Summary
Et langsigtet ex vitro 3D organoid kultursystem blev etableret fra musehæpatocytter. Disse organoider kan passage og genetisk manipuleres ved lentivirus infektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering.
Abstract
Leveren er det største organ hos pattedyr. Det spiller en vigtig rolle i glukoseopbevaring, proteinsekretion, metabolisme og afgiftning. Som eksekutor for de fleste af leveren funktioner, primære hepatocytter har begrænset voksende kapacitet. Dette kræver, at der oprettes ex vivo hepatocyt ekspansion modeller for lever fysiologisk og patologisk forskning. Her isolerede vi murine hepatocytter med to trin af kollagenaseperfusion og etablerede en 3D-organoidkultur som 'minilever' for at generogulere cellecelleinteraktioner og fysiske funktioner. Organoiderne består af heterogene cellepopulationer, herunder forfædre og modne hepatocytter. Vi introducerer processen i detaljeret at isolere og kultur murine hepatocytter eller foster hepatocyt at danne organoider inden for 2-3 uger og vise, hvordan man passage dem ved mekanisk pipetter op og ned. Derudover vil vi også introducere, hvordan man fordøjer organoiderne i enkeltceller til lentivirusinfektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering. Organoiderne kan bruges til lægemiddelskærme, sygdomsmodellering og grundlæggende leverforskning ved at modellere leverbiologi og patobiologi.
Introduction
Organoider er selvorganiserede, tredimensionelle (3D) in vitro-klynger, der omfatter selvfornyende stamceller og differentierede celler med flere slægter1,2. Organoiderne i mange organer er blevet etableret enten fra pluripotente eller voksne stamceller ved veldefinerede nichefaktorer, herunder tarmen, hjernen, tyktarmen, nyrerne, leveren, bugspytkirtlen, skjoldbruskkirtlen, maven, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoiderne generobrer fysiske cellefunktioner ved at efterligne enten udvikling (stammer fra embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, PSC'er) eller homøostase / regenerering progression (stammer fra voksne stamceller, ASCs), som åbner nye veje i sygdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organ hos pattedyr er leveren primært ansvarlig for opbevaring, metabolisme og afgiftning. To slags epitelcelletyper, hepatocytter og cholangiocytter, konstruere den grundlæggende enhed af en leverlobule. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% af leverfunktionen10. Selv om leveren har bemærkelsesværdig regenerering kapacitet, hurtigt tab af hepatocyt funktioner sker under traditionelle monolayer dyrkning af dysreguleret celle polarisering og dedifferentiation, hvilket øger behovet for forskere og klinikere til at opbygge 'gap-bridging' lever modeller i en skål. Indtil for nylig havde ex vivo-ekspansionsmodellerne fra primære hepatocytter imidlertid ikke været veletablerede11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale / inducerede pluripotente stamceller, fibroblast konvertering til hepatocyt-lignende celler, og væv-afledte celler. Udviklingen af leverorganoider øger anvendelsen af en in vitro-model til lægemiddelskærme og levertoksicitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til etablering af leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved at bruge denne protokol, vi oprettet en in vitro kultur system af hepatocyt organoider med to perfusioner af kollagenase. Disse organoider kan passeres for langsigtet ekspansion i flere måneder. Deres fysiologiske funktion er meget i overensstemmelse med hepatocytter. Derudover giver vi også en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører genmanipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA transduktion og CRISPR-Cas9-teknik ved hjælp af organoider. Udbredelsen af hepatocytorganoider kaster lys over muligheden for at bruge organoider til at forstå leverbiologi og udvikle personlige og translationelle medicintilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus eksperimenter blev godkendt af Animal Care and Use Committee af School of Basic Medical Sciences på Shandong University og blev udført i henhold til licensen i henhold til Home Office retningslinjer og regler (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
BEMÆRK: Denne protokol bruges hovedsageligt til at dyrke 3D-organoider fra isolerede primære hepatocytter.
1. Etablering af Murine Hepatocyte Organoid Kultur
BEMÆRK: Ekstracellulære matrix såsom Matrigel eller BME bruges som kælderen matrix til kultur organoider. Den ekstracellulære matrix opbevares ved -20 °C, og optø den ved 4 °C eller på is. Hold den ekstracellulære matrix på is under forsøgene. Vaskemediet er Advanced DMEM/F12 suppleret med GlutaMAX, HEPES og penicillin/streptomycin. En standard inkubator (37 °C, befugtet atmosfære, 5% CO2) anvendes til organoidkultur.
- Fremstilling af materialer
- Forbered de instrumenter, der kræves til eksperimentet: musepuden, sterile kirurgiske instrumenter som pincet, saks, rør og en pumpe med en strømningshastighed på 2-10 mL / min.
- Forbered reagenserne, herunder perfusionsbufferen, fordøjelsesbufferen og gør dem sterile til hepatocytisolation. Der tilsættes frisk type IV kollagenase (0,10 mg/mL) og CaCl2 (0,50 M) og forvarmes bufferen ved 37 °C i et vandbad.
- Forbered det betingede medium til at producere R-spondin 1 og alle kemiske og vækstfaktorlagre i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Undgå ofte at fryse og optø det betingede medium og lagrene. Forbered kulturmediet frisk og brug det inden for en måned. Dette er afgørende for organoid danner effektivitet.
- Murine hepatocyt isolation ved leverperfusion og fordøjelse
BEMÆRK: Han- eller hunmus i alderen 12 uger og 6 måneder blev anvendt til organoidkultur. Der blev ikke fundet åbenlyse forskelle i organoiddannelseseffektivitet fra donormusens alder inden for dette interval.- Aflive musen med en etisk godkendt metode.
- Fix musen på musen pude og rense abdominal pels og hud med 70% alkohol. Eksponer maven og løft leveren over resten af kroppen. Lav en midline snit til at udsætte leveren.
- Fyld røret, der er fastgjort til pumpen, med perfusionsbuffer. Lav et snit af portalvenen (ca. 1/3 af venens diameter) og læg forsigtigt et kateter i den. Løft fordøjelsesorganerne op for at hjælpe med at indsætte kanylen. Et slips med den kirurgiske linje er valgfri for at undgå at glide ud og briste.
- Start pumpen og udfør perfusion med en strømningshastighed på 5-7 mL/min med perfusionsbuffer. Hvis leveren bliver bleg straks, skære ringere vena cava at tillade perfusion buffer til at flyde gennem hele leveren og drive blodet ud.
- Når udstrømningen bliver ren, skal du fjerne kanylen. Det tager cirka 5-10 minutter.
- Skift perfusionsbufferen med forvarmet fordøjelsesbuffer med en hastighed på 5 mL/min. Stop ikke pumpen, før leveren bliver blød og svulmer. Fjern kateteret, når leveren stopper hævelse.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at holde ordentlig fordøjelsestid for at undgå overdreven fordøjelse og få enkelte leverceller. - Skær leveren af og læg den i en 100 mm plade fyldt med 15 mL koldt vaskemedium. Skær ledbåndene med lille saks. Riv leveren i stykker med pipettespidser eller sammentrak.
- Pipette op og ned forsigtigt for at frigive cellerne, indtil bufferen er mættet med celler (12-15 gange). Hæld celleaffjedringen i et 50 mL rør gennem 70 μm filtre.
- Centrifuge i 1-3 minutter ved 50 x g og 4 °C. Dekanter supernatanten. Eventuelt genbruge cellerne med vaskemedium eller genbruge cellerne med kulturmedium direkte. Tæl cellerne med et hæmacytometer.
- Skelne levende eller døde celler ved celletæller maskine efter levende celle farvestof farvning.
BEMÆRK: Det er bedst at rense hepatocytter ved hjælp af kolde 40% Percoll. Efter dette trin vil levedygtige hepatocytter være i bunden af rørene.
- Organoid kultur og passage
- Fjern supernatanten og genbrug hepatocytterne med en blanding af ekstracellulær matrix og kulturmedium i et forhold på 3:1.
BEMÆRK: 10.000-20.000 celler i en 50-60 μL blanding pr. brønd til en 24-brønds plade anbefales. Det er vigtigt at arbejde hurtigt og holde blandingen på is under hele processen. 200-500 organoider kunne dannes ved denne koncentration. - Tilsæt celle /blandingsdråben på pladen med små dråber for at forhindre dråben i at forbinde sig sammen. Inkuberes pladen i cellekuvøsen ved 37 °C, 5% CO2 i 5-10 min og derefter tage pladen ud i 20-25 min indtil den ekstracellulære matrix bliver solid.
- Tilsæt kulturmedium (500 μL pr. brønd for en 24-brønds plade) i brøndene og returner pladen til inkubatoren for organoidkultur. Skift medium hver 3-4 dage. Overhold organoiderne, indtil de er store nok til at blive passager.
BEMÆRK: En diameter med ca. 400-500 μm er velegnet til passage af hepatocytorganoider. - Isoler organoider fra den ekstracellulære matrix med den detaljerede proces nedenfor. Hold et glas Pasteur pipette i en flamme for at indsnævre sin blænde (ved ~ 1 / 2). Mekanisk pipette op og ned 5-10 gange for at adskille organoiderne i mindre organoider under passaging.
BEMÆRK: Under passaging forberede forvasket mikropipette tips og rør med tip-vask buffer for at undgå tab af organoider stikning til rør eller spidser.
- Fjern supernatanten og genbrug hepatocytterne med en blanding af ekstracellulær matrix og kulturmedium i et forhold på 3:1.
2. Genetisk manipulation af murin hepatocyt organoider
- Enkelte celler fra hepatocyt organoider
- Der tilsættes 500 μL kold vask medium/cellegenvindingsopløsning til hver brønd. Pipette op og ned for at ødelægge celle /ekstracellulær matrix blanding med en mikropipette og derefter overføre organoid suspension til en 15 mL centrifuge rør på is. Du kan eventuelt skrue røret op og ned fra tid til anden for at optø blandingen grundigt.
- Centrifuge i 5 min ved 500-800 x g og 4 °C og kassér supernatanten. Tilsæt 1 mL trypsinopløsning til pelleten og pipettes det til at blande. Inkuberes ved 37 °C i 5-10 min og derefter stoppe fordøjelsen ved at tilføje en 2x volumen af vaskemed.
- Centrifuge i 5 min ved 800 x g og 4 °C og kassér supernatanten. Resuspend pellet med kultur medium og tælle cellerne ved hjælp af et hemacytometer.
- siRNA eller plasmidtransfektion
BEMÆRK: Mindre organoider med en diameter på under 50 μm eller enkelte celler fra hepatocytorganoider transfectedes med siRNA ved hjælp af Lipofectamin eller plasmider ved hjælp af transfection reagens i henhold til fabrikantens anvisninger.- Bland siRNA eller plasmider med transfection reagens. Der tilsættes enkelte celler fra organoider og Lipofectamin-RNA/Lipo-plasmid-blandingen (f.eks. RNAiMAX) i 1-2 brønde i 24-brøndspladen og centrifugen i 1 time ved 500 x g og 32 °C. Efter centrifugering inkuberes pladen i inkubatoren i 4-5 timer ved 37 °C.
- Saml celler og frø i ekstracellulær matrix med kulturmedium i en koncentration på 10.000 celler pr. Brønd. Skift mediet til valgbetingelsen to dage efter transfektionen. Vurder organoiddannelseseffektiviteten efter 10 dage.
- Lentiviral infektion
BEMÆRK: Små organoider med en diameter på under 50 μm eller enkelte celler fra hepatocytorganoider inficeret med lentivirus ved hjælp af infektionsreagenser medium i henhold til producentens anvisninger.- Bland 250 μL af enkeltcelleophænget fra organoiden og 250 μL af viruspartikler i et 1,5 mL rør.
- Blandingen og centrifugen pladesplade i 1 time ved 500 x g og 32 °C. Inkuberes i 4-5 timer ved 37 °C.
- Saml celler og frø i ekstracellulær matrix med kulturmedium. Skift mediet til valgbetingelsen to dage efter transfektionen. Vurder organoiddannelseseffektiviteten efter 10 dage.
- Genteknologi af CRISPR/Cas9
BEMÆRK: Vi leverer video til denne præstation i de supplerende materialer. Enkelte celler fra organoider blev inficeret med lentivirus eller transfected af plasmider, der transporterede sgRNA og Cas9.- Fordøje enkelte celler fra hepatocyt organoider kultiveret og passage i henhold til ovenstående metode.
- Inrmitér enkelte celler med sgRNA ved hjælp af Opti-MEM medium og infektion reagenser i henhold til producentens anvisninger.
- Bland 250 μL af en encellet suspension og 250 μL viruspartikler sammen i et 1,5 mL rør.
- Centrifuge 500 μL-blandingen i 1 time ved 500 x g og 32 °C og inkuberes derefter i 4-5 timer ved 37 °C.
- Saml celleaffjedringen og frøet i ekstracellulær matrix. Vurder organoiddannelseseffektiviteten efter 10 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyt organoider fra kvindelige Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 uger) blev observeret fem dage efter såning (Figur 1A). Organoiderne breder sig med Ki67 positiv farvning (figur 1B). Interfererende udtryk for repræsentative gener i hepatocytorganoider enten ved siRNA transinfektion eller lentivirusinfektion blev undersøgt af qRT-PCR og western blot. Resultaterne er vist i figur 2A og 2B. Figur 2C viser udvælgelsesresultaterne fra leverorganoider efter 14 dages behandling med RSL-3 og CRISPR/Cas9 genomisk biblioteksskærm. Resultaterne tyder på, at disse organoider kunne udvides in vitro og genetisk manipuleres.
Figur 1: Etablering og udvidelse og af murine hepatocyt organoider. A) Repræsentativt billede af hepatocytorganoider fra Alb-Cre Rosa26-GFP. Skalastangen er 400 μm. (B) Repræsentativt billede af hele mount staning af hepatocyt organoider med b-catenin og Ki67 antistoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Genetisk manipulation af murin hepatocytorganoider. (A) MRNA-niveauet af Hdac3 og Wee1 i forhold til GAPDH i hepatocytorganoider efter transfected med siRNA. Fejllinjer repræsenterer standardfejl (n=3). (B) Vestlig boltanalyse af organoider inficeret med lentivirus. (C) Repræsentativt billede af leverorganoider efter CRISPR-Cas9-skærm i kulturmedium med RSL-3-valg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materiale. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at kultur modne hepatocytter over lange perioder er grundlæggende i at studere lever grundlæggende videnskab, narkotika toksikologi og hepatotropiske host-mikrobiologi infektioner såsom malaria og hepatitis virus. Med en veldefineret niche opretter protokollen her et kultursystem for hepatocytter. Denne protokol driver modne hepatocytter til at udvide i 3D-kultur med en heterogenitet, der opsummerer celle-celle interaktion, de fleste hepatocyt funktion og genetiske modifikationer, så design af genfunktion undersøgelser og nye terapeutiske veje mod regenerativ terapi.
Hepatocytter af høj kvalitet er meget vigtige for etablering og genetisk manipulation af hepatocytorganoider. Fordøjelsestiden for kollagenasebehandling er ret kritisk. Der er dog stadig nogle begrænsninger i metoden. For det første foreslås flere nichefaktorer i et forsøg for at hjælpe organoiderne med at udvide længere. For det andet kan organoiderne ikke lide at være enkelte celler fortløbende og ofte. De hepatocyt-afledte organoider synes at rekapitulere den regenerative respons af voksne lever efter delvis hepatektomi, men de er stadig forskellige fra quiescent modne hepatocytter.
Bemærk, ved hjælp af hepatocyt organoider til at udvide hepatocytter åbne nye veje for lever genfunktion undersøgelser. Co-dyrkning organoider med karceller, immunceller og levervirus forventes at yderligere studere angiogenese, mikromiljø og smitsom leversygdom. Et standard high-hele screen system med disse organoider anbefales også til en ex vivo afgiftning undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen konflikter.
Acknowledgments
Vi takker professor Hans Clevers for venligt at give cellelinjer til at producere rekombinant R-spondin1. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R &D Program of China (2019YFA01111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Fondene for Ungdomsinterdisciplinær og Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
