Summary
从小鼠肝细胞建立了长期 的体外 3D类器官培养系统。这些类器官可以通过shRNA/异位构建的慢病毒感染，siRNA转染和CRISPR-Cas9工程进行遗传和遗传操纵。
Abstract
肝脏是哺乳动物最大的器官。它在葡萄糖储存，蛋白质分泌，代谢和解毒中起重要作用。作为大多数肝功能的执行者，原代肝细胞的增殖能力有限。这就需要建立 离体 肝细胞扩增模型，用于肝脏生理和病理研究。在这里，我们通过两步胶原酶灌注分离小鼠肝细胞，并建立了3D类器官培养物作为"迷你肝脏"，以概括细胞 - 细胞相互作用和物理功能。类器官由异质细胞群组成，包括祖细胞和成熟肝细胞。我们详细介绍了分离和培养小鼠肝细胞或胎儿肝细胞在2-3周内形成类器官的过程，并展示了如何通过机械上下移液来通过它们。此外，我们还将介绍如何将类器官消化成单细胞，用于shRNA/异位构建的慢病毒感染，siRNA转染和CRISPR-Cas9工程。类器官可用于药物筛选，疾病建模和基础肝脏研究，通过模拟肝脏生物学和病理生物学。
Introduction
类器官是自组织的三维（3D） 体外 簇，包括自我更新的干细胞和多系分化细胞1，2。许多器官的类器官已经通过明确定义的利基因素从多能或成体干细胞中建立，包括肠道，大脑，结肠，肾脏，肝脏，胰腺，甲状腺，胃，皮肤和肺3，4，5，6，7.类器官通过模仿发育（源自胚胎或诱导多能干细胞，PSC）或稳态/再生进展（源自成体干细胞，ASCs）来概括物理细胞功能，这为疾病研究和治疗开辟了新的途径8，9。
作为哺乳动物最大的器官，肝脏主要负责储存，代谢和解毒。两种上皮细胞类型，肝细胞和胆管细胞，构建肝小叶的基本单位。肝细胞负责70-80%的肝功能10。虽然肝脏具有显着的再生能力，但在传统的单层培养过程中，肝细胞特征的快速丧失发生在失调的细胞极化和去分化，这增加了研究人员和临床医生在培养皿中建立"间隙桥接"肝脏模型的需求。然而，直到最近，来自原代肝细胞的 离体 扩增模型尚未得到很好的建立11，12，13，14，15。肝脏类器官可以从胚胎/诱导多能干细胞、成纤维细胞转化为肝细胞样细胞和组织衍生细胞中建立。肝脏类器官的发展促进了体外模型在药物筛选和肝毒性测定中的应用16，17。
在这里，我们描述了从小鼠原发性肝细胞建立肝脏类器官的详细方案。通过使用该协议，我们建立了具有两种胶原酶灌注的肝细胞类器官的 体外 培养系统。这些类器官可以长期扩增数月。它们的生理功能与肝细胞高度一致。此外，我们还详细介绍了如何使用类器官进行遗传操作，例如慢病毒感染，siRNA转导和CRISPR-Cas9工程。肝细胞类器官的繁殖揭示了使用类器官来理解肝脏生物学并开发个性化和转化医学方法的可能性。
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Protocol
所有小鼠实验均经山东大学基础医学院动物护理与使用委员会批准，并根据内政部指南和规定（No.ECSBMSSDU2019-2-079）。
注意：该方案主要用于从分离的原代肝细胞中培养3D类器官。
1. 建立小鼠肝细胞类器官培养
注意：细胞外基质（如基质胶或BME）用作培养类器官的基底基质。将细胞外基质储存在-20°C，并在4°C或冰上预解冻。在实验过程中将细胞外基质保持在冰上。洗涤培养基是高级DMEM / F12，补充了GlutaMAX，HEPES和青霉素/链霉素。标准培养箱（37°C，加湿气氛，5%CO 2）用于类器官培养。
- 材料准备
- 准备实验所需的器械：鼠标枕，无菌手术器械，如镊子，剪刀，管子和流速为2-10 mL / min的泵。
- 准备试剂，包括灌注缓冲液，消化缓冲液，并使其无菌以进行肝细胞分离。加入新鲜的IV型胶原酶（0.10mg / mL）和CaCl2 （0.50 M），并在水浴中将缓冲液预热至37°C。
- 根据制造商的说明准备条件培养基以生产R-spondin 1以及所有化学和生长因子库存。
注意：避免频繁冻结和解冻有条件的培养基和高汤。新鲜准备培养基，并在一个月内使用。这对于类器官形成效率至关重要。
- 通过肝脏灌注和消化分离小鼠肝细胞
注意：年龄在12周至6个月之间的雄性或雌性小鼠用于类器官培养。在此范围内，与供体小鼠年龄相比，类器官形成效率没有发现明显差异。- 用道德认可的方法对老鼠实施安乐死。
- 将鼠标固定在鼠标枕头上，用70%的酒精清洁腹部毛皮和皮肤。暴露腹部，将肝脏提升到身体其他部位以上。做一个中线切口以暴露肝脏。
- 用灌注缓冲液填充连接到泵的管子。做一个门静脉切口（约静脉直径的1/3），并小心地将导管插入其中。抬起消化器官以帮助插入插管。与手术线的系带是可选的，以避免滑出和破裂。
- 启动泵，用灌注缓冲液以 5-7 mL/min 的流速进行灌注。如果肝脏立即变白，切除下腔静脉，让灌注缓冲液流过整个肝脏并将血液排出。
- 当流出物变得干净时，取出套管。大约需要5-10分钟。
- 用预热的消化缓冲液以5 mL / min的速率改变灌注缓冲液。不要停止泵，直到肝脏变软和肿胀。当肝脏停止肿胀时，取出导管。
注意：保持适当的消化时间以避免过度消化并获得单个肝细胞非常重要。 - 切掉肝脏并将其置于充满15 mL冷洗介质的100毫米板中。用小剪刀剪断韧带。用移液器吸头或镊子将肝脏撕成碎片。
- 轻轻地上下移液以释放细胞，直到缓冲液被细胞饱和（12-15次）。通过70μm过滤器将细胞悬浮液倒入50mL管中。
- 在50× g 和4°C下离心1-3分钟。 倾析上清液。或者，用洗涤培养基重悬细胞或直接用培养基重悬细胞。用血细胞计数器计数细胞。
- 活细胞染料染色后，通过细胞计数器区分活细胞或死细胞。
注意：最好使用冷的40%Percoll纯化肝细胞。在此步骤之后，活的肝细胞将位于管的底部。
- 类器官培养和传代
- 除去上清液，并以3：1的比例将细胞外基质和培养基的混合物重悬肝细胞。
注意：对于24孔板，建议在每孔50-60μL混合物中加入10，000-20，000个细胞。重要的是要快速工作，并在整个过程中将混合物保持在冰上。在这种浓度下可以形成200-500个类器官。 - 将细胞/混合物滴加入带有小液滴的平板上，以防止液滴连接在一起。将板在37°C，5%CO 2 的细胞培养箱中孵育5-10分钟，然后将板取出20-25分钟，直到细胞外基质变为固体。
- 将培养基（24孔板每孔500μL）加入孔中，并将板返回培养箱进行类器官培养。每3-4天更换一次培养基。观察类器官，直到它们足够大，可以传代。
注意：直径约为400-500μm适合肝细胞类器官的通过。 - 使用下面的详细过程从细胞外基质中分离出类器官。将玻璃巴斯德移液器放在火焰中以缩小其孔径（约1/2）。机械地上下移液5-10次，以在传代过程中将类器官解离成更小的类器官。
注意：在传代过程中，准备预洗的微量移液管尖端和带有尖端洗涤缓冲液的管子，以避免器官粘附在管子或尖端上。
- 除去上清液，并以3：1的比例将细胞外基质和培养基的混合物重悬肝细胞。
2. 小鼠肝细胞类器官的遗传操作
- 来自肝细胞类器官的单细胞
- 向每个孔中加入500μL冷洗培养基/细胞回收溶液。用微量移液管上下移液以破坏细胞/细胞外基质混合物，然后将类器官悬浮液转移到冰上的15mL离心管中。或者，不时上下转动管子以彻底解冻混合物。
- 在500-800× g 和4°C下离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入1mL胰蛋白酶溶液，并移取以混合。在37°C下孵育5-10分钟，然后通过加入2倍体积的洗涤介质停止消化。
- 在800×g和4°C下离心5分钟，弃去上清液。用培养基重悬沉淀并使用血细胞计数器计数细胞。
- siRNA 或质粒转染
注意：根据制造商的说明，使用脂质酰胺转染直径小于50μm的较小类器官或来自肝细胞类器官的单细胞或使用转染试剂的质粒转染siRNA。- 将siRNA或质粒与转染试剂混合。将来自类器官的单细胞和脂质素-RNA/脂质粒混合物（例如RNAiMAX）加入24孔板中的1-2孔中，并在500×g和32°C下离心1小时。 离心后，将板在37°C下在培养箱中孵育4-5小时。
- 将细胞和种子收集在细胞外基质中，培养基浓度为每孔10，000个细胞。转染后两天将培养基更换为选择条件。评估10天后类器官形成效率。
- 慢病毒感染
注意：直径小于50μm的小类器官或来自肝细胞类器官的单细胞根据制造商的说明使用感染试剂培养基感染慢病毒。- 将来自类器官的250μL单细胞悬浮液和250μL病毒颗粒混合在1.5mL管中。
- 将混合物平板并在500×g和32°C下离心1小时。 在37°C下孵育4-5小时。
- 用培养基将细胞和种子收集在细胞外基质中。转染后两天将培养基更换为选择条件。评估10天后类器官形成效率。
- CRISPR/Cas9的基因工程
注：我们在补充材料中提供了此性能的视频。来自类器官的单细胞感染慢病毒或被携带sgRNA和Cas9的质粒转染。- 根据上述方法从肝细胞类器官中消化单细胞并传代。
- 根据制造商的说明，使用 Opti-MEM 培养基和感染试剂用 sgRNA 感染单个细胞。
- 将250μL单细胞悬浮液和250μL病毒颗粒混合在1.5mL管中。
- 将500μL混合物在500×g和32°C下离心1小时，然后在37°C下孵育4-5小时。
- 收集细胞悬浮液并在细胞外基质中播种。评估10天后类器官形成效率。
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Representative Results
来自女性Alb-Cre的肝细胞类器官;在播种后五天观察Rosa26-GFP小鼠（8周）（图1A）。类器官随着Ki67阳性染色而增殖（图1B）。通过qRT-PCR和蛋白质印迹检查通过siRNA转染或慢病毒感染在肝细胞类器官中代表性基因的干扰表达。结果如图 2A 和 2B所示。 图2C 显示了用RSL-3和CRISPR / Cas9基因组文库筛选治疗14天后肝脏类器官的选择结果。结果表明，这些类器官可以在体外扩增并进行遗传操纵。
图1：小鼠肝细胞类器官的建立和扩增。 （A）来自Alb-Cre的肝细胞类器官的代表性图像;罗莎26-GFP.比例尺为400μm.（B）具有b-连环蛋白和Ki67抗体的肝细胞类器官的整个坐骑锡的代表性图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：鼠肝细胞类器官的遗传操作（A）转染siRNA后肝细胞类器官中Hdac3和Wee1相对于GAPDH的mRNA水平。误差线表示标准误差 （n=3）。（B）对慢病毒感染的类器官进行蛋白质免疫分析。（C）在具有RSL-3选择的培养基中筛选CRISPR-Cas9后肝脏类器官的代表性图像。请点击此处查看此图的放大版本。
补充材料。请点击此处下载此文件。
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Discussion
长期培养成熟肝细胞的能力是研究肝脏基础科学，药物毒理学和嗜肝性宿主微生物学感染（如疟疾和肝炎病毒）的基础。通过明确定义的生态位，这里的方案为肝细胞建立了一个培养系统。该协议驱动成熟肝细胞在3D培养物中扩增，具有异质性，概括了细胞 - 细胞相互作用，大多数肝细胞功能和遗传修饰，允许设计基因功能研究和新的治疗途径进行再生治疗。
高质量的肝细胞对于肝细胞类器官的建立和遗传操作非常重要。胶原酶治疗的消化时间非常关键。但是，该方法仍然存在一些限制。首先，在试验中提出了更多的利基因素，以帮助类器官扩张更长时间。其次，类器官不喜欢连续和频繁地成为单个细胞。肝细胞衍生的类器官似乎概括了部分肝切除术后成人肝脏的再生反应，但它们仍然与静止的成熟肝细胞不同。
值得注意的是，使用肝细胞类器官扩增肝细胞为肝基因功能研究开辟了新的途径。与血管细胞，免疫细胞和肝病毒共培养类器官有望进一步研究血管生成，微环境和传染性肝病。还建议将这些类器官的标准高通屏系统用于离体解毒研究。
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Disclosures
作者没有透露任何冲突。
Acknowledgments
我们感谢Hans Clevers教授慷慨地提供了细胞系来生产重组R-spondin1。这项工作得到了中国国家重点研发计划（2019YFA0111400）、国家自然科学基金（31970779）和山东大学青年交叉学科创新研究组（2020QNQT003）对H.H.的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
