Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62438
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Experimental Teratology, Ministry of Education, Institute of Molecular Medicine and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Stem Cell and Regenerative Medicine Research Center, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2The Research Center of Stem Cell and Regenerative Medicine, Shandong University Cheeloo Medical College, School of Basic Medical Sciences, Shandong University
* These authors contributed equally

Summary

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

Abstract

הכבד הוא האיבר הגדול ביותר ביונקים. הוא ממלא תפקיד חשוב באחסון גלוקוז, הפרשת חלבונים, חילוף חומרים וניקוי רעלים. כמוציא לפועל של רוב תפקודי הכבד, להפטוציטים ראשוניים יש יכולת התפשטות מוגבלת. זה דורש הקמת מודלים להרחבת האקס ויוו הפטוצית למחקר פיזיולוגי ופתולוגי בכבד. כאן בודדנו את הפטוציטים של מורין בשני שלבים של זלוף קולגנאז וביססנו תרבות אורגנויד תלת-ממדית כ'כבד מיני 'כדי לשחזר אינטראקציות בין תאים ותפקודים פיזיים. האורגנוידים מורכבים מאוכלוסיות תאים הטרוגניות כולל אבות והפטוציטים בוגרים. אנו מציגים את התהליך בפירוט כדי לבודד ולתרבות את הפטוציטים מורין או hepatocyte עוברי כדי ליצור organoids בתוך 2-3 שבועות ולהראות כיצד להעביר אותם על ידי צינורות מכניים למעלה ולמטה. בנוסף, נציג גם כיצד לעכל את האורגנוידים לתאים בודדים לזיהום לנטיוירוס של בנייה של שרנ"א/חוץ רחמי, טרנספקטיון siRNA והנדסת CRISPR-Cas9. האורגנוידים יכולים לשמש למסכי סמים, מידול מחלות ומחקר כבד בסיסי על ידי מידול ביולוגיה של הכבד ופתוביולוגיה.

Introduction

Organoids הם מאורגנים בעצמם, תלת מימדי (3D) באשכולות במבחנה הכוללים תאי גזע מתחדשים עצמית ותאים מובחנים מרובי שושלת1,2. האורגנוידים של איברים רבים הוקמו מתאי גזע פלוריפוטנטיים או בוגרים על ידי גורמי נישה מוגדרים היטב כולל המעי, המוח, המעי הגס, הכליה, הכבד, הלבלב, בלוטת התריס, הקיבה, העור והריאה3,4,5,6,7 . האורגנוידים מסכמים מחדש את תפקודי התא הפיזי על ידי חיקוי התפתחות (שמקורה בתאי גזע עובריים או מושרים, מחשבים אישיים) או התקדמות הומאוסטזיס/התחדשות (שמקורה בתאי גזע בוגרים, ASCs), אשר פותח אפיקים חדשים במחקר מחלות וטיפול8,9.

בתור האיבר הגדול ביותר ביונקים, הכבד אחראי בעיקר לאחסון, חילוף חומרים וניקוי רעלים. שני סוגים של סוגי תאי אפיתל, hepatocytes ו cholangiocytes, לבנות את היחידה הבסיסית של lobule כבד. Hepatocytes אחראים 70-80% של תפקוד הכבד10. למרות הכבד יש יכולת התחדשות יוצאת דופן, אובדן מהיר של תכונות hepatocyte קורה במהלך פולחן monolayer המסורתי על ידי קיטוב תאים dysregulated דיפרנציה, אשר מגביר את הצורך של חוקרים ורופאים לבנות מודלים כבד "גישור פער" בצלחת. עם זאת, עד לאחרונה מודלי הרחבת ex vivo מהפטוציטים ראשוניים לא היו מבוססים היטב11,12,13,14,15. אורגנוידים בכבד ניתן להקים מתאי גזע עובריים/מושרה pluripotent, המרה פיברובלסט לתאים דמויי hepatocyte, ותאים נגזר רקמות. הפיתוח של organoids כבד מגביר את היישום של מודל במבחנה עבור מסכי סמים ורעילות בכבד בדיקות 16,17.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להקמת organoids כבד מן הפטוציטים ראשוניים מורין. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, הקמנו מערכת תרבות הפריה חוץ גופית של אורגנוידים hepatocyte עם שני זלוף של collagenase. אורגנוידים אלה ניתן לעבור להתרחבות ארוכת טווח במשך חודשים. התפקוד הפיזיולוגי שלהם עולה בקנה אחד עם hepatocytes. יתר על כן, אנו מספקים גם תיאור מפורט של כיצד לבצע מניפולציה גנטית, כגון זיהום lentivirus, התמלת siRNA, ו הנדסת CRISPR-Cas9 באמצעות organoids. התפשטות האורגנוידים של הפטוציטים שופכה אור על האפשרות להשתמש באורגנוידים כדי להבין ביולוגיה של הכבד ולפתח גישות לרפואה מותאמת אישית ותרגומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ניסויי העכברים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת שאנדונג ובוצעו על פי הרישיון על פי הנחיות ותקנות משרד הפנים (לא. ECSBMSSDU2019-2-079).

הערה: פרוטוקול זה משמש בעיקר לתרבות אורגנוידים תלת-ממדיים מהפטיציטים ראשוניים מבודדים.

1. הקמת תרבות האורגנוידים של מורין הפטוציט

הערה: מטריצה חוץ תאית כגון מטריגל או BME משמשים כמטריצת המרתף לאורגנואידים תרבותיים. יש לאחסן את המטריצה החוץ-תאית ב-20 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותה מראש ב-4 מעלות צלזיוס או על קרח. שמור את המטריצה החוץ-תאית על קרח במהלך הניסויים. מדיום הכביסה הוא מתקדם DMEM / F12 בתוספת גלוטמקס, HEPES ופניצילין / סטרפטומיצין. אינקובטור סטנדרטי (37 °C (37 °C,5% CO2) משמש לתרבות האורגנויד.

  1. הכנת חומרים
    1. הכן את המכשירים הנדרשים לניסוי: כרית העכבר, מכשירים כירורגיים סטריליים כמו פינצטה, מספריים, צינורות ומשאבה עם קצב זרימה של 2-10 מ"ל / דקה.
    2. הכן את ריאגנטים כולל חיץ זלוף, חוצץ העיכול ולהפוך אותם סטריליים לבידוד hepatocyte. יש להוסיף קולגנאז מסוג IV טרי (0.10 מ"ג/מ"ל) ו-CaCl2 (0.50 מ') ולחמם מראש את החיץ במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    3. הכן את המדיום המותנה כדי לייצר R-spondin 1 ואת כל הכימיקלים ואת המניות גורם צמיחה על פי הוראות היצרן.
      הערה: הימנע מהקפאה תכופה והפשרה של המדיום המותנה והמניות. מכינים את התרבות בינונית טרייה ומשתמשים בה תוך חודש. זה קריטי ליעילות יצירת האורגנויד.
  2. בידוד הפטוצ'ית מורין על ידי זלוף בכבד ועיכול
    הערה: עכברים זכר או נקבה בין הגילאים 12 שבועות ו 6 חודשים שימשו לתרבות organoid. לא נמצאו הבדלים ברורים ביעילות היווצרות האורגנויד מעידן העכבר התורם בטווח זה.
    1. המתת חסד את העכבר בשיטה מאושרת מבחינה אתית.
    2. תקן את העכבר על כרית העכבר ונקה את פרוות הבטן והעור עם 70% אלכוהול. לחשוף את הבטן ולהרים את הכבד מעל שאר הגוף. לעשות חבטה בקו האמצע כדי לחשוף את הכבד.
    3. מלאו את הצינור המחובר למשאבה במאגר זלוף. הפוך חותך של וריד הפורטל (על 1/3 של קוטר הווריד) ולהניח בזהירות קטטר לתוכו. הרם את איברי העיכול כדי לעזור להכניס את הצינורית. עניבה עם הקו הכירורגי היא אופציונלית כדי למנוע החלקה החוצה וקרע.
    4. התחל את המשאבה ולבצע זלוף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה עם חיץ זלוף. אם הכבד הופך חיוור מיד, לחתוך את הוועד הנתון הנחות כדי לאפשר חוצץ זלוף לזרום דרך הכבד כולו ולהוציא את הדם.
    5. כאשר הזרימה החוצה הופכת נקייה, הסר את הצינורית. זה לוקח בערך 5-10 דקות.
    6. שנה את חיץ זלוף עם חיץ עיכול מחומם מראש בקצב של 5 מ"ל / דקה. אין לעצור את המשאבה עד שהכבד הופך רך ומתנפח. הסר את הצנתר כאשר הכבד מפסיק נפיחות.
      הערה: חשוב מאוד לשמור על זמן עיכול תקין כדי למנוע עיכול מוגזם ולקבל תאי כבד בודדים.
    7. חותכים את הכבד ומניחים אותו בצלחת 100 מ"מ מלאה ב 15 מ"ל של שטיפה קרה בינונית. חותכים את הרצועות עם מספריים קטנים. לקרוע את הכבד לחתיכות עם טיפים פיפטה או מלקחיים.
    8. Pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי לשחרר את התאים עד המאגר רווי בתאים (12-15 פעמים). יוצקים את ההשעיה לתא לתוך צינור 50 מ"ל דרך מסנני 70 מיקרומטר.
    9. צנטריפוגה במשך 1-3 דקות ב 50 x g ו 4 °C (5 °F). דקאנט סופר-טבעי. לחלופין, resuspend התאים עם לשטוף בינוני או resuspend התאים עם מדיום תרבית ישירות. תספור את התאים עם המציטומיטר.
    10. להבחין בין תאים חיים או מתים על ידי מכונת מונה התא לאחר כתמי צבע תא חי.
      הערה: עדיף לטהר hepatocytes באמצעות קר 40% פרקול. לאחר שלב זה, hepatocytes קיימא יהיה בתחתית הצינורות.
  3. תרבות אורגניואידית ומעבר
    1. הסר את supernatant ו resuspend את hepatocytes עם תערובת של מטריצה חוץ תאית ומדיום תרבות ביחס של 3:1.
      הערה: 10,000-20,000 תאים בתערובת 50-60 μL לבאר עבור צלחת 24-well מומלץ. חשוב לעבוד במהירות ולשמור את התערובת על קרח לאורך כל התהליך. 200-500 organoids יכול להיווצר בריכוז זה.
    2. מוסיפים את טיפת התא/התערובת על הצלחת עם טיפות קטנות כדי למנוע מהטיפה להתחבר יחד. לדגור את הצלחת באינקובטור התא ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 במשך 5-10 דקות ולאחר מכן להוציא את הצלחת במשך 20-25 דקות עד מטריצה חוץ תאית הופך מוצק.
    3. מוסיפים מדיום תרבות (500 μL לבאר עבור צלחת 24-well) לתוך בארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור לתרבות האורגנויד. לשנות את המדיום כל 3-4 ימים. שימו לב לאורגנואידים עד שהם גדולים מספיק כדי לעבור.
      הערה: קוטר עם סביב 400-500 מיקרומטר מתאים למעבר של organoids hepatocyte.
    4. לבודד organoids מן המטריצה החוץ תאית עם התהליך המפורט להלן. החזק פיפטת פסטר זכוכית בלהבה כדי לצמצם את הצמצם שלה (על ידי ~ 1/2). באופן מכני pipette למעלה ולמטה 5-10 פעמים כדי לנתק את organoids לתוך organoids קטן יותר במהלך passaging.
      הערה: במהלך המעבר, להכין טיפים micropipette שטוף מראש צינורות עם חוצץ לשטוף קצה כדי למנוע אובדן organoids דבק צינורות או טיפים.

2. מניפולציה גנטית של אורגנוידים הפטוציטים מורין

  1. תאים בודדים מאורגנואידים של הפטוציטים
    1. הוסף 500 μL של קר לשטוף בינוני / פתרון שחזור תא לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה כדי להרוס את תערובת המטריצה החוץ תאית/תאית עם מיקרופיפט ולאחר מכן להעביר את ההשעיה האורגנוידית לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל על קרח. לחלופינית, להפוך את הצינור למעלה ולמטה מעת לעת כדי להפשיר את התערובת ביסודיות.
    2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500-800 x g ו 4 °C (7 °F) להשליך את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של פתרון טריפסין לכדור ולצינור אותו לערבב. דגירה ב 37 °C (5-10 דקות) ולאחר מכן להפסיק את העיכול על ידי הוספת נפח 2x של לשטוף בינוני.
    3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 800 x g ו 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant. resuspend הכדור עם מדיום תרבית ולספור את התאים באמצעות hemacytometer.
  2. תעתיק siRNA או plasmid
    הערה: organoids קטן יותר עם קוטר של פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte הם transfected עם siRNA באמצעות Lipofectamine או plasmids באמצעות ריאגנט transfection על פי הוראות היצרן.
    1. מערבבים siRNA או פלסמידים עם ריאגנט טרנספקטיון. הוסף תאים בודדים מאורגנואידים ותערובת ליפופקטמין-RNA/ליפו-פלסמיד (למשל, RNAiMAX) ל-1-2 בארות בצלחת 24-well וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-500 x גרם ו-32 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לדגור את הצלחת באינקובטור במשך 4-5 שעות ב 37 °C (77 °F).
    2. לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבית בריכוז של 10,000 תאים לבאר. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
  3. זיהום לנטיוויראלי
    הערה: organoids קטן עם קוטר פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte נגועים lentivirus באמצעות ריאגנטים זיהום בינוני על פי הוראות היצרן.
    1. לערבב 250 μL של השעיית תא יחיד מן organoid ו 250 μL של חלקיקים ויראליים בצינור 1.5 מ"ל.
    2. צלחת את התערובת צנטריפוגה במשך 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (70 °F). דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
    3. לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבות. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
  4. הנדסה גנטית מאת CRISPR/Cas9
    הערה: אנו מספקים וידאו עבור ביצועים אלה בחומרים משלימים. תאים בודדים מאורגנואידים נדבקו בלנטיוירוס או הועברו על ידי פלסמידים שנשאו sgRNA ו- Cas9.
    1. לעכל תאים בודדים מן האורגנוידים hepatocyte תרבית ומעבר על פי השיטה לעיל.
    2. להדביק תאים בודדים עם sgRNA באמצעות Opti-MEM בינוני ריאגנטים זיהום על פי הוראות היצרן.
    3. לערבב 250 μL של השעיה של תא יחיד ו 250 μL של חלקיקים ויראליים יחד בצינור 1.5 מ"ל.
    4. צנטריפוגות תערובת 500 μL עבור 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (5 °F) ולאחר מכן דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
    5. לאסוף את השעיית התא וזרע במטריצה חוץ תאית. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האורגנוידים הפטוציטים מנקבה אלב-Cre; עכבר Rosa26-GFP (8 שבועות) נצפו חמישה ימים לאחר זריעה (איור 1A). האורגנוידים מתרבים עם כתמים חיוביים של Ki67 (איור 1B). ביטוי מפריע של גנים מייצגים באורגנוידים hepatocyte או על ידי transfection siRNA או זיהום lentivirus נבדק על ידי qRT-PCR ו כתם מערבי. התוצאות מוצגות באיור 2A וב-2B. איור 2C מציג את תוצאות הבחירה של אורגנוידים בכבד לאחר 14 ימים של טיפול עם RSL-3 ומסך הספרייה הגנומי CRISPR/Cas9. התוצאות מצביעות על כך שניתן להרחיב את האורגנוידים האלה במבחנה ולתומר גנטית.

Figure 1
איור 1: הקמה והתרחבות של אורגנוידים של הפטוציטים מורין.  (A) תמונה מייצגת של אורגנוידים הפטוציטים מאלב-קר; רוזה 26-GFP. סרגל קנה המידה הוא 400 מיקרומטר. (B) תמונה מייצגת של הר שלם של organoids hepatocyte עם b-catenin ו Ki67 נוגדנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מניפולציה גנטית של אורגנוידים של הפטוציטים מורין. (A) רמת ה-mRNA של Hdac3 ו-Wee1 ביחס ל-GAPDH באורגנוידים של הפטוסיטים לאחר שהודבקו בסירנ"א. קווי שגיאה מייצגים שגיאות סטנדרטיות (n=3). (B) ניתוח בורג מערבי של organoids נגוע lentivirus. (C) תמונה מייצגת של אורגנוידים בכבד לאחר מסך CRISPR-Cas9 במדיום תרבות עם בחירת RSL-3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חומר משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת לתרבות הפטוסיטים בוגרים לאורך תקופות ארוכות היא בסיסית בחקר מדע בסיסי בכבד, טוקסיקולוגיה של תרופות וזיהומים של פונדקאי-מיקרוביולוגיה הפטטרופית כגון מלריה ווירוסי הפטיטיס. עם נישה מוגדרת היטב, הפרוטוקול כאן מקים מערכת תרבות להפטוציטים. פרוטוקול זה מניע hepatocytes בוגרים להתרחב בתרבות 3D עם הטרוגניות כי recapitulatulates אינטראקציה תא תא, רוב הפונקציה hepatocyte ושינויים גנטיים, המאפשר את העיצוב של מחקרים תפקוד גנים ואפיקים טיפוליים חדשניים לקראת טיפול רגנרטיבי.

hepatocytes באיכות גבוהה חשובים מאוד עבור הממסד ומניפולציה גנטית של organoids hepatocyte. זמן העיכול של טיפול collagenase הוא קריטי למדי. עם זאת, נותרו כמה מגבלות בשיטה. ראשית, גורמים נישה יותר מוצעים בניסוי כדי לעזור organoids להתרחב זמן רב יותר. שנית, האורגנוידים לא אוהבים להיות תאים בודדים ברציפות ולעתים קרובות. האורגנוידים שמקורם בהפטוציטים נראים כדי לשחזר את התגובה המתחדשת של כבדים בוגרים לאחר כריתת כבד חלקית, אך הם עדיין שונים מהפטוציטים בוגרים.

ראוי לציין, באמצעות organoids hepatocyte כדי להרחיב hepatocytes לפתוח מסלולים חדשים עבור מחקרים תפקוד גנים בכבד. אורגנוידים פולחניים משותפים עם תאי כלי דם, תאי מערכת החיסון ווירוסי כבד צפויים להמשיך לחקור אנגיוגנזה, מיקרו-סביבה ומחלות כבד זיהומיות. מערכת מסך סטנדרטית בכל רחבי עם organoids אלה מומלץ גם עבור מחקר ניקוי רעלים ex vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם חושפים קונפליקטים.

Acknowledgments

אנו מודים לפרופסור הנס פיקחס על שסיפק באדיבות את קווי התא כדי לייצר R-spondinant recombinant1. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים מתוכנית המחקר והפיתוג הלאומית של סין (2019YFA0111400), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31970779) ל- H.H., וקבוצת המחקר הבינתחומית והחדשנות לנוער של אוניברסיטת שאנדונג (2020QNQT003) ל- H.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Buffer
EGTA Sangon Bitech A600077-0100 3.50 g/L
Glucose Sangon Bitech A100188-0500 9.00 g/L
KCl Sangon Bitech A100395-0500 4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O Sangon Bitech A501727-0500 1.51 g/L
NaCl Sangon Bitech A501218-0001 80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O Sangon Bitech A610404-0500 0.78 g/L
NaHCO3 Sangon Bitech A500873-0500 3.50 g/L
Phenol Red Sangon Bitech A100882-0025 0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2 Sangon Bitech A501330-0005 0.50 M
Collagenase IV Sigma C1639 0.10 mg/mL
HEPES Sangon Bitech C621110-0010 23.80 g/L
KCl Sangon Bitech A100395-0500 4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O Sangon Bitech A501727-0500 1.51 g/L
NaCl Sangon Bitech A501218-0001 80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O Sangon Bitech A610404-0500 0.78 g/L
NaHCO3 Sangon Bitech A500873-0500 3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum Gibco 10091148 stored at 4 °C
DPBS Gibco C14190500BT0 stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 stored at 4 °C
GlutaMAX Gibco 35050-061 100 X
HEPES Gibco 15630-080 100 X
Penicillin/streptomycin Sangon Bitech  A600135-0025 100 X
Culture Medium
A83-01 Tocris 2939 Stock concentration 500 µM, final
concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A Gibco 1704-044 50 X
Chir 99021 Tocris 4423 Stock concentration 30 mM, final
concentration 3 µM
DMEM/F12 Gibco 11330032 stored at 4 °C
Gastrin I Tocris 3006 Stock concentration 100 mM, final
concentration 10 nM
GlutaMAX Gibco 35050-061 100 X
HEPES Gibco 15630-080 100 X
Matrigel martix BD 356231 stored at -20 °C
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Stock concentration 500 mM, final
concentration 1 mM
Nictinamide Sigma Aldrich N0636 Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin Sangon Bitech  A600135-0025 100 X
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10 Peprotech 100-26 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α Peprotech 100-16A Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α Origene TP750007-1000 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter Millipore SCGPT01RE
16 # silicone tube LangerPump
24 well, suspension Greiner bio-one GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter BD 352350
Accutase stemcell AT-104 stored at 4 °C
Anti-CTNNB1 BD 610154 Mouse
Anti-GAPDH CST 5174S Rabbit
Anti-HDAC7 Abcam ab50212 Mouse
Anti-KI67 Abcam ab15580 Rabbit
Biological safety cabinet ESCO CCL-170B-8
Cell Recovery Solution Corning 354253 stored at 4 °C
Centrifuge 5430 eppendorf 542700097
CO2 incubator ESCO AC2-4S1
DMSO Sangon Bitech  A100231 stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems Invitrogen AME4300
Hdac3 siRNA Guangzhou RiboBio Co., Ltd. siG2003180909192555 stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd LV2020-2364 stored at -80 °C
Hitrans G A Shanghai Genechem Co.,Ltd. REVG004 Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778150 Increased virus infection efficiency
Live cell dye Luna F23001 stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge cence TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device Lonza
Opti-MEM Gibco 31985070 stored at 4 °C
Pasteur pipette Sangon Bitech F621006-0001
Peristaltic pump LangerPump BT100-2J
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Activate with methanol
PX458 Addgene 48138 stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400
RSL3 MCE HY-100218A Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA Gibico 25200072 stored at 4 °C
Wee1 siRNA Guangzhou RiboBio Co., Ltd. siG2003180909205971 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
  2. Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  5. Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
  8. Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
  9. Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  10. Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
  11. Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
  12. Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  13. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  14. Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
  15. Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
  16. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  17. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 180
מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu,… More

Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids. J. Vis. Exp. (180), e62438, doi:10.3791/62438 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter