Summary
마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.
Abstract
간은 포유류에서 가장 큰 기관입니다. 그것은 포도 당 저장에 중요 한 역할을, 단백질 분 비, 신진 대사 와 해독. 간 기능의 대부분에 대 한 집행자로, 기본 간 세포는 제한 된 증식 용량. 이것은 간 생리및 병리학 연구를 위한 ex vivo 간세포 확장 모형의 설치를 요구합니다. 여기서, 우리는 콜라게나아제 관류의 두 단계로 뮤린 간세포를 분리하고 세포 세포 상호 작용 및 물리적 기능을 재구성하는 '미니 간'으로 3D 오르간 배양을 확립했습니다. 오르가노이드는 선조와 성숙한 간세포를 포함하는 이기종 세포 집단으로 구성됩니다. 우리는 2-3 주 이내에 오르가노이드를 형성하기 위해 뮤린 간세포 또는 태아 간구를 분리하고 배양하고 기계적으로 위아래로 피펫을 하여 통과하는 방법을 보여주는 세부적인 과정을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 shRNA / ectopic 건설, siRNA 트랜스페션 및 CRISPR-Cas9 공학의 렌즈 바이러스 감염을 위한 단하나 세포로 오르가노이드를 소화하는 방법을 소개할 것입니다. 오르가노이드는 간 생물학 및 병리학을 모델링하여 약물 화면, 질병 모델링 및 기본 간 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
오르가노이드는 자가 재생 줄기 세포 및 다중 계면 분화 세포를 포함하는 체외 클러스터에서 자체 조직, 3차원 (3D)입니다1,2. 많은 장기의 오르가노이드는 장, 뇌, 결장, 신장, 간, 췌장, 갑상선, 위, 피부 및 폐3,4,5,6,7을 포함하여 잘 정의 된 틈새 요인에 의해 만능 또는 성인 줄기 세포에서 확립되었습니다. . 오르가노이드는 질병 연구 및 치료에서 새로운 길을 열어주는 개발 (배아 또는 유도 된 만능 줄기 세포, PSC에서 유래) 또는 항상성 / 재생 진행 (성인 줄기 세포, ASC에서 유래)을 모방하여 물리적 세포 기능을 재구성8,9.
포유류에서 가장 큰 기관으로, 간은 주로 저장에 대 한 책임, 신진 대사와 해독. 상피 세포 유형의 두 종류, 간세포 및 담고고, 간 소리의 기본 단위를 구성. 간 세포는 간 기능10의 70-80 %에 대한 책임이 있습니다. 간은 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 간세포 기능의 급속한 손실은 소화 조절 세포 편광과 디차별화에 의해 전통적인 단층 배양 하는 동안 발생, 이는 접시에 '갭 브리징'간 모델을 구축 하는 연구원과 임상의의 필요성을 증가. 그러나, 최근까지 1차 간세포에서 의 전 생체 확장 모델은 잘 확립되지 않았다11,12,13,14,15. 간 오르가노이드는 배아 /유도 만능 줄기 세포, 섬유 아세포 변환에서 간세포와 같은 세포, 및 조직 유래 세포에서 확립 될 수있다. 간 오르가노이드의 개발은 약물 화면 및 간 독성 에 대한 체외 모델의 적용을 향상16,17.
여기에서, 우리는 뮤린 1 차 간 세포에서 간 오르가노이드를 확립하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 콜라게나아제의 두 번의 관류를 가진 간세포 오르가노이드의 체외 배양 시스템을 설정했습니다. 이 오르가노이드는 몇 달 동안 장기 확장을 위해 통과 될 수 있습니다. 그들의 생리 적 기능은 간세포와 매우 일치합니다. 또한, 우리는 또한 렌티 바이러스 감염, siRNA 트랜스듀션 및 ORGANoids를 사용하여 CRISPR-Cas9 공학과 같은 유전 적 조작을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 간 세포 구가노이드의 전파는 간 생물학을 이해하고 개인화된 및 번역 의학 접근을 개발하기 위하여 오르가노이드를 사용하는 가능성에 빛을 비추었습니다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 산동성 기초의과대학의 동물관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며, 홈오피스 지침 및 규정에 따라 면허에 따라 수행되었다(No. ECSBMSSDU2019-2-079).
참고: 이 프로토콜은 주로 격리된 1차 간세포로부터 3D 오르가노이드를 배양하는 데 사용됩니다.
1. 뮤린 헤파토세포 오르간구형 설립
참고: 트리겔 또는 BME와 같은 세포 외 매트릭스는 배양 오르가노이드에 대한 지하 매트릭스로 사용됩니다. 세포외 매트릭스를 -20°C에서 저장하고 4°C 또는 얼음에 미리 해동합니다. 실험 중에 세포외 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오. 워시 매체는 글루타맥스, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 고급 DMEM/F12입니다. 표준 인큐베이터(37°C, 가습된 분위기, 5% CO2)가 오르가노이드 배양에 사용된다.
- 재료의 준비
- 실험에 필요한 기기를 준비하십시오: 마우스 베개, 핀셋, 가위, 튜브, 그리고 2-10 mL/min의 유속이 있는 펌프와 같은 멸균 수술 기구.
- 관류 완충, 소화 버퍼를 포함한 시약을 준비하고 간세포 절연을 위해 멸균합니다. 신선한 타입 IV 콜라게나아제(0.10 mg/mL)와 CaCl2 (0.50M)를 추가하고 수조에서 37°C에서 버퍼를 미리 데우게 한다.
- 제조업체의 지침에 따라 R-spondin 1 및 모든 화학 및 성장 인자 주식을 생산하기 위해 조건부 매체를 준비합니다.
참고: 조건부 매체와 주식을 자주 동결하고 해동하지 마십시오. 문화 매체를 신선하게 준비하고 1 개월 이내에 사용하십시오. 이는 오르가노이드 성형 효율에 매우 중요합니다.
- 간 관류와 소화에 의한 뮤린 간세포 절연
참고: 12주와 6개월 사이의 남성 또는 여성 마우스가 오르가노이드 배양에 사용되었습니다. 이 범위 내의 기증자 마우스 나이에서 오르가노이드 형성 효율에서 명백한 차이가 발견되지 않았습니다.- 윤리적으로 승인된 방법으로 마우스를 안락사시합니다.
- 마우스 베개에 마우스를 고정하고 70 % 알코올로 복부 모피와 피부를 청소합니다. 복부를 노출하고 신체의 나머지 부분 위에 간을 들어 올립니다. 간을 노출하는 중간 절개를 합니다.
- 관류 버퍼로 펌프에 부착된 튜브를 채웁니다. 포털 정맥 (정맥 직경의 약 1/3)을 절개하고 조심스럽게 카테터를 넣습니다. 수통을 삽입하는 데 도움이 소화 기관을 들어 올립니다. 수술 라인과의 넥타이는 미끄러지고 파열되는 것을 피하기 위한 선택 사항입니다.
- 펌프를 시작하고 관류 버퍼로 5-7 mL/min의 유량으로 관류를 수행합니다. 간이 즉시 창백해지면 열등한 베나 카바를 잘라 관류 완충제가 간 전체를 통해 흐르고 혈액을 몰아냅니다.
- 흐름이 깨끗해지면 캐뉼라를 제거합니다. 약 5-10분이 소요됩니다.
- 사전 워밍업 된 소화 버퍼로 회류 버퍼를 5 mL /min의 속도로 변경합니다. 간이 부드러워지고 부풀어 질 때까지 펌프를 멈추지 마십시오. 간이 붓기를 멈출 때 카테터를 제거하십시오.
참고: 과도한 소화를 피하고 단일 간 세포를 섭취하기 위해 적절한 소화 시간을 유지하는 것이 매우 중요합니다. - 간을 잘라 차가운 세척 매체의 15 mL로 채워진 100mm 접시에 배치합니다. 작은 가위로 인대를 잘라냅니다. 파이펫 팁이나 집게로 간을 조각으로 찢습니다.
- 버퍼가 셀로 포화 될 때까지 세포를 부드럽게 위아래로 파이펫 (12-15 배). 70 μm 필터를 통해 50mL 튜브에 셀 서스펜션을 붓습니다.
- 50 x g 및 4 °C에서 1 -3 분 동안 원심 분리기. 상체를 장식합니다. 선택적으로, 세척 매체로 세포를 다시 중단하거나 배양 배지로 세포를 직접 재중단한다. 지주계로 세포를 계산합니다.
- 살아있는 세포 염료 염색 후 세포 카운터 머신에 의해 살아있는 또는 죽은 세포를 구별한다.
참고: 감기 40% 퍼콜을 사용하여 간구를 정화하는 것이 가장 좋습니다. 이 단계 후, 실행 가능한 간세포는 튜브의 바닥에있을 것입니다.
- 오르가노이드 문화와 통로
- 상체를 제거하고 세포외 매트릭스와 배양 배지를 3:1의 비율로 혼합하여 간구를 다시 중단합니다.
참고: 24웰 플레이트당 50-60 μL 혼합물에 10,000-20,000개의 세포가 권장됩니다. 신속하게 작동하고 과정 전반에 걸쳐 얼음에 혼합물을 유지하는 것이 중요합니다. 200-500 organoids이 농도에서 형성 될 수 있었다. - 작은 물방울로 접시에 셀/혼합물 드롭을 추가하여 물방울이 함께 연결되지 않도록 합니다. 37°C에서 세포 인큐베이터에 플레이트를 배양하고 5-10분 동안 5% CO2 를 배양한 다음 세포외 매트릭스가 고체될 때까지 20-25분 동안 플레이트를 꺼낸다.
- 배양 배지(24웰 플레이트의 경우 우물당 500 μL)를 우물에 넣고 접시를 인큐베이터로 돌려보내 오르간성 배양을 위한 배양 배지를 넣습니다. 매 3-4 일마다 매체를 변경합니다. 그들이 통과 될 정도로 큰 때까지 오르가노이드를 관찰.
참고: 약 400-500 μm의 직경은 간세포 오르가노이드의 통과에 적합합니다. - 아래의 상세한 과정과 세포외 매트릭스에서 유기체를 분리합니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 화염에 담고 조리개를 좁히게 합니다(~1/2). 기계적으로 5-10배 이상 피펫을 사용하여 통가노이드를 패시징 중에 더 작은 오르가노이드로 분리합니다.
참고: 패시징 하는 동안, 튜브 또는 팁에 집착 하는 오르가노이드의 손실을 피하기 위해 팁 세척 버퍼와 미리 세척 된 마이크로 피펫 팁과 튜브를 준비.
- 상체를 제거하고 세포외 매트릭스와 배양 배지를 3:1의 비율로 혼합하여 간구를 다시 중단합니다.
2. 뮤린 간세포 오르가노이드의 유전자 조작
- 간세포 유기체에서 단세포
- 각 웰에 500 μL의 냉세척 중간/세포 회수 용액을 추가합니다. 파이펫은 마이크로 파이프로 세포/세포 외 매트릭스 혼합물을 파괴한 다음 얼음 위에 있는 15mL 원심분리기 튜브로 오르가노이드 서스펜션을 옮기위해 위아래로 합니다. 선택적으로, 튜브를 수시로 위아래로 돌려 혼합물을 철저히 해동하십시오.
- 원심분리기는 500-800 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 폐기하고 상류부를 폐기한다. 펠릿에 트립신 용액 1mL을 넣고 파이펫을 섞어 넣습니다. 37°C에서 5-10분 동안 배양한 다음 2배의 세척 매체를 추가하여 소화를 중지합니다.
- 원심분리기는 800 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 폐기하고 상체를 폐기합니다. 배양 배지로 펠릿을 다시 중단하고 패키토미터를 사용하여 세포를 계산합니다.
- siRNA 또는 플라스미드 형질
참고: 직경이 50 μm 미만인 작은 오르가노이드 또는 간세포 오르가노이드의 단일 세포는 제조업체의 지침에 따라 트랜스페션 시약을 사용하여 Lipofectamine 또는 플라스미드를 사용하여 siRNA에 감염됩니다.- siRNA 또는 플라스미드를 트랜스프션 시약과 혼합합니다. 오르가노이드와 리포펙타민-RNA/리포 플라스미드 혼합물(예를 들어, RNAiMAX)에서 1-2개의 우물에 24웰 플레이트및 원심분리기를 500 x g 및 32°C에서 1시간 동안 첨가한다. 원심분리 후, 37°C에서 4-5h의 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
- 음량 10,000세포의 농도로 배양 배지를 가진 세포 외 매트릭스에서 세포와 씨앗을 수집한다. 배지를 전환 후 2일 후에 선택 조건으로 변경합니다. 10일 후에 오르가노이드 형성 효율을 평가합니다.
- 렌티바이러스 감염
참고: 직경이 50 μm 미만이거나 간세포 오르가노이드의 단일 세포를 가진 작은 오르가노이드는 제조업체의 지시에 따라 감염 시약 매체를 사용하여 렌즈바이러스에 감염됩니다.- 오가노이드로부터 단세포 서스펜션 250 μL과 1.5mL 튜브에 바이러스 성 입자의 250 μL을 혼합합니다.
- 혼합물과 원심분리기를 500 x g 및 32°C에서 1h로 플레이트합니다. 37 °C에서 4-5 h에 대한 인큐베이션.
- 배양 배지를 가진 세포 외 매트릭스에서 세포와 씨앗을 수집합니다. 배지를 전환 후 2일 후에 선택 조건으로 변경합니다. 10일 후에 오르가노이드 형성 효율을 평가합니다.
- CRISPR/Cas9의 유전 공학
참고: 이 성능에 대한 비디오를 보충 자료로 제공합니다. 오르가노이드에서 단 하나 세포는 렌즈티바이러스에 감염되거나 sgRNA와 Cas9를 운반하는 플라스미드에 의해 전감염되었습니다.- 상기 방법에 따라 배양및 통로에서 단일 세포를 소화한다.
- 제조 업체의 지침에 따라 Opti-MEM 배지 및 감염 시약을 사용 하 여 sgRNA로 단일 세포를 감염.
- 1.5mL 튜브에 단일 셀 서스펜션의 250 μL과 250 μL의 바이러스 성 입자를 함께 섞는다.
- 원심분리기 500 μL 혼합물은 500 x g 및 32°C에서 1h로 한 다음 37°C에서 4-5h로 배양합니다.
- 세포 외 매트릭스에서 세포 현탁액및 씨앗을 수집합니다. 10일 후에 오르가노이드 형성 효율을 평가합니다.
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Representative Results
여성 Alb-Cre에서 간세포 오르가노이드; Rosa26-GFP 마우스(8주)는 시드 후 5일 후에 관찰되었다(도 1A). 오가노이드는 Ki67 양성 염색(그림 1B)으로 증식하고 있습니다. siRNA 트랜스포션 또는 렌티바이러스 감염에 의한 간세포 오르가노이드에서 대표적인 유전자의 발현을 방해하는 것은 qRT-PCR 및 서부 블롯에 의해 검사되었다. 결과는 그림 2A 및 2B에 표시됩니다. 도 2C 는 RSL-3 및 CRISPR/Cas9 게놈 라이브러리 스크린으로 14일간의 치료 후 간 오르가노이드의 선택 결과를 나타낸다. 결과는 이 오르가노이드가 시험관에서 확장되고 유전으로 조작될 수 있었다는 것을 건의합니다.
그림 1: 소뇨 대두구 오르가노이드의 설립 및 확장. (A) Alb-Cre에서 간세포 오르가노이드의 대표적인 이미지; Rosa26-GFP. 스케일 바는 400 μm. (B) b-카테닌 및 Ki67 항체를 가진 간세포 오르가노이드의 전체 마운트 스탠딩의 대표적인 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뮤린 간세포 오르가노이드의 유전자 조작. (A) siRNA에 감염된 후 간세포 오르가노이드에서 GAPDH에 비해 Hdac3 및 Wee1의 mRNA 수준. 오류 막대는 표준 오류(n=3)를 나타냅니다. (B) 렌티바이러스에 감염된 오르가노이드의 서부 볼트 분석. (C) RSL-3 선택배지에서 CRISPR-Cas9 화면 후 간 오르가노이드의 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
오랜 기간 동안 성숙한 간세포를 배양하는 능력은 간 기초 과학, 약물 독성학 및 말라리아 및 간염 바이러스와 같은 간 세포 - 미생물학 감염을 연구하는 데 기본적입니다. 잘 정의된 틈새 시장을 통해 이 프로토콜은 간세포에 대한 문화 시스템을 설정합니다. 이 프로토콜은 성숙한 간세포가 세포 세포 상호 작용, 대부분의 간세포 기능 및 유전자 변형을 재구성하는 이질성으로 3D 배양에서 확장하도록 유도하여 유전자 기능 연구 및 재생 요법을 향한 새로운 치료 방법을 가능하게합니다.
고품질 간세포는 간세포 오르가노이드의 설립 및 유전 적 조작에 매우 중요합니다. 콜라게나아제 치료의 소화 시간은 매우 중요합니다. 하지만 메서드에 몇 가지 제한 남아 있습니다. 첫째, 더 많은 틈새 요인은 오르가노이드가 더 이상 확장하는 것을 돕기 위하여 예심에서 건의됩니다. 둘째, 오르가노이드는 단일 세포가 연속적으로 자주 되는 것을 좋아하지 않는다. 간세포 유래 오르가노이드는 부분 적인 간 절제술 후 성인 간재생 반응을 재현하는 것처럼 보이지만 여전히 석심 성숙한 간세포와는 다릅니다.
참고, 간 세포 오르가노이드를 사용하여 간 세포를 확장하면 간 유전자 기능 연구를위한 새로운 경로를 열어. 혈관 세포, 면역 세포 및 간 바이러스와 함께 구도 기관을 배양하는 것은 혈관 신생, 미세 환경 및 전염성 간 질환을 추가로 연구 할 것으로 예상됩니다. 이러한 오르가노이드를 가진 표준 고온 스크린 시스템은 또한 ex vivo 해독 연구에 권장됩니다.
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Disclosures
저자는 충돌을 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
한스클레스 교수님이 재조합 R-spondin1을 생성하기 위해 세포주를 친절하게 제공한 것에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 키 R&D 프로그램(2019YFA0111400), 중국 국립자연과학재단(31970779)에서 H.H.H.에 이르는 보조금, 산둥대학교 청소년학혁신연구그룹(2020QNQT003)의 지원으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
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