Summary
Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.
Abstract
De lever is het grootste orgaan bij zoogdieren. Het speelt een belangrijke rol bij glucoseopslag, eiwitsecretie, metabolisme en ontgifting. Als uitvoerder voor de meeste leverfuncties hebben primaire hepatocyten een beperkte prolifererende capaciteit. Dit vereist de oprichting van ex vivo hepatocytenexpansiemodellen voor leverfysiologisch en pathologisch onderzoek. Hier isoleerden we muriene hepatocyten door twee stappen van collagenaseperfusie en stelden we een 3D-organoïde cultuur vast als de 'mini-lever' om cel-celinteracties en fysieke functies samen te vatten. De organoïden bestaan uit heterogene celpopulaties waaronder voorlopers en volwassen hepatocyten. We introduceren het proces in detail om de muriene hepatocyten of foetale hepatocyten te isoleren en te kweken om organoïden te vormen binnen 2-3 weken en laten zien hoe ze te passeren door mechanisch op en neer te pipetteren. Daarnaast zullen we ook introduceren hoe de organoïden in afzonderlijke cellen kunnen worden verteerd voor lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering. De organoïden kunnen worden gebruikt voor medicijnscreening, ziektemodellering en fundamenteel leveronderzoek door leverbiologie en pathobiologie te modelleren.
Introduction
Organoïden zijn zelfgeorganiseerde, driedimensionale (3D) in vitro clusters die zelfvernieuwende stamcellen en multi-lineage gedifferentieerde cellen bevatten1,2. De organoïden van veel organen zijn vastgesteld uit pluripotente of volwassen stamcellen door goed gedefinieerde nichefactoren, waaronder de darm, de hersenen, de dikke darm, de nier, de lever, de alvleesklier, de schildklier, de maag, de huid en de long3,4,5,6,7 . De organoïden recapituleren fysieke celfuncties door ofwel ontwikkeling na te bootsen (afkomstig van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, PSC's) of homeostase / regeneratieprogressie (afkomstig van volwassen stamcellen, ASC's), wat nieuwe wegen opent in ziekteonderzoek en -therapie8,9.
Als grootste orgaan bij zoogdieren is de lever vooral verantwoordelijk voor opslag, metabolisme en ontgifting. Twee soorten epitheelceltypen, hepatocyten en cholangiocyten, construeren de basiseenheid van een leverlobule. Hepatocyten zijn verantwoordelijk voor 70-80% van de leverfunctie10. Hoewel de lever een opmerkelijk regeneratievermogen heeft, gebeurt snel verlies van hepatocytenkenmerken tijdens traditionele monolaagkweek door ontregelde celpolarisatie en dedifferentiatie, waardoor de behoefte van onderzoekers en clinici om 'gap-bridging' levermodellen in een schaal te bouwen, toeneemt. Tot voor kort waren de ex vivo expansiemodellen van primaire hepatocyten echter niet goed vastgesteld11,12,13,14,15. Leverorganoïden kunnen worden vastgesteld uit embryonale / geïnduceerde pluripotente stamcellen, fibroblastconversie in hepatocytachtige cellen en weefsel-afgeleide cellen. De ontwikkeling van leverorganoïden stimuleert de toepassing van een in vitro model voor geneesmiddelenscreenings en levertoxiciteitstests16,17.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het vaststellen van leverorganoïden uit muriene primaire hepatocyten. Door dit protocol te gebruiken, hebben we een in vitro kweeksysteem van hepatocytenorganoïden opgezet met twee perfusies van collagenase. Deze organoïden kunnen maandenlang worden gepasseerd voor langdurige expansie. Hun fysiologische functie is zeer consistent met hepatocyten. Verder geven we ook een gedetailleerde beschrijving van hoe genetische manipulatie kan worden uitgevoerd, zoals lentivirusinfectie, siRNA-transductie en CRISPR-Cas9-engineering met behulp van organoïden. De verspreiding van hepatocytenorganoïden werpt licht op de mogelijkheid om organoïden te gebruiken om leverbiologie te begrijpen en gepersonaliseerde en translationele medische benaderingen te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de School of Basic Medical Sciences aan de Shandong University en werden uitgevoerd volgens de licentie onder de richtlijnen en voorschriften van het ministerie van Binnenlandse Zaken (nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
OPMERKING: Dit protocol wordt voornamelijk gebruikt om 3D-organoïden te kweken uit geïsoleerde primaire hepatocyten.
1. Oprichting van Murine Hepatocyte Organoid Culture
OPMERKING: Extracellulaire matrix zoals Matrigel of BME worden gebruikt als de keldermatrix om organoïden te kweken. Bewaar de extracellulaire matrix bij -20 °C en ontdooi deze voor bij 4 °C of op ijs. Houd de extracellulaire matrix op ijs tijdens de experimenten. Het wasmedium is Advanced DMEM/F12 aangevuld met GlutaMAX, HEPES en penicilline/streptomycine. Een standaard incubator (37 °C, bevochtigde atmosfeer, 5% CO2) wordt gebruikt voor organoïde cultuur.
- Voorbereiding van materialen
- Bereid de instrumenten voor die nodig zijn voor het experiment: het muiskussen, steriele chirurgische instrumenten zoals pincetten, scharen, buizen en een pomp met een debiet van 2-10 ml / min.
- Bereid de reagentia voor, inclusief de perfusiebuffer, de digestiebuffer en maak ze steriel voor hepatocytenisolatie. Voeg vers type IV collagenase (0,10 mg/ml) en CaCl2 (0,50 M) toe en verwarm de buffer voor bij 37 °C in een waterbad.
- Bereid het voorwaardelijke medium voor om R-spondin 1 en alle chemische en groeifactorvoorraden te produceren volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Vermijd het vaak invriezen en ontdooien van het voorwaardelijke medium en de voorraden. Bereid het kweekmedium vers en gebruik het binnen een maand. Dit is van cruciaal belang voor de efficiëntie van organoïdevorming.
- Murine hepatocytenisolatie door leverperfusie en spijsvertering
OPMERKING: Mannelijke of vrouwelijke muizen tussen de leeftijd van 12 weken en 6 maanden werden gebruikt voor organoïde cultuur. Er werden geen duidelijke verschillen gevonden in de efficiëntie van organoïdevorming vanaf de leeftijd van de donormuis binnen dit bereik.- Euthanaseer de muis met een ethisch goedgekeurde methode.
- Bevestig de muis op het muiskussen en reinig de buikvacht en huid met 70% alcohol. Stel de buik bloot en til de lever boven de rest van het lichaam uit. Maak een middellijnincisie om de lever bloot te leggen.
- Vul de buis die aan de pomp is bevestigd met een perfusiebuffer. Maak een incisie van de poortader (ongeveer 1/3 van de diameter van de ader) en plaats er voorzichtig een katheter in. Til de spijsverteringsorganen op om de canule in te brengen. Een stropdas met de operatielijn is optioneel om uitglijden en scheuren te voorkomen.
- Start de pomp en voer de perfusie uit met een debiet van 5-7 ml/min met perfusiebuffer. Als de lever onmiddellijk bleek wordt, snijd dan de inferieure vena cava om de perfusiebuffer door de hele lever te laten stromen en het bloed eruit te drijven.
- Wanneer de uitstroom schoon wordt, verwijder je de canule. Het duurt ongeveer 5-10 minuten.
- Vervang de perfusiebuffer met een voorverwarmde digestiebuffer met een snelheid van 5 ml/min. Stop de pomp niet totdat de lever zacht wordt en opzwelt. Verwijder de katheter wanneer de lever stopt met zwellen.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om de juiste verteringstijd te houden om overmatige spijsvertering te voorkomen en enkele levercellen te krijgen. - Snijd de lever af en leg deze in een plaat van 100 mm gevuld met 15 ml koud wasmedium. Knip de ligamenten door met een kleine schaar. Scheur de lever in stukjes met pipetpunten of een tang.
- Pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen vrij te geven totdat de buffer verzadigd is met cellen (12-15 keer). Giet de celsuspensie in een buis van 50 ml door filters van 70 μm.
- Centrifugeer gedurende 1-3 minuten bij 50 x g en 4 °C. Decanteer het bovennatuurlijke. Optioneel resuspend de cellen met wasmedium of resuspend de cellen met kweekmedium direct. Tel de cellen met een hemacytometer.
- Onderscheid levende of dode cellen door de celtellermachine na levende celkleurstofkleuring.
OPMERKING: Het is het beste om hepatocyten te zuiveren met behulp van koude 40% Percoll. Na deze stap bevinden levensvatbare hepatocyten zich op de bodem van de buizen.
- Organoïde cultuur en passage
- Verwijder het supernatant en resuspend de hepatocyten met een mengsel van extracellulaire matrix en kweekmedium in een verhouding van 3:1.
OPMERKING: 10.000-20.000 cellen in een mengsel van 50-60 μL per put voor een plaat met 24 putten worden aanbevolen. Het is belangrijk om snel te werken en het mengsel gedurende het hele proces op ijs te houden. Bij deze concentratie konden 200-500 organoïden worden gevormd. - Voeg de cel/mengseldruppel met kleine druppeltjes op het bord toe om te voorkomen dat de druppel met elkaar verbindt. Incubeer de plaat in de celincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5-10 minuten en haal de plaat er vervolgens 20-25 minuten uit totdat de extracellulaire matrix vast wordt.
- Voeg kweekmedium (500 μL per put voor een 24-putplaat) toe aan de putjes en breng de plaat terug naar de incubator voor organoïdekweek. Vervang het medium elke 3-4 dagen. Observeer de organoïden totdat ze groot genoeg zijn om te worden gepasseerd.
OPMERKING: Een diameter met ongeveer 400-500 μm is geschikt voor passage van hepatocytenorganoïden. - Isoleer organoïden uit de extracellulaire matrix met het onderstaande gedetailleerde proces. Houd een glazen Pasteur pipet in een vlam om de opening te verkleinen (met ~ 1/2). Pipetteer mechanisch 5-10 keer op en neer om de organoïden tijdens het passeren te dissociëren in kleinere organoïden.
OPMERKING: Bereid tijdens het passeren voorgewassen micropipette-tips en -buizen voor met tip-washbuffer om het verlies van organoïden die aan de buizen of tips blijven kleven te voorkomen.
- Verwijder het supernatant en resuspend de hepatocyten met een mengsel van extracellulaire matrix en kweekmedium in een verhouding van 3:1.
2. Genetische manipulatie van murine hepatocyten organoïden
- Enkele cellen van hepatocytenorganoïden
- Voeg 500 μL koude wasmedium/celterugwinningsoplossing toe aan elke put. Pipetteer op en neer om het cel/extracellulaire matrixmengsel met een micropipette te vernietigen en breng vervolgens de organoïde suspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml op ijs. Draai de buis van tijd tot tijd op en neer om het mengsel grondig te ontdooien.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500-800 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Voeg 1 ml trypsine-oplossing toe aan de pellet en pipetteer deze om te mengen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 minuten en stop vervolgens de spijsvertering door een 2x volume wasmedium toe te voegen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet met kweekmedium en tel de cellen met behulp van een hemacytometer.
- siRNA of plasmide transfectie
OPMERKING: Kleinere organoïden met een diameter van minder dan 50 μm of enkele cellen van hepatocytenorganoïden worden getransfecteerd met siRNA met behulp van lipofectamine of plasmiden met transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant.- Meng siRNA of plasmiden met transfectiereagens. Voeg afzonderlijke cellen van organoïden en het lipofectamine-RNA/lipo-plasmidemengsel (bijv. RNAiMAX) toe aan 1-2 putjes in de 24-putplaat en centrifugeer gedurende 1 uur bij 500 x g en 32 °C. Incubeer na centrifugeren de plaat in de couveuse gedurende 4-5 uur bij 37 °C.
- Verzamel de cellen en zaad in extracellulaire matrix met kweekmedium in een concentratie van 10.000 cellen per put. Verander het medium in de selectieconditie twee dagen na transfectie. Beoordeel de organoïde-vormingsefficiëntie na 10 dagen.
- Lentivirale infectie
OPMERKING: Kleine organoïden met een diameter van minder dan 50 μm of enkele cellen van hepatocytenorganoïden worden geïnfecteerd door lentivirus met behulp van infectiereagentia medium volgens de instructies van de fabrikant.- Meng 250 μL van de eencellige suspensie van de organoïde en 250 μL virale deeltjes in een buis van 1,5 ml.
- Verguld het mengsel en centrifugeer gedurende 1 uur bij 500 x g en 32 °C. Incubeer gedurende 4-5 uur bij 37 °C.
- Verzamel de cellen en zaad in extracellulaire matrix met kweekmedium. Verander het medium in de selectieconditie twee dagen na transfectie. Beoordeel de organoïde-vormingsefficiëntie na 10 dagen.
- Genetische manipulatie door CRISPR/Cas9
OPMERKING: We bieden video voor deze uitvoering in de aanvullende materialen. Afzonderlijke cellen van organoïden werden geïnfecteerd met lentivirus of getransfecteerd door plasmiden die sgRNA en Cas9 droegen.- Verteer afzonderlijke cellen van hepatocytenorganoïden gekweekt en passage volgens de bovenstaande methode.
- Infecteer afzonderlijke cellen met sgRNA met behulp van Opti-MEM-medium en infectiereagentia volgens de instructies van de fabrikant.
- Meng 250 μL van een eencellige suspensie en 250 μL virale deeltjes samen in een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer het mengsel van 500 μL gedurende 1 uur bij 500 x g en 32 °C en incubeer vervolgens gedurende 4-5 uur bij 37 °C.
- Verzamel de celsuspensie en zaad in extracellulaire matrix. Beoordeel de organoïde-vormingsefficiëntie na 10 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hepatocytenorganoïden van vrouwelijke Alb-Cre; Rosa26-GFP-muizen (8 weken) werden vijf dagen na het zaaien waargenomen (figuur 1A). De organoïden woekeren met Ki67 positieve kleuring (figuur 1B). Interfererende expressie van representatieve genen in hepatocytenorganoïden door siRNA-transfectie of lentivirusinfectie werd onderzocht met qRT-PCR en western blot. De resultaten zijn weergegeven in figuur 2A en 2B. Figuur 2C toont de selectieresultaten van leverorganoïden na 14 dagen behandeling met RSL-3 en het CRISPR/Cas9 genomische bibliotheekscherm. De resultaten suggereren dat deze organoïden in vitro kunnen worden uitgebreid en genetisch kunnen worden gemanipuleerd.
Figuur 1: Vestiging en expansie en van murine hepatocyten organoïden. (A) Representatief beeld van hepatocytenorganoïden uit Alb-Cre; Rosa26-GFP. De schaalbalk is 400 μm. (B) Representatief beeld van hele mount staning van hepatocytenorganoïden met b-catenine en Ki67 antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Genetische manipulatie van murine hepatocyten organoïden. (A) Het mRNA-niveau van Hdac3 en Wee1 ten opzichte van GAPDH in hepatocytenorganoïden na transfectie met siRNA. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten (n=3). (B) Westerse boutanalyse van organoïden geïnfecteerd door lentivirus. (C) Representatief beeld van leverorganoïden na CRISPR-Cas9-scherm in kweekmedium met RSL-3-selectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend materiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om volwassen hepatocyten gedurende lange perioden te kweken is van fundamenteel belang bij het bestuderen van de basiswetenschap van de lever, medicijntoxicologie en hepatotrope gastheer-microbiologische infecties zoals malaria en de hepatitisvirussen. Met een goed gedefinieerde niche zet het protocol hier een kweeksysteem op voor hepatocyten. Dit protocol drijft volwassen hepatocyten om uit te breiden in 3D-cultuur met een heterogeniteit die cel-celinteractie, de meeste hepatocytenfunctie en genetische modificaties samenvat, waardoor het ontwerp van genfunctiestudies en nieuwe therapeutische wegen naar regeneratieve therapie mogelijk wordt.
Hoge kwaliteit hepatocyten zijn erg belangrijk voor de oprichting en genetische manipulatie van hepatocytenorganoïden. De verteringstijd van collagenasebehandeling is vrij kritisch. Er blijven echter enkele beperkingen in de methode. Ten eerste worden meer nichefactoren voorgesteld in een proef om de organoïden langer uit te breiden. Ten tweede houden de organoïden er niet van om achtereenvolgens en vaak enkele cellen te zijn. De van hepatocyten afgeleide organoïden lijken de regeneratieve respons van volwassen levers na gedeeltelijke hepatectomie te recapituleren, maar ze verschillen nog steeds van rustige volwassen hepatocyten.
Van belang is dat het gebruik van hepatocytenorganoïden om hepatocyten uit te breiden nieuwe paden opent voor levergenfunctiestudies. Co-culturing organoïden met vaatcellen, immuuncellen en levervirussen zullen naar verwachting angiogenese, micro-omgevingen en infectieuze leverziekte verder bestuderen. Een standaard high-throughout schermsysteem met deze organoïden wordt ook aanbevolen voor een ex vivo ontgiftingsonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs onthullen geen conflicten.
Acknowledgments
We danken professor Hans Clevers voor het verzorgen van de cellijnen om recombinant R-spondin1 te produceren. Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het National Key R & D-programma van China (2019YFA0111400), de National Natural Science Foundation of China (31970779) aan H.H., en de Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group van Shandong University (2020QNQT003) aan H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
