Summary
माउस हेपेटोसाइट्स से एक दीर्घकालिक पूर्व विट्रो 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई थी। इन ऑर्गेनोइड्स को पारित किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से shRNA / एक्टोपिक निर्माण, siRNA अभिकर्मक और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग के lentivirus संक्रमण द्वारा हेरफेर किया जा सकता है।
Abstract
जिगर स्तनधारियों में सबसे बड़ा अंग है। यह ग्लूकोज भंडारण, प्रोटीन स्राव, चयापचय और विषहरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जिगर के अधिकांश कार्यों के लिए निष्पादक के रूप में, प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में सीमित प्रसार क्षमता होती है। इसके लिए जिगर शारीरिक और रोग संबंधी अनुसंधान के लिए पूर्व विवो हेपेटोसाइट विस्तार मॉडल की स्थापना की आवश्यकता होती है। यहां, हमने कोलेजेनेस परफ्यूजन के दो चरणों से मुरीन हेपेटोसाइट्स को अलग किया और सेल-सेल इंटरैक्शन और भौतिक कार्यों को दोहराने के लिए 'मिनी-लिवर' के रूप में एक 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की। ऑर्गेनोइड्स में पूर्वजों और परिपक्व हेपेटोसाइट्स सहित विषम कोशिका आबादी होती है। हम 2-3 सप्ताह के भीतर ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए मुरीन हेपेटोसाइट्स या भ्रूण हेपेटोसाइट को अलग करने और संस्कृति करने के लिए विस्तृत रूप से प्रक्रिया का परिचय देते हैं और दिखाते हैं कि यांत्रिक रूप से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके उन्हें कैसे पारित किया जाए। इसके अलावा, हम यह भी पेश करेंगे कि shRNA / एक्टोपिक निर्माण, siRNA अभिकर्मक और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग के लेंटिवायरस संक्रमण के लिए एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड्स को कैसे पचाया जाए। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग दवा स्क्रीन, रोग मॉडलिंग और जिगर जीव विज्ञान और पैथोबायोलॉजी के मॉडलिंग द्वारा बुनियादी जिगर अनुसंधान के लिए किया जा सकता है।
Introduction
ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो क्लस्टर में स्व-संगठित, तीन-आयामी (3 डी) हैं जिनमें स्व-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाएं और बहु-वंश विभेदित कोशिकाएं शामिल हैं1,2। कई अंगों के ऑर्गेनोइड्स को आंत, मस्तिष्क, बृहदान्त्र, गुर्दे, यकृत, अग्न्याशय, थायराइड, पेट, त्वचा और फेफड़ों सहित अच्छी तरह से परिभाषित आला कारकों द्वारा प्लुरिपोटेंट या वयस्क स्टेम कोशिकाओं से स्थापित किया गया है3,4,5,6,7 . ऑर्गेनोइड्स या तो विकास (भ्रूण या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं, पीएससी से उत्पन्न) या होमोस्टैसिस / पुनर्जनन प्रगति (वयस्क स्टेम कोशिकाओं, एएससी से उत्पन्न) की नकल करके भौतिक कोशिका कार्यों को दोहराते हैं, जो रोग अनुसंधान और चिकित्सा में नए रास्ते खोलता है8,9।
स्तनधारियों में सबसे बड़े अंग के रूप में, जिगर मुख्य रूप से भंडारण, चयापचय और detoxification के लिए जिम्मेदार है। दो प्रकार के उपकला सेल प्रकार, हेपेटोसाइट्स और चोलएंजियोसाइट्स, एक जिगर लोब्यूल की मूल इकाई का निर्माण करते हैं। हेपेटोसाइट्स 70-80% जिगर समारोह 10 के लिए जिम्मेदार हैं। यद्यपि जिगर में उल्लेखनीय पुनर्जनन क्षमता होती है, हेपेटोसाइट विशेषताओं का तेजी से नुकसान पारंपरिक मोनोलेयर के दौरान होता है जो डिस्रेगुलेटेड सेल ध्रुवीकरण और विभेदन द्वारा खेती करता है, जो शोधकर्ताओं और चिकित्सकों की आवश्यकता को बढ़ाता है ताकि एक डिश में 'गैप-ब्रिजिंग' यकृत मॉडल का निर्माण किया जा सके। हालांकि, हाल ही में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से पूर्व विवो विस्तार मॉडल अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया था11,12,13,14,15। जिगर organoids भ्रूण / प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं, हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट रूपांतरण, और ऊतक व्युत्पन्न कोशिकाओं से स्थापित किया जा सकता है। जिगर organoids के विकास दवा स्क्रीन और जिगर विषाक्तता assays16,17 के लिए एक इन विट्रो मॉडल के आवेदन को बढ़ाता है.
यहां, हम मुरीन प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से यकृत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने कोलेजेनेस के दो परफ्यूजन के साथ हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स की एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली स्थापित की। इन ऑर्गेनोइड्स को महीनों तक दीर्घकालिक विस्तार के लिए पारित किया जा सकता है। उनका शारीरिक कार्य हेपेटोसाइट्स के साथ अत्यधिक सुसंगत है। इसके अलावा, हम आनुवंशिक हेरफेर करने के तरीके का एक विस्तृत विवरण भी प्रदान करते हैं, जैसे कि लेंटिवायरस संक्रमण, siRNA ट्रांसडक्शन, और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके। हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स का प्रसार यकृत जीव विज्ञान को समझने और व्यक्तिगत और ट्रांसलेशनल दवा दृष्टिकोण विकसित करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने की संभावना पर प्रकाश डालता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी चूहों के प्रयोगों को शेडोंग विश्वविद्यालय में स्कूल ऑफ बेसिक मेडिकल साइंसेज की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और गृह कार्यालय के दिशानिर्देशों और नियमों के तहत लाइसेंस के अनुसार किया गया था (सं। ECSBMSSDU2019-2-079)।
नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग मुख्य रूप से पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से 3 डी ऑर्गेनोइड्स को संस्कृति करने के लिए किया जाता है।
1. Murine हेपेटोसाइट Organoid संस्कृति की स्थापना
नोट: एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स जैसे कि Matrigel या BME का उपयोग संस्कृति organoids के लिए तहखाने मैट्रिक्स के रूप में किया जाता है। -20 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स स्टोर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर पूर्व-पिघलाएं। प्रयोगों के दौरान बर्फ पर बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स रखें। धोने के माध्यम उन्नत DMEM / F12 ग्लूटामैक्स, HEPES और पेनिसिलिन / streptomycin के साथ पूरक है। ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए एक मानक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, ह्यूमिडिफाइड वातावरण, 5% सीओ 2) का उपयोग किया जाता है।
- सामग्री की तैयारी
- प्रयोग के लिए आवश्यक उपकरणों को तैयार करें: माउस तकिया, चिमटी, कैंची, ट्यूब जैसे बाँझ सर्जिकल उपकरण, और 2-10 एमएल / मिनट की प्रवाह दर के साथ एक पंप।
- परफ्यूजन बफर, पाचन बफर सहित अभिकर्मकों को तैयार करें और हेपेटोसाइट अलगाव के लिए उन्हें बाँझ बनाएं। ताजा प्रकार IV कोलेजनेस (0.10 मिलीग्राम / एमएल) और CaCl2 (0.50 एम) जोड़ें और पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर को पूर्व-गर्म करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार आर-स्पॉन्डिन 1 और सभी रासायनिक और विकास कारक स्टॉक का उत्पादन करने के लिए सशर्त माध्यम तैयार करें।
नोट: अक्सर ठंड और सशर्त माध्यम और शेयरों thawing से बचें. संस्कृति माध्यम को ताजा तैयार करें और एक महीने के भीतर इसका उपयोग करें। यह ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है।
- जिगर परफ्यूजन और पाचन द्वारा मुरीन हेपेटोसाइट अलगाव
नोट: 12 सप्ताह और 6 महीने की उम्र के बीच नर या मादा चूहों का उपयोग ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए किया गया था। इस सीमा के भीतर दाता माउस उम्र से ऑर्गेनोइड गठन दक्षता में कोई स्पष्ट अंतर नहीं पाया गया था।- एक नैतिक रूप से अनुमोदित विधि के साथ माउस Euthanize.
- माउस तकिए पर माउस को ठीक करें और 70% अल्कोहल के साथ पेट के फर और त्वचा को साफ करें। पेट को उजागर करें और जिगर को शरीर के बाकी हिस्सों के ऊपर उठाएं। जिगर को उजागर करने के लिए एक मध्यरेखा चीरा बनाएं।
- परफ्यूजन बफर के साथ पंप से जुड़ी ट्यूब को भरें। पोर्टल नस (नस के व्यास का लगभग 1/3) का एक चीरा बनाएं और ध्यान से इसमें एक कैथेटर रखें। प्रवेशनी डालने में मदद करने के लिए पाचन अंगों को ऊपर उठाएं। सर्जिकल लाइन के साथ एक टाई बाहर स्लाइडिंग और rupturing से बचने के लिए वैकल्पिक है।
- पंप शुरू करें और परफ्यूजन बफर के साथ 5-7 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर परफ्यूजन करें। यदि जिगर तुरंत पीला हो जाता है, तो अवर वेना कावा को काट दें ताकि परफ्यूजन बफर को पूरे जिगर के माध्यम से प्रवाहित किया जा सके और रक्त को बाहर निकाला जा सके।
- जब प्रवाह-आउट साफ हो जाता है, तो कैनुला को हटा दें। इसमें लगभग 5-10 मिनट लगते हैं।
- 5 mL / मिनट की दर से पूर्व-गर्म पाचन बफर के साथ परफ्यूजन बफर बदलें। जब तक लिवर सॉफ्ट न हो जाए और फूल न जाए तब तक पंप को न रोकें। जिगर की सूजन बंद होने पर कैथेटर को हटा दें।
नोट: अत्यधिक पाचन से बचने और एकल जिगर की कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उचित पाचन समय रखना बहुत महत्वपूर्ण है। - जिगर को काट लें और इसे 15 मिलीलीटर कोल्ड वॉश माध्यम से भरे 100 मिमी प्लेट में रखें। स्नायुबंधन को छोटी कैंची से काटें। पिपेट युक्तियों या संदंश के साथ टुकड़ों में जिगर को फाड़ दें।
- पिपेट को धीरे-धीरे कोशिकाओं को छोड़ने के लिए नीचे जब तक कि बफर कोशिकाओं (12-15 बार) के साथ संतृप्त न हो जाए। 70 μm फिल्टर के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन डालो।
- 50 x g और 4 °C पर 1-3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। supernatant decant. वैकल्पिक रूप से, धोने के माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें या सीधे संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक hemacytometer के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
- लाइव सेल डाई धुंधला होने के बाद सेल काउंटर मशीन द्वारा जीवित या मृत कोशिकाओं को अलग करें।
नोट: ठंड 40% Percoll का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स को शुद्ध करना सबसे अच्छा है। इस चरण के बाद, व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स ट्यूबों के नीचे होंगे।
- ऑर्गेनोइड संस्कृति और मार्ग
- supernatant निकालें और 3: 1 के अनुपात में extracellular मैट्रिक्स और संस्कृति माध्यम के मिश्रण के साथ हेपेटोसाइट्स resuspend.
नोट: 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए प्रति अच्छी तरह से 50-60 μL मिश्रण में 10,000-20,000 कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है। जल्दी से काम करना और पूरी प्रक्रिया के दौरान मिश्रण को बर्फ पर रखना महत्वपूर्ण है। इस एकाग्रता पर 200-500 ऑर्गेनोइड्स का गठन किया जा सकता है। - ड्रॉपलेट को एक साथ कनेक्ट होने से रोकने के लिए छोटी बूंदों के साथ प्लेट पर सेल / मिश्रण ड्रॉप जोड़ें। सेल इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5-10 मिनट के लिए 5% सीओ 2 और फिर प्लेट को 20-25 मिनट के लिए बाहर निकालें जब तक कि एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स ठोस न हो जाए।
- कुओं में संस्कृति माध्यम (24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए 500 μL प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें और ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर में प्लेट वापस करें। माध्यम को हर 3-4 दिनों में बदलें। ऑर्गेनोइड्स का निरीक्षण करें जब तक कि वे पारित होने के लिए पर्याप्त बड़े न हों।
नोट: लगभग 400-500 μm के साथ एक व्यास हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स के पारित होने के लिए उपयुक्त है। - नीचे दी गई विस्तृत प्रक्रिया के साथ बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स से ऑर्गेनोइड्स को अलग करें। अपने एपर्चर को संकीर्ण करने के लिए एक लौ में एक ग्लास पाश्चर पिपेट को पकड़ो (~ 1/2 द्वारा)। पासिंग के दौरान ऑर्गेनोइड्स को छोटे ऑर्गेनोइड्स में अलग करने के लिए यांत्रिक रूप से 5-10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
नोट: पासिंग के दौरान, ट्यूब या युक्तियों से चिपके ऑर्गेनोइड्स के नुकसान से बचने के लिए टिप-वॉश बफर के साथ पूर्व-धोए गए माइक्रोपिपेट टिप्स और ट्यूब तैयार करें।
- supernatant निकालें और 3: 1 के अनुपात में extracellular मैट्रिक्स और संस्कृति माध्यम के मिश्रण के साथ हेपेटोसाइट्स resuspend.
2. मुरीन हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स के आनुवंशिक हेरफेर
- हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स से एकल कोशिकाएं
- प्रत्येक अच्छी तरह से ठंडा धोने मध्यम / सेल वसूली समाधान के 500 μL जोड़ें। एक माइक्रोपिपेट के साथ सेल / एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स मिश्रण को नष्ट करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे और फिर ऑर्गेनोइड निलंबन को बर्फ पर 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करता है। वैकल्पिक रूप से, मिश्रण को अच्छी तरह से पिघलाने के लिए समय-समय पर ट्यूब को ऊपर और नीचे करें।
- 500-800 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग. गोली के लिए ट्रिप्सिन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और इसे मिश्रण करने के लिए पिपेट करें। 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर धोने के माध्यम की 2x मात्रा जोड़कर पाचन को रोकें।
- 800 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग. संस्कृति माध्यम के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
- siRNA या प्लास्मिड अभिकर्मक
नोट: हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स से 50 μm या एकल कोशिकाओं से कम व्यास वाले छोटे ऑर्गेनोइड्स को निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके लिपोफेक्टामाइन या प्लास्मिड का उपयोग करके siRNA के साथ संक्रमित किया जाता है।- अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ siRNA या plasmids मिश्रण. organoids और Lipofectamine-RNA / लाइपो-प्लास्मिड मिश्रण (जैसे, RNAiMAX) से एकल कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से प्लेट में 1-2 कुओं में जोड़ें और 500 x g और 32 °C पर 1 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज। centrifugation के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- अच्छी तरह से प्रति 10,000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम के साथ बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में कोशिकाओं और बीज को इकट्ठा करें। अभिकर्मक के दो दिन बाद माध्यम को चयन स्थिति में परिवर्तित करें. 10 दिनों के बाद ऑर्गेनोइड-गठन दक्षता का आकलन करें।
- लैंटिवाइरल संक्रमण
नोट: हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स से 50 μm या एकल कोशिकाओं से कम व्यास वाले छोटे ऑर्गेनोइड्स निर्माता के निर्देशों के अनुसार संक्रमण अभिकर्मकों का उपयोग करके लेंटीवायरस से संक्रमित होते हैं।- ऑर्गेनोइड से एकल-सेल निलंबन के 250 μL और एक 1.5 mL ट्यूब में वायरल कणों के 250 μL को मिलाएं।
- 500 x g और 32 °C पर 1 h के लिए मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज प्लेट. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- संस्कृति माध्यम के साथ बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में कोशिकाओं और बीज ले लीजिए। अभिकर्मक के दो दिन बाद माध्यम को चयन स्थिति में परिवर्तित करें. 10 दिनों के बाद ऑर्गेनोइड-गठन दक्षता का आकलन करें।
- CRISPR/Cas9 द्वारा जेनेटिक इंजीनियरिंग
नोट: हम पूरक सामग्री में इस प्रदर्शन के लिए वीडियो प्रदान करते हैं। ऑर्गेनोइड्स से एकल कोशिकाएं लेंटीवायरस से संक्रमित थीं या एसजीआरएनए और कैस 9 ले जाने वाले प्लास्मिड द्वारा संक्रमित थीं।- हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स से एकल कोशिकाओं को पचाएं और उपरोक्त विधि के अनुसार पारित करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑप्टी-एमईएम माध्यम और संक्रमण अभिकर्मकों का उपयोग करके एसजीआरएनए के साथ एकल कोशिकाओं को संक्रमित करें।
- एक एकल सेल निलंबन के 250 μL और वायरल कणों के 250 μL को एक साथ 1.5 mL ट्यूब में मिलाएं।
- 500 x g और 32 °C पर 1 h के लिए 500 μL मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर 37 °C पर 4-5 h के लिए इनक्यूबेट करें।
- बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स में सेल निलंबन और बीज ले लीजिए। 10 दिनों के बाद ऑर्गेनोइड-गठन दक्षता का आकलन करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
महिला Alb-Cre से हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स; Rosa26-GFP माउस (8 सप्ताह) सीडिंग के पांच दिन बाद मनाया गया (चित्रा 1 ए)। ऑर्गेनोइड्स Ki67 सकारात्मक धुंधला (चित्रा 1B) के साथ फैल रहे हैं। हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स में प्रतिनिधि जीन की हस्तक्षेप अभिव्यक्ति या तो siRNA अभिकर्मक या lentivirus संक्रमण द्वारा qRT-PCR और पश्चिमी धब्बा द्वारा जांच की गई थी। परिणाम चित्र 2A और 2B में दिखाए गए हैं। चित्रा 2C RSL-3 और CRISPR / Cas9 जीनोमिक लाइब्रेरी स्क्रीन के साथ उपचार के 14 दिनों के बाद जिगर organoids से चयन परिणामों से पता चलता है। परिणाम बताते हैं कि इन ऑर्गेनोइड्स को विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है।
चित्रा 1: स्थापना और विस्तार और मुरीन हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स की। (ए) अल्ब-क्रे से हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवि; Rosa26-GFP. स्केल बार 400 μm है। (B) बी-कैटेनिन और Ki67 एंटीबॉडी के साथ हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स के पूरे माउंट स्टेनिंग की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: मुरीन हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स का आनुवंशिक हेरफेर। (A) SiRNA के साथ transfected के बाद हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स में GAPDH के सापेक्ष Hdac3 और Wee1 का mRNA स्तर। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करती हैं (n = 3). (बी) लेंटिवायरस से संक्रमित ऑर्गेनोइड्स का पश्चिमी बोल्ट विश्लेषण। (सी) आरएसएल -3 चयन के साथ संस्कृति माध्यम में CRISPR-Cas9 स्क्रीन के बाद जिगर organoids की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक सामग्री. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
लंबे समय तक परिपक्व हेपेटोसाइट्स को संस्कृति करने की क्षमता यकृत के बुनियादी विज्ञान, दवा विष विज्ञान और हेपेटोट्रोपिक होस्ट-माइक्रोबायोलॉजी संक्रमण जैसे मलेरिया और हेपेटाइटिस वायरस का अध्ययन करने में मौलिक है। एक अच्छी तरह से परिभाषित आला के साथ, प्रोटोकॉल यहां हेपेटोसाइट्स के लिए एक संस्कृति प्रणाली स्थापित करता है। यह प्रोटोकॉल परिपक्व हेपेटोसाइट्स को एक विषमता के साथ 3 डी संस्कृति में विस्तार करने के लिए प्रेरित करता है जो सेल-सेल इंटरैक्शन, अधिकांश हेपेटोसाइट फ़ंक्शन और आनुवंशिक संशोधनों को दोहराता है, जिससे जीन फ़ंक्शन अध्ययन और पुनर्योजी चिकित्सा की ओर उपन्यास चिकित्सीय मार्गों के डिजाइन की अनुमति मिलती है।
हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और आनुवंशिक हेरफेर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले हेपेटोसाइट्स बहुत महत्वपूर्ण हैं। कोलेजनेस उपचार का पाचन समय काफी महत्वपूर्ण है। हालांकि विधि में कुछ सीमाएं बनी हुई हैं। सबसे पहले, ऑर्गेनोइड्स को लंबे समय तक विस्तारित करने में मदद करने के लिए एक परीक्षण में अधिक आला कारकों का सुझाव दिया जाता है। दूसरा, ऑर्गेनोइड्स लगातार और अक्सर एकल कोशिकाओं को पसंद नहीं करते हैं। हेपेटोसाइट-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद वयस्क जिगर की पुनर्योजी प्रतिक्रिया को दोहराने के लिए प्रकट होते हैं, लेकिन वे अभी भी क्विसेंट परिपक्व हेपेटोसाइट्स से अलग हैं।
ध्यान दें, हेपेटोसाइट्स का विस्तार करने के लिए हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके यकृत जीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए नए रास्ते खुलते हैं। पोत कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और यकृत वायरस के साथ सह-कृषि ऑर्गेनोइड्स से एंजियोजेनेसिस, माइक्रोएन्वायरमेंट और संक्रामक यकृत रोग का आगे अध्ययन करने की उम्मीद है। इन ऑर्गेनोइड्स के साथ एक मानक उच्च-भर स्क्रीन सिस्टम भी एक पूर्व विवो detoxification अध्ययन के लिए अनुशंसित है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों ने कोई संघर्ष नहीं किया है।
Acknowledgments
हम पुनः संयोजक आर-spondin1 का उत्पादन करने के लिए सेल लाइनों को प्रदान करने के लिए कृपया प्रदान करने के लिए प्रोफेसर हंस Clevers धन्यवाद. इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2019YFA0111400), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31970779) से एचएच को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शेडोंग विश्वविद्यालय के युवा अंतःविषय और नवाचार अनुसंधान समूह (2020QNQT003) के लिए धन एच.एच.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
