マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植
Summary
ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。
Abstract
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は癌細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、腫瘍微小環境(TME)内の腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞の起源および補充は不明瞭なままである。このプロトコールは、代理ネオ抗原、オボアルブミン(OVA)、およびTCRトランスジェニックOT-Iマウスを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を採用し、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識する。これらの特徴は、腫瘍形成中の抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。
このモデルを腫瘍移植手術と組み合わせることで、ドナー由来の腫瘍組織を腫瘍マッチした同系レシピエントマウスに移植し、移植ドナー組織へのレシピエント由来免疫細胞の流入を正確に追跡し、腫瘍固有の抗原特異的CD8+および末梢起源抗原特異的CD8+ の免疫応答の解析を可能にした。 T セル。これら2つの集団間で動的な遷移が起こることが判明した。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、腫瘍免疫学に新たな光を当てるであろう。
Introduction
CD8+ T細胞媒介性免疫応答は、腫瘍増殖の制御において極めて重要な役割を果たしている。腫瘍形成の間、ナイーブCD8+ T細胞はMHCクラスI制限様式で抗原認識時に活性化され、続いてエフェクター細胞に分化し、腫瘍塊に浸潤する1,2。しかし、腫瘍微小環境(TME)内では、長期にわたる抗原曝露および免疫抑制因子が、浸潤した腫瘍特異的CD8+ T細胞を「枯渇」3として知られる低応答状態に追いやる。疲弊したT細胞(Tex)は、急性ウイルス感染で生成されたエフェクターまたはメモリーT細胞とは、転写的およびエピジェネティックに区別される。これらのTex細胞は、主に、一連の阻害性受容体の持続性および上昇した発現、ならびにエフェクター機能の階層的喪失によって特徴付けられる。さらに、疲弊したCD8+ T細胞の増殖能の障害は、腫瘍特異的T細胞の数を減少させ、その結果、TME内の残留CD8+ T細胞は、腫瘍進行に対して十分な保護免疫をかろうじて提供することができる3。したがって、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞の維持または強化は、腫瘍抑制に不可欠である。
さらに、免疫チェックポイント遮断(ICB)療法は、T細胞浸潤を増加させることによって腫瘍中のTexを再活性化し、したがって、T細胞数および若返りT細胞機能を若返らせて腫瘍抑制を促進すると考えられている。ICB治療の広範な適用は、がん治療のランドスケープを変え、患者のかなりのサブセットが持続的な応答を経験している4,5,6。それにもかかわらず、大多数の患者およびがんタイプはICBに反応しないか、または一時的にしか反応しない。TMEにおける不十分なT細胞浸潤は、ICB耐性を説明する根底にあるメカニズムの1つであると仮定されている7、8。
いくつかの研究は、患者およびマウスモデルの両方において、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞(TIL)の不均一性を実証している9、10、11、12。腫瘍塊中でT細胞因子-1(TCF1)を発現するCD8+ T細胞のサブセットが幹細胞様特性を示すことが確認されており、これはさらに終末的に疲弊したT細胞を生じさせ、ICB療法後の増殖バーストの原因であることが確認されている12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,22。しかし、抗原特異的TCF1+CD8+ T細胞のごく一部しかTMEに存在せず、ICB23、24、25、26に応答して分化した子孫の拡張プールを生成することが証明されている。この集団の限られたサイズが、腫瘍の進行を制御するために細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の持続性を保証するのに十分であるかどうかは不明のままであり、末梢組織からの補充があるかどうかはさらなる調査を必要とする。さらに、最近の研究は、既存の腫瘍特異的T細胞の再活性化能力が不十分であり、抗プログラム細胞死タンパク質1治療後の新規で以前は存在しなかったクロノタイプの出現を示唆している。これは、チェックポイント遮断に対するT細胞応答が、T細胞クローン27の別個のレパートリーの新たな流入によるものかもしれないことを示す。TMEにおける傍観者の非腫瘍反応性細胞傷害性T細胞画分の存在とともに、これらの知見は、末梢由来CD8+ T細胞の役割を研究するための腫瘍同種移植片モデルの確立を促した11。
これまで、数種類の腫瘍移植、ならびに免疫細胞養子移入が、腫瘍免疫学28の分野において広く用いられてきた。他の組織に由来するTIL、末梢血単核球、および腫瘍反応性免疫細胞は、これらの方法を用いて十分に特徴付けることができる。しかし、全身抗腫瘍免疫と局所抗腫瘍免疫との相互作用を研究する場合、これらのモデルは、末梢に由来する免疫細胞とTMEとの間の相互作用を調べるには不十分であると思われる。ここでは、ドナーから腫瘍マッチレシピエントマウスに腫瘍組織を移植し、レシピエント由来免疫細胞の流入を正確にトレースし、TME中のドナー由来細胞を同時に観察した。
この研究では、代理ネオ抗原オボアルブミンを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を用いて、メラノーマのマウス同系モデルを確立した。TCRトランスジェニックOT-Iマウスは、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI MHC分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識し、B16F10-OVA腫瘍モデルで開発された抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。このモデルを腫瘍移植と組み合わせると、腫瘍固有の抗原特異的CD8+ T細胞と末梢起源の抗原特異的CD8+ T細胞の免疫応答を比較し、これら2つの集団間の動的移行を明らかにした。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、TMEにおける腫瘍特異的T細胞免疫応答のダイナミクスに新しい光を当てる。
Protocol
Representative Results
Discussion
T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、CTLはがん細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、TME内の腫瘍抗原特異的CTLの起源は解明されていない30。この腫瘍移植プロトコールの使用は、幹細胞様TCF1+前駆CD8+ T細胞が存在するにもかかわらず、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞が長期間持続しない可能性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国家自然科学基金(LYに31825011番)と中国国家自然科学財団(31900643番からQHへ、31900656番からZWへ)からの助成金によって支援されました。
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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