वा घनत्व पर पीछे करें और उन्हें ग्राउंड फिश फूड पाउडर विज्ञापन लिबिटमके साथ खिलाएं।
    नोट: प्रतिनिधि परिणामों की पीढ़ी के लिए, सेट ए और सेट बी वुलबाचिया-संक्रमितएई के inbred और outcross पुरुषों थे । क्रमशः एजिप्टी।
  3. प्यूपल चरण में सेक्स पुरुष और मादा मच्छर, और उन्हें पिंजरों में अलग से शामिल करें (सामग्री की मेजदेखें) आयाम W 32.5 सेमी x D 32.5 सेमी x H 32.5 सेमी, 150 x 150 और 160 माइक्रोन एम अपर्चर के जाल आकार के साथ। 10% सुक्रोज समाधान के साथ सभी वयस्क मच्छरों को बनाए रखें।

2. पुरुष और मादा मच्छरों की तैयारी

  1. अपने आकार के अंतर के अनुसार प्यूपल चरण में पुरुष और मादा मच्छरों को सेक्स करें (पुरुष पिल्ले मादा पिल्ले से छोटे हैं)(चित्रा 1)।
  2. मच्छरों के प्रत्येक सेट (सेट ए या सेट बी) के लिए, सुक्रोज फीडिंग या आरएचबी-सुक्रोज फीडिंग के लिए प्रत्येक को प्रीलेबेल्ड पिंजरे में स्थानांतरित करें।
  3. मादा प्यूप को 40-50 प्रति पिंजरे के छोटे बैचों में रखें। इमागो के उद्भव पर, पुरुष मच्छरों की उपस्थिति के लिए पिंजरों की जांच करें।
    नोट: वयस्क पुरुष मच्छर मादाओं की तुलना में छोटे होते हैं और इसमें बुशियर और हेयरियर एंटीना(चित्रा 2) होता है। संभोग प्रतिस्पर्धा परख के लिए केवल कुंवारी मादा मच्छरों का उपयोग करें। पूर्व-गर्भाधानित महिलाओं का उपयोग सभी परिणामी डेटा को अमान्य कर देगा। इस प्रकार, पिल्ला चरण में सेक्सिंग के दौरान अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए। नर मच्छरों से दूषित हुए पिंजरे से मादा मच्छरों का इस्तेमाल न करें। महिलाओं के अतिरिक्त पिंजरे तैयार किए जाने चाहिए।

3. 0.2% आरएचबी की तैयारी - सुक्रोज समाधान

नोट: आरएचबी सूखे रूप में एक हरे रंग का पाउडर है और समाधान में लाल-गुलाबी है। इस रसायन को संभालते समय मानक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई: प्रयोगशाला संरक्षण गाउन, नाइट्रिल दस्ताने और आंखों की सुरक्षा) पहना जाएगा। साँस लेने से बचने के लिए, एक धुएं हुड में आरएचबी पाउडर का वजन करें।

  1. 0.2% डब्ल्यू/वी आरएचबी-सुक्रोज समाधान तैयार करने के लिए, 10% w/v/सुक्रोज समाधान के प्रत्येक 100 एमएल के लिए 200 मिलीग्राम आरएचबी पाउडर को भंग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं कि सभी पाउडर भंग हो गए हैं।
    नोट: के रूप में RhB प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, एंबर बोतलों का उपयोग करें, या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पूरी तरह से स्पष्ट बोतलों लपेटो ।

4. नर मच्छरों का भोजन

नोट: आरएचबी-सुक्रोज फीडिंग ऑप्टिमाइजेशन से डेटा पूरक सामग्री, धारा 1में प्रस्तुत किया गया है।

  1. एक बाती के साथ 20 चीनी फीडर बोतलें तैयार करें। अन्य 10 फीडर बोतलों में 10% सुक्रोज के 10 एमएल और अन्य 10 फीडर बोतलों में 0.2% आरएचबी-सुक्रोज समाधान के 10 एमएल जोड़ें (एम्बर बोतलों का उपयोग करें, या एल्यूमीनियम पन्नी में बोतलों को लपेटें)।
  2. फीडर की बोतलों को संबंधित पुरुष पिंजरों (5 बोतल प्रति पिंजरे) में रखें जो चरण 2.2 और 2.3 में तैयार किए गए हैं। संभोग प्रयोग से पहले पुरुष मच्छरों को तीन दिन तक खिलाने की अनुमति दें।

5. पुरुष मच्छरों में आरएचबी फ्लोरेसेंस के लिए जांच

  1. एस्पिरेट RhB-सुक्रोज-खिलाया पुरुष मच्छरों, और उन्हें एक फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी RhB-सुक्रोज खिलाया पुरुष मच्छरों सफलतापूर्वक RhB के साथ चिह्नित किया गया है ।
  2. मर्करी बर्नर लैंप और स्टीरियो माइक्रोस्कोप चालू करें। पारा बर्नर लैंप के प्रकाश स्रोत को 10 मिनट तक स्थिर होने दें। लाल फ्लोरेसेंस प्रोटीन 1 (आरएफपी1) (उत्तेजन तरंगदैर्ध्य 540 एनएम, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 625 एनएम) के लिए फ्लोरेसेंस फिल्टर सेट करें।
  3. मौखिक एस्पिरेटर की कांच की ट्यूब में एक समय में मच्छरों (चार या पांच) की एक छोटी संख्या को एस्पिरेट करें। कांच की ट्यूब के माध्यम से, फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत नर मच्छरों के शरीर का निरीक्षण करें। प्रयोग से आरएचबी के साथ चिह्नित नहीं नर मच्छरों को बाहर करें।
    नोट: आरएचबी के साथ चिह्नित पुरुष मच्छरों का पेट सफेद प्रकाश(चित्रा 3 ए)के नीचे गुलाबी दिखाई देगा और फ्लोरोसेंट प्रकाश(चित्रा 3B)के तहत उज्ज्वल नारंगी चमक जाएगा।
  4. स्थानांतरण जाल के साथ सुरक्षित 12 कागज कप में एक पुरुष मच्छरों सेट (जाल आकार 150 x 150, 160 माइक्रोन अपर्चर); 6 कप प्रत्येक 10 सुक्रोज-फेड नर मच्छरों के साथ और अन्य 6 कप प्रत्येक 10 आरएचबी-सुक्रोज-फेड नर मच्छरों के साथ । सेट बी नर मच्छरों के लिए इस कदम को दोहराएं।

6. संभोग प्रतिस्पर्धा परख

  1. संभोग परख के लिए जाल आकार 44 x 32, 650 माइक्रोन अपर्चर के साथ 12 डब्ल्यू 60 सेमी एक्स डी 60 सेमी एक्स एच 60 सेमी पिंजरों की स्थापना करें। छह पिंजरों में से प्रत्येक में, 10 सेट ए (आरएचबी-चिह्नित) पुरुष मच्छर, 10 सेट बी (अचिह्नित) नर मच्छर, और 10 कुंवारी जंगली प्रकार की मादा मच्छर शामिल हैं। अन्य छह पिंजरों में 10 सेट ए (अचिह्नित) नर मच्छर, 10 सेट बी (आरएचबी-चिह्नित) नर मच्छर, और 10 कुंवारी जंगली प्रकार की मादा मच्छर शामिल हैं । इन पिंजरों को स्पष्ट रूप से दो संभोग संयोजनों के बीच अंतर करने के लिए लेबल करें।
    नोट: अनुभव के आधार पर, एक 60 सेमी x 60 सेमी x 60 सेमी पिंजरे संभोग परख के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में एक छोटे पिंजरे मिश्रित संभोग को प्रोत्साहित कर सकते हैं।
  2. चरण 6.1 में लेबल के अनुसार संभोग पिंजरों में चरण 5.4 में तैयार पुरुषों के संबंधित कप रखें। जाल निकालें और धीरे से कप से बाहर पुरुषों झटका करने के लिए कप नल । ध्यान से कागज कप और पिंजरे से जाल को हटाने के लिए कोई मच्छर पिंजरे से बचने सुनिश्चित करने के लिए । नर मच्छरों को कम से कम एक घंटे के लिए संभोग पिंजरे में स्वीकार करने की अनुमति दें।
  3. मौखिक एस्पिरेटर का उपयोग करके, कुंवारी जंगली प्रकार की मादा मच्छरों को 12 पेपर कप में स्थानांतरित करें, जिसमें प्रत्येक कप में 10 मच्छर होते हैं।
  4. नर मच्छरों के लिए अभिनंदन अवधि के बाद, हर संभोग पिंजरे में एक कप मादाओं को स्थानांतरित करें और जाल को हटा दें। कप से बाहर किसी भी शेष मादा मच्छरों को प्रोत्साहित करने के लिए कप को धीरे से झटका दें। ध्यान से कागज कप और पिंजरे से जाल को हटाने के लिए कोई मच्छर पिंजरे से बचने सुनिश्चित करने के लिए ।
  5. संभोग को 3 घंटे के लिए होने दें।
    नोट: अनुशंसित संभोग अवधि जंगली प्रकार एई. एजिप्टीके पूर्व अवलोकनों के माध्यम से निर्धारित की गई थी । 10 महिलाओं और 20 पुरुषों को शामिल प्रयोगों में एक ६० सेमी x ६० सेमी x ६० सेमी पिंजरे में आयोजित किया जा रहा है, ९०% महिला गर्भाधान 3 घंटे में प्राप्त किया गया था(पूरक सामग्री, धारा 2)। इस अवधि के दौरान पिंजरे को परेशान न करें क्योंकि आंदोलन बाधित और मिश्रित संभोग का कारण बन सकता है। मिश्रित संभोग (जहां मादा ने चिह्नित और अचिह्नित दोनों पुरुषों के साथ संभोग किया है) के परिणामस्वरूप आरएचबी-चिह्नित पुरुषों के प्रति पूर्वाग्रह होता है क्योंकि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत आरएचबी-चिह्नित शुक्राणुओं से अचिह्नित शुक्राणुओं को अलग करना मुश्किल होता है।
  6. संभोग प्रयोग को समाप्त करने के लिए, एक यांत्रिक एस्पिरेटर का उपयोग करके प्रत्येक पिंजरे से सभी मच्छरों को हटा दें। ठंड कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर मच्छरों को एनेस्थेटाइज करें। जब मच्छरों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, तो धीरे-धीरे मादा मच्छरों को उठाएं और उन्हें जाल (जाल आकार 150 x 150, 160 माइक्रोन अपर्चर) के साथ सुरक्षित एक अलग पेपर कप में घर दें। पेपर कप पर संभोग पिंजरे से संबंधित लेबल स्थानांतरित करके कागज कप लेबल।
    नोट: इस बिंदु पर प्रयोग को थामने और 10% सुक्रोज समाधान के साथ महिलाओं को बनाए रखना संभव है। आरएचबी-चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ कम से एक सप्ताह के लिए महिला शुक्राणुओं के अंदर स्थिर रहेगा । विच्छेदन से पहले महिलाओं को जीवित रखना सबसे अच्छा है क्योंकि मृत और डिसिकेटेड नमूनों को विच्छेदन करना मुश्किल है।
  7. मादा शुक्राणुओं को स्कोर करने के लिए, ठंडे मच्छरों को स्टीरियो माइक्रोस्कोप(वीडियो 1)के तहत विच्छेदन से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर एनेस्थेटाइज करें। उनके गर्भाधान की स्थिति(चित्रा 4)के लिए एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप (आवर्धन 100x) के तहत शुक्राणुओं की जांच करें । गर्भाधान करने वाले व्यक्तियों के लिए, यह निर्धारित करें कि शुक्राणुओं में आरएफपी1 फिल्टर और कैमरा इमेजिंग सिस्टम से लैस फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत उनकी जांच करके आरएचबी-चिह्नित मौलिक तरल पदार्थ होते हैं या नहीं।
    नोट: एक संलग्न इमेजिंग सिस्टम के साथ फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए लंबे समय तक एक्सपोजर समय (5 एस) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि मादा मच्छर एक चिह्नित पुरुष के साथ संभोग कर चुकी है, तो उसके शुक्राणुएं उज्ज्वल नारंगी(चित्रा 5A)को फ्लोरेसे करेंगे। हालांकि, अगर मादा मच्छर एक अचिह्नित पुरुष के साथ संभोग किया है, तो उसके गर्भाधान शुक्राणु फ्लोरेसेस(चित्रा 5B)नहीं होंगे।

7. आरएचबी कचरे का निपटान

  1. सामान्य अपशिष्ट-जल के रूप में निर्वहन करने से पहले सक्रिय कार्बन25 के साथ जलीय आरएचबी अपशिष्ट का इलाज करें। रासायनिक कचरे के रूप में ठोस आरएचबी कचरे (आरएचबी, पेपर तौलिए और आरएचबी से लथपथ बाती के साथ चिह्नित मच्छरों) का निपटान करें। आरएचबी कचरे को संभालते समय मानक पीपीई करें।

Representative Results

डब्ल्यू अल्ब्ब-एसजी एक स्थानीयकृत (सिंगापुर) एई. एजिप्टी लाइन है जो वुब्ब तनाव से संक्रमित है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने एक inbred की पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता और डब्ल्यूएएलबीबी-एसजी की एक आउटक्रॉस लाइन का मूल्यांकन किया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि पुरुष संभोग फिटनेस में नुकसान में इनब्रीडिंग परिणाम होते हैं या नहीं। इनस्ल लाइन को कीट में 11 पीढ़ियों के लिए बनाए रखा गया था, जबकि आउटक्रॉस लाइन को जंगली प्रकार के पुरुष एई के साथ महिलाओं को बैकक्रॉस करके उत्पन्न किया गया था। एजिप्टी। इनस्ल और आउटक्रॉस लाइनों के पुरुषों को जंगली प्रकार की जंगली प्रकार की मादा एई. एजिप्टीके साथ संभोग के लिए एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की गई थी। समागम प्रतिस्पर्धा परख ट्रिपलीकेट में आयोजित की गई थी ।

परिणामों से संकेत मिलता है कि RhB पुरुषों की फिटनेस को प्रभावित नहीं किया क्योंकि महिला गर्भाधान के लिए डेटा के प्रति या आरएचबी-सुक्रोज-फेड पुरुषों(तालिका 1 और चित्रा 6)के साथ संभोग के खिलाफ पक्षपाती नहीं था क्योंकि आरएचबी पुरुषों की संभोग फिटनेस को प्रभावित नहीं करता है, हम या तो इनब्रीड या आउटक्रॉस्ड लाइन(टेबल 2 और चित्रा 7)द्वारा संभोग किए गए महिलाओं के प्रतिशत के आधार पर डेटा का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ते हैं । प्रायोगिक त्रिपिकों में परिणाम लगातार थे; सभी तीन प्रतिकृति (पी ≤ ०.०५, मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) में inbred पुरुषों के साथ की तुलना में आउटक्रॉस पुरुषों के साथ महिलाओं का एक काफी अधिक प्रतिशत था । इन परिणामों प्रयोगशाला में प्रजनन की कई पीढ़ियों के बाद पुरुष संभोग फिटनेस में एक संभावित नुकसान का सुझाव देते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:पुरुष (बाएं) और महिला (दाएं) एडीज एजिप्टी पिल्ले का पार्श्व दृश्य। एक ही पालन शर्तों के तहत, एई. एजिप्टी को आकार के अनुसार पुपल चरण में सेक्स किया जा सकता है; नर महिलाओं की तुलना में काफी छोटे होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:पुरुष (बाएं) और महिला (दाएं) एडीज एजिप्टी वयस्कों का भेदभाव। वयस्क पुरुष मच्छरों (बाएं) में वयस्क मादा की तुलना में बुशियर और हेयरियर एंटीना होता है; लाल तीर एंटीना का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:पुरुष मच्छर का रोडामाइन बी अंकन। (A)हल्की माइक्रोस्कोपी; (ख)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। बाईं ओर मच्छर अचिह्नित है (10% w/v सुक्रोज के साथ खिलाया जाता है), जबकि दाईं ओर एक चिह्नित किया जाता है (०.२% RhB-सुक्रोज के साथ खिलाया जाता है)। चिह्नित मच्छरों में सफेद प्रकाश (एमें दाईं ओर मच्छर) के नीचे एक दृश्यमान गुलाबी पेट होता है, जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(बी)के तहत उज्ज्वल नारंगी को फ्लोरेसेस करता है। स्केल बार = 5 मिमी संक्षिप्त नाम: RhB = रोडामाइन बी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप (100x आवर्धन) के तहत गर्भाधानित और गैर-गर्भाधान वाली मादा शुक्राणु। मादा मच्छर की गर्भाधान स्थिति एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत इसके शुक्राणुओं को देख कर निर्धारित की जा सकती है। एक गर्भाधान मादा मच्छर में कम से कम एक भरा शुक्राणु होगा जबकि एक गैर-गर्भाधान मादा मच्छर के तीनों शुक्राणु खाली होंगे। थ्रेड की तरह, मोटिवल स्पर्म एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे एक भरे हुए शुक्राणुओं में दिखाई देगा। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:फ्लोरोसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत मौलिक तरल पदार्थों के साथ गर्भाधान करने वाले मादा मच्छर शुक्राणु। (ए)आरएचबी-मार्क और(बी)अचिह्नित शुक्राणुओं का गर्भाधान आरएचबी-चिह्नित मौलिक तरल पदार्थों के साथ गर्भाधान फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत उज्ज्वल नारंगी होगा। स्केल बार = 100 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6:पारस्परिक अंकन के साथ प्रायोगिक ट्रिपलाइट्स में या तो इनब्रीड या आउटक्रॉस पुरुषों द्वारा गर्भाधान किए गए जंगली प्रकार की महिलाओं की संख्या ।(क)इनब्रीड पुरुषों को आरएचबी के साथ चिह्नित किया गया था जबकि आउटक्रॉस पुरुषों को अचिह्नित किया गया था । (ख) आउटक्रॉस पुरुषों को आरएचबी के साथ चिह्नित किया गया था जबकि इनब्रीड पुरुषों को अचिह्नित किया गया था । महिलाओं की एक उच्च संख्या को उनके अंकन की स्थिति की परवाह किए बिना आउटक्रॉस पुरुषों के साथ संभोग करने के लिए देखा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:3 प्रयोगात्मक प्रतिकृति में inbred या outcross पुरुषों के साथ संभोग किया गर्भाधान महिलाओं का अनुपात । प्रत्येक प्रयोगात्मक दोहराने के लिए, आउटक्रॉस पुरुषों (पी ≤ 0.05, मान-व्हिटनी यू-टेस्ट)के साथ महिलाओं का काफी अधिक प्रतिशत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: एक हल्के स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत शुक्राणुओं के लिए मादा एडीज एजिप्टी का विच्छेदन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

♀ एक्स Inbred (RhB) ♂ एक ♀ एक्स आउटक्रॉस (अचिह्नित) ♂ बी ♀ एक्स इनब्रीड (अचिह्नित) ♂ सी ♀ एक्स आउटक्रॉस (आरएचबी) ♂ डी कुल मिलाकर गर्भाधान दर
(a+b+c+d/120)
प्रतिकृति 1 11 35 7 40 77.5% (93/120)
प्रतिकृति 2 6 29 8 31 61.7% (74/120)
प्रतिकृति 3 6 36 6 33 67.5% (81/120)

तालिका 1: आरएचबी-चिह्नित और अचिह्नित डब्ल्यूअल्ब्ब-एसजी एडीज एजिप्टी इनस्ल और आउटक्रॉस पुरुषों के साथ संभोग करने वाली महिलाओं की संख्या। प्रत्येक दोहराने में कुल १२० महिलाओं का उपयोग किया गया था ।

प्रतिशत गर्भाधान महिलाओं
इनब्रीड नर पुरुषों को मात
प्रतिकृति 1 19% (18/93) 81% (75/93)
प्रतिकृति 2 19% (14/74) 81% (60/74)
प्रतिकृति 3 15% (12/81) 85% (69/81)

तालिका 2: पुरुषों को डब्ल्यूएएलबीबी-एसजी एडीज एजिप्टी इनस्लेड और आउटक्रॉस पुरुषों के साथ मिश्रित गर्भाधान करने वाली महिलाओं का प्रतिशत।

पूरक चित्रा S1: आरएचबी आधारित और पारंपरिक संभोग प्रतिस्पर्धा परख के लिए कार्यप्रवाह की तुलना। पारंपरिक संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता परख की तुलना में, आरएचबी-आधारित संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता परख के लिए सरलीकृत और छोटा कार्यप्रवाह प्रयोगात्मक अवधि को काफी कम कर देता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S2: 0.2% और 0.4% रोडामाइन बी-सुक्रोज फीडिंग के साथ खिलाने के दौरान और बाद में पुरुष वयस्क एडीज एजिप्टी के काप्लान मेयर सर्वाइवल घटता है। प्रतिशत का अस्तित्व(ए)पुरुष जंगली प्रकार और(बी) डब्ल्यूअल्ब्ब-एसजी एई. एजिप्टी के दौरान और तीन दिनों के बाद ०.२% और ०.४% आरएचबी-सुक्रोज पर खिलाया गया, नियंत्रण है कि केवल सुक्रोज के साथ खिलाया गया था की तुलना में । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका S1: डब्ल्यू 60 सेमी एक्स डी 60 सेमी एक्स एच 60 सेमी पिंजरे (10 महिलाओं से 20 पुरुषों का अनुपात) में 1-, 2-, और 3-एच समय अंक में महिलाओं की गर्भाधान दर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

Discussion

मार्किंग आमतौर पर कीट जनसंख्या गतिशीलता, फैलाव, व्यवहार, और संभोग जीव विज्ञान26का अध्ययन करने के लिए कीट विज्ञान अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । एसआईटी और आईआईटी कार्यक्रमों में, क्षेत्र की आबादी से रिहाई तनाव को अलग करने के लिए उनके फैलाव का अध्ययन करने और रिलीज अनुपात को अनुकूलित करने के लिए अंकन किया जाता है । उपयोग की जाने वाली अंकन विधियों में आनुवांशिक अंकन27,28 , लार्वा भोजन29,30, फ्लोरोसेंट डस्ट31और डाई32में आइसोटोप शामिल हैं . एसआईटी या आईआईटी का उपयोग करके मच्छरों की आबादी के दमन के लिए, जहां पुरुष संभोग फिटनेस एक महत्वपूर्ण घटक है, फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग मच्छर संभोग जीव विज्ञान18,19का अध्ययन करने के लिए मार्कर के रूप में किया गया है।

परंपरागत रूप से, रिहाई तनाव के पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा का आकलन महिला प्रजनन परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है । हालांकि, यह परख समय लेने वाली और श्रम-प्रधान है क्योंकि डाउनस्ट्रीम प्रायोगिक प्रक्रियाओं के बाद संभोग(पूरक चित्रा S1)। इन प्रक्रियाओं में मादाओं का रक्त-भोजन, अंडा संग्रह, अंडे का हैचिंग, और अंडे की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए रची अंडे के अनुपात की गणना शामिल है। औसतन, इस परख के लिए 30 मानव घंटे और दो सप्ताह के प्रायोगिक कार्य (प्रतिस्पर्धात्मकता परख पिंजरों की स्थापना से शुरू) पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा के अंतिम निर्धारण के लिए आवश्यक है ।

उनका पेपर महिलाओं और आरएचबी-चिह्नित पुरुषों के बीच संभोग बातचीत को सीधे मापने के लिए मच्छरों, पूरक चित्रा S2को सीधे मापने के लिए फ्लोरोसेंट डाई, आरएचबी, (मच्छरों को 0.2% आरएचबी-सुक्रोज के रूप में खिलाया गया) का उपयोग प्रस्तुत करता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, यह ऊपर उल्लिखित समय लेने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को करने की आवश्यकता को कम करता है। औसतन, इस RhB आधारित परख लगभग 10 आदमी घंटे की आवश्यकता है और एक दिन के बारे में महिला प्रजनन परख से है कि बराबर डेटा प्राप्त करने के लिए । यह >90% समय बचत शोधकर्ताओं को कई प्रयोगात्मक प्रतिकृति प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, पुरुष संभोग फिटनेस का अधिक मजबूत सत्यापन प्रदान करता है। इसके अलावा, इस परख का उपयोग दो बाँझ या वुलबाचिया संक्रमित मच्छरों की रेखाओं के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

पारंपरिक महिला प्रजनन परख के साथ इस प्रकार की तुलना संभव नहीं है, क्योंकि महिलाएं ऐसी दोनों पंक्तियों के साथ संभोग पर गैर-व्यवहार्य अंडे प्राप्त करेंगी।  बावजूद, प्रयोग में किसी भी मिश्रित संभोग के परिणामस्वरूप चिह्नित आबादी की ओर पूर्वाग्रह होगा क्योंकि महिला शुक्राणुओं में अचिह्नित शुक्राणुओं की पहचान करना मुश्किल है जिसमें आरएचबी-चिह्नित और अचिह्नित दोनों पुरुषों से मौलिक तरल पदार्थ होते हैं । इसी तरह का निष्कर्ष आरएचबी18का उपयोग करके एनोफेल्स गैम्बिया की संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता का आकलन करने वाले अध्ययन में किया गया था, जिसके तहत संभोग परख में महिलाओं का एक बड़ा हिस्सा चिह्नित पुरुषों द्वारा मिलाया गया था । चूंकि पॉलीएंड्री उन महिलाओं में होने की अधिक संभावना है जो पहले बाधित संभोग33में लगी थीं, इस अध्ययन में इन प्रयोगों में एक बड़े पिंजरे की मात्रा (0.216 मीटर3)में कम मच्छरों (20 पुरुषों से 10 महिलाओं) का उपयोग करके इस अध्ययन में कम किया गया था।

परिणाम RhB के प्रति कोई पूर्वाग्रह-चिह्नित जनसंख्या दिखाया, यह दर्शाता है कि मिश्रित संभोग सीमित था । संक्षेप में, एक संभोग प्रतिस्पर्धा परख में पुरुषों को चिह्नित करने के लिए RhB का समावेश पुरुष संभोग फिटनेस का मूल्यांकन करने का एक किफायती और तेजी से तरीका है । यह विधि विकिरण की विभिन्न खुराकों के संपर्क में आने वाले पुरुषों के बीच संभोग प्रतिस्पर्धात्मकता की सीधी तुलना के लिए भी अनुमति देती है, जो विभिन्न पालन व्यवस्थाओं में पाला जाता है, या वुबाचियाके विभिन्न उपभेदों से संक्रमित लोग, यह किसी भी पुरुष रिहाई-आधारित मच्छर जनसंख्या दमन कार्यक्रम के लिए पुरुष संभोग फिटनेस के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाता है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय पर्यावरण एजेंसी (एनईए), सिंगापुर द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम श्री चबाना मिंग एफएआई, उप मुख्य कार्यकारी अधिकारी (सार्वजनिक स्वास्थ्य), एनईए, अध्ययन प्रकाशित करने के लिए अपने अनुमोदन के लिए धन्यवाद, और एक/प्रो एनजी ली चिंग, समूह निदेशक (पर्यावरण स्वास्थ्य संस्थान समूह), एनईए, इस अध्ययन में उसके समर्थन के लिए । हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए डॉ शुज़ेन सिम और डॉ डेनिस टैन को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compound light microscope Olympus CX23 To score for spermathecae insemination
Dissection forceps Bioquip Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter Olympus SZX16 To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages Bugdorm 4F3030 W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture
For mating competitiveness assay
Mosquito netting 150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B Sigma Aldrich R6626 ≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope Olympus SZ61 For spermathecae dissection
Sucrose MP Biomedicals SKU 029047138 Food grade
TetraMin tropical flakes Tetra 77101 Fish food for feeding larvae

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जीव विज्ञान अंक 171 मच्छर संभोग प्रतिस्पर्धा एडीज एजिप्टी,रोडामाइन बी बाँझ कीट तकनीक वुलबाचिया,फिटनेस जनसंख्या दमन
फ्लोरोसेंट डाई, रोडामाइन बी का उपयोग करना, पुरुष <em>एडीज एजिप्टी मच्छरों</em> में संभोग प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए
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Li, I., Mak, K. W., Wong, J., Tan,… More

Li, I., Mak, K. W., Wong, J., Tan, C. H. Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes. J. Vis. Exp. (171), e62432, doi:10.3791/62432 (2021).

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