Здесь мы представляем протокол трансплантации опухоли для характеристики присущих опухоли и периферийных инфильтрированных опухолью лимфоцитов в модели опухоли мыши. Специфическое отслеживание притока иммунных клеток реципиентного происхождения с помощью проточной цитометрии выявляет динамику фенотипических и функциональных изменений этих клеток при противоопухолевых иммунных реакциях.
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение и пополнение опухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли (TME) остаются неясными. В этом протоколе используется клеточная линия меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген, овальбумин (OVA) и трансгенные TCR OT-I мыши, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой основного комплекса гистосовместимости класса I (MHC) H2-Kb. Эти особенности позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток во время опухолевого генеза.
Комбинируя эту модель с хирургией трансплантации опухоли, опухолевые ткани от доноров были пересажены опухолевым сингенным мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения в трансплантированные донорские ткани, что позволяет анализировать иммунные реакции опухолевых и периферийно-специфических антиген-специфических CD8 + Т-клетки. Было обнаружено, что между этими двумя популяциями происходит динамический переход. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что прольет новый свет на иммунологию опухолей.
CD8 + Т-клеточный иммунный ответ играет ключевую роль в контроле роста опухоли. Во время опухолевого генеза наивные CD8+ Т-клетки активируются при распознавании антигена ограниченным способом MHC класса I и впоследствии дифференцируются в эффекторные клетки и проникают в опухолевую массу 1,2. Однако в микроокружении опухоли (TME) длительное воздействие антигена, а также иммуносупрессивные факторы приводят инфильтрированные опухолеспецифические CD8 + Т-клетки в гипочувствительное состояние, известное как «истощение»3. Истощенные Т-клетки (Tex) отличаются от эффекторных Т-клеток или Т-клеток памяти, генерируемых при острой вирусной инфекции, как транскрипционно, так и эпигенетически. Эти текс-клетки в основном характеризуются устойчивой и повышенной экспрессией ряда тормозных рецепторов, а также иерархической потерей эффекторных функций. Кроме того, нарушение пролиферативной способности истощенных CD8+ Т-клеток приводит к уменьшению количества опухолеспецифических Т-клеток, так что остаточные CD8+ Т-клетки в TME едва ли могут обеспечить достаточный защитный иммунитет против прогрессирования опухоли3. Таким образом, поддержание или подкрепление внутриопухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток незаменимо для подавления опухоли.
Кроме того, считается, что терапия блокады иммунных контрольных точек (ICB) оживляет Tex в опухолях, увеличивая инфильтрацию Т-клеток и, следовательно, количество Т-клеток и омолаживая функции Т-клеток для усиления подавления опухоли. Широкое применение лечения ICB изменило ландшафт терапии рака, при этом значительная часть пациентов испытывает длительные ответы 4,5,6. Тем не менее, большинство пациентов и типов рака не реагируют или только временно реагируют на ICB. Неадекватная инфильтрация Т-клеток в TME была постулирована как один из основных механизмов, объясняющих устойчивость ICB 7,8.
Несколько исследований продемонстрировали гетерогенность инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток (ТИЛ) как у пациентов, так и у мышеймоделей 9,10,11,12. Было подтверждено, что подмножество CD8+ Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточный фактор-1 (TCF1) в опухолевой массе, проявляет свойства, подобные стволовым клеткам, которые могут в дальнейшем привести к терминально истощенным Т-клеткам и ответственны за всплеск пролиферации после терапии ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Однако было доказано, что лишь небольшая доля антиген-специфических TCF1+CD8+ Т-клеток существует в TME и генерирует расширенный пул дифференцированного потомства в ответ на ICB 23,24,25,26. Достаточно ли ограниченного размера этой популяции для обеспечения персистенции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для контроля прогрессирования опухоли, остается неизвестным, и есть ли пополнение из периферийных тканей, требует дальнейшего изучения. Кроме того, недавние исследования свидетельствуют о недостаточной способности к оживлению ранее существовавших опухолеспецифических Т-клеток и появлении новых, ранее не существовавших клонотипов после антизапрограммированного лечения белком гибели клеток 1. Это указывает на то, что реакция Т-клеток на блокаду контрольных точек может быть обусловлена новым притоком отдельного репертуара клонов Т-клеток27. Вместе с присутствием неопухолевой цитотоксической фракции Т-клеток в ТМЭ эти результаты побудили к созданию модели аллотрансплантата опухоли для изучения роли периферийных CD8+ Т-клеток11.
До сих пор несколько видов имплантации опухолей, а также приемный перенос иммунных клеток широко использовались в области иммунологии опухолей28. ТИЛ, мононуклеарные клетки периферической крови и опухолеспособные иммунные клетки, происходящие из других тканей, могут быть хорошо охарактеризованы с помощью этих методов. Однако при изучении взаимодействий между системным и местным противоопухолевым иммунитетом эти модели оказываются недостаточными для изучения взаимодействий между иммунными клетками, полученными с периферии и ТМЭ. Здесь опухолевые ткани были пересажены от доноров мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения и одновременно наблюдать за клетками донорского происхождения в TME.
В этом исследовании была установлена мышиная сингенная модель меланомы с клеточной линией меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген овальбумин. Трансгенные мыши TCR OT-I, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой MHC класса I H2-Kb, позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток, разработанные в модели опухоли B16F10-OVA. Сочетая эту модель с трансплантацией опухоли, иммунные реакции присущих опухоли и происходящих на периферии антиген-специфических CD8 + Т-клеток сравнивались, чтобы выявить динамический переход между этими двумя популяциями. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что проливает новый свет на динамику опухолеспецифических иммунных реакций Т-клеток в TME.
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем CTL играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение опухолевых антиген-специфических CTL в TME не было выяснено30. Использование этого протокола трансплантации опухо?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук для выдающихся молодых ученых (No 31825011 для LY) и Национального фонда естественных наук Китая (No 31900643 для QH, No 31900656 для ZW).
0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |