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Immunology and Infection

इंजीनियर एचईके कोशिकाओं का उपयोग करके एमआरजीपीआरएक्स 2 को सक्रिय करने वाले पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62448

Summary

एमआरजीपीआरएक्स 2 रिसेप्टर के माध्यम से मस्तूल कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं कि छोटे पेप्टाइड्स की एक पुस्तकालय पैदा करने के लिए तकनीक वर्णित हैं। संबद्ध तकनीकें आसान, सस्ती हैं, और अन्य सेल रिसेप्टर्स में विस्तारित की जा सकती हैं।

Abstract

चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण सेल रिसेप्टर्स के लिए विशिष्ट लिगांड की पहचान करना कई अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें नए चिकित्सीय के डिजाइन और विकास शामिल हैं। मास से संबंधित जी-प्रोटीन रिसेप्टर-X2 (MRGPRX2) एक महत्वपूर्ण रिसेप्टर है जो मस्तूल सेल सक्रियण को नियंत्रित करता है और इस प्रकार, सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को निर्देशित करता है। एमआरजीपीआरएक्स2 के लिए कई लिगामेंट्स की पहचान की गई है और इसमें पाम्स, डिवेंसिन, एलएल-37 और अन्य प्रोटीन टुकड़े (यानी, अपमानित एल्बुमिन) जैसे अंतर्जात पेप्टाइड्स शामिल हैं। एमआरजीपीआरएक्स 2 विशिष्ट लिगामेंट्स की आगे की पहचान के लिए बड़ी संख्या में पेप्टाइड्स (यानी पेप्टाइड लाइब्रेरी) की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है; हालांकि, मस्त कोशिकाओं को इन विट्रो बनाए रखने के लिए मुश्किल और महंगा है और इसलिए, बड़ी संख्या में अणुओं की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए किफायती नहीं है। वर्तमान कागज एचईपीपीएक्स 2 को व्यक्त करते हुए एचईपीपीएक्स 2 का उपयोग करके छोटे पेप्टाइड अणुओं के पुस्तकालय को डिजाइन, विकसित करने और स्क्रीन करने की एक विधि को दर्शाता है। यह सेल लाइन बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान और सस्ती है और इन विट्रो हाई-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। सक्रियण पर इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लक्स को चिह्नित करने के लिए कैल्शियम संवेदनशील फ्यूरा-2 फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग सक्रियण की निगरानी के लिए किया गया था। कैल्शियम एकाग्रता की गणना के लिए 340 और 380 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के खिलाफ 510 एनएम पर फ्यूरा-2 की फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात का उपयोग किया गया था। इस प्रणाली को सत्यापित करने के लिए उपयोग की जाने वाली पेप्टाइड लाइब्रेरी अंतर्जात प्रोड्रेनोमेदुललिन एन-टर्मिनल 12 (पीएएमपी-12) स्रावगोग पर आधारित थी, जिसे उच्च विशिष्टता और आत्मीयता के साथ एमआरजीपीआरएक्स2 को बांधने के लिए जाना जाता है। इसके बाद पेप्टाइड्स अमीनो एसिड ट्रंकेशन और पीएएमपी-12 पर लागू एलनिन स्कैनिंग तकनीकों के माध्यम से उत्पन्न हुए थे। यहां वर्णित विधि बाध्यकारी डोमेन और अन्य महत्वपूर्ण मापदंडों की पहचान करने के लिए यौगिकों की एक बड़ी लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग के लिए सरल और सस्ती अभी तक मजबूत है जो रिसेप्टर सक्रियण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

Introduction

मस्त कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अभिन्न हिस्सा हैं और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। मस्तूल कोशिकाओं को मुख्य रूप से इम्यूनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) के लिए एंटीजन के बंधन से सक्रिय किया जाता है - एफसीεआरआई रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स, या हाल ही में खोजे गए मास संबंधित जी-प्रोटीन रिसेप्टर-X2 (एमआरजीपीआरएक्स2) 1द्वारा। MRGPRX2 सक्रियण को कई प्रतिरक्षा और भड़काऊ रोगों से जोड़ा गया है, और इसलिए, रिसेप्टर के बाध्यकारी तंत्र को इसके लिगांड2से समझना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, एचईसी कोशिकाओं में अतिव्यक्त किए गए एमआरजीपीआरएक्स 2 रिसेप्टर्स के खिलाफ छोटे पेप्टाइड अणुओं की एक लाइब्रेरी विकसित और जांच की गई। अध्ययन में, पेप्टाइड लाइब्रेरी का निर्माण एलेनिन स्कैनिंग और अमीनो एसिड ट्रंकेशन की सरल और बहुमुखी तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। एलनिन स्कैनिंग में एक एलेनिन अवशेषों के साथ विशिष्ट अमीनो एसिड की जगह शामिल है। एलनिन छोटा और तटस्थ होने के नाते, प्रतिस्थापित अवशेषों द्वारा प्रदत्त विशिष्ट गुणों के पेप्टाइड को स्ट्रिप्स करता है और लगातार रिसेप्टर इंटरैक्शन में अमीनो एसिड के संबंधित फिजियोकेमिकल गुणों के महत्व पर प्रकाश डालता है। इसके विपरीत, अमीनो एसिड ट्रंकेशन में, पेप्टाइड दृश्यों को इस तरह डिज़ाइन किया गया है कि एन-टर्मिनल, सी टर्मिनल या दोनों से एक या अधिक अमीनो एसिड अवशेषों का अभाव है। पेप्टाइड्स के इस सेट का उपयोग एमआरजीपीआरएक्स 2 बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण अमीनो एसिड दृश्यों की पहचान करने के लिए किया गया था।

मानव मस्तूल कोशिकाओं लाइनों (बालक-2) के साथ अनुभव से पता चला है कि इन कोशिकाओं को संस्कृति और विट्रो मेंबनाए रखने के लिए मुश्किल है: दो सप्ताह के एक दोहरीकरण समय, महंगी मध्यम की खुराक, और सीधे ध्यान 3 passagingके दौरानआवश्यक है । ये गुण कोशिकाओं को संभावित लिगामेंट्स की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुपयुक्त बनाते हैं। इसके साथ ही, एमआरजीपीआरएक्स2 रिसेप्टर (एचईके-एक्स2) को व्यक्त करने वाली हेक कोशिकाओं का उपयोग पेप्टाइड लाइब्रेरी1को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। HEK-293 कोशिकाओं का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और उनके उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता, तेजी से दोहरीकरण दर, और प्रयोगशाला 4 में सुसंस्कृत होने के लिए गैर-महंगे मध्यम पूरक की आवश्यकता के कारण सतह रिसेप्टर्स की विषम अभिव्यक्ति के लिए अध्ययन कियाजाताहै। HEK-293 सेल लाइन को स्थानांतरित करने के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया है और यह अच्छी तरह सेस्थापित है 5। एचईके-293 कोशिकाओं ने एमजेपीपीआरएक्स2 रिसेप्टर (मार्ग 13-19) को एन-ट्रंकेशन, सी-ट्रंकेशन, एन + सी-ट्रंकेशन और एलनिन स्कैनिंग1के माध्यम से उत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ सक्रिय किया गया था। जंगली प्रकार HEK कोशिकाओं (HEK-WT) (मार्ग 16-21) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । सक्रियण पर इंट्रासेलुलर कैल्शियम रिलीज एमआरजीपीआरएक्स 2 आधारित सक्रियण का अध्ययन करने के लिए निगरानी की गई थी।

एमआरजीपीआरएक्स2 द्वारा सेल एक्टिवेशन के बाद साइटोसोलिक कैल्शियम जुटाने का काम किया जाता है। मस्त कोशिकाओं में यह विनियमित इंट्रासेलुलर कैल्शियम रिलीज स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (एसओसीई) द्वारा विनियमित किया जाता है, जो स्ट्रोमल इंटरैक्शन अणु 1 (STIM1) द्वारा समन्वित है; और इम्यून रिस्पांस कैस्केड6,7के लिए केंद्रीय है . इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है, जिसमें पैच-क्लैंप और फ्लोरोसेंट रंग8शामिल हैं। उपलब्ध सभी तकनीकों में से, विभिन्न पता लगाने की तकनीकों के साथ संग्राम में फ्लोरोमेट्रिक कैल्शियम रंगों का व्यापक रूप से उपयोग किया जा रहा है9। दो प्रकार के फ्लोरोमेट्रिक रंग जो रुचियों को प्राप्त कर चुके हैं, नामत फ्लोरो-4 जैसे एकल तरंगदैर्ध्य रंग, और दोहरी तरंगदैर्ध्य अनुपात इंडो-1 और फुरा-2 जैसे मितेंद्र रंग। दोहरी तरंगदैर्ध्य अनुपात मित्रिक रंगों से एकल तरंगदैर्ध्य रंगों को लाने का लाभ यह है कि डाई लोडिंग, फोटो ब्लीचिंग और10,11पर ध्यान केंद्रित करने जैसी प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए अनुपातमेट्रिक रंग सही होते हैं।

फ्यूरा-2 एसीटॉक्सीमिथाइल एस्टर (फ्यूरा-2 एएम) एक कोशिका रिस रही है, हरी-फ्लोरोसेंट डाई जिसका उत्तेजन कैल्शियम-बाइंडिंग पर कम तरंगदैर्ध्य में बदल जाता है। प्रायोगिक तौर पर फुरका-2 340 और 380 एनएम पर उत्साहित है, जबकि उत्सर्जन 510 एनएम दर्ज किया गया है। कैल्शियम बाइंडिंग पर, 340 एनएम पर फ्लोरोसेंट तीव्रता बढ़ जाती है जबकि 380 एनएम की कमी हो जाती है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। डेटा को 340 एनएम (F340) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात के रूप में दर्शाया गया है, जो 380 एनएम (F380) यानी एफ 340/F380 पर उत्तेजन के बाद तीव्रता के लिए है। F340/F380 अनुपात इंट्रासेलुलर कैल्शियम के आनुपातिक है, जिसके मूल्य की गणना Grynkiewicz समीकरण12द्वारा की जा सकती है । चूंकि फ्लोरेसेंस सिग्नल दो तरंगदैर्ध्य (340 एनएम और 380 एनएम) पर डाई के उत्तेजन से प्राप्त होता है, इसलिए फ्लोरेसेंस सिग्नल का अनुपात डाई लोडिंग, डाई रिसाव, फोटोब्लाचिंग और सेल घनत्व जैसे प्रायोगिक कारकों के लिए सही होता है।

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Protocol

1. पेप्टाइड लाइब्रेरी का डिजाइन और विकास

  1. एक ज्ञात लिगामेंट यानी पीएएमपी-1213के आधार पर मास्ट सेल MRGPRX2 रिसेप्टर के लिगामेंट्स की पहचान करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. सॉलिड-फेज पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस) द्वारा उत्तराधिकार में लिगांड के एन-टर्मिनल अमीनो एसिड अवशेषों को काटकर एन-कटेड पेप्टाइड लाइब्रेरी उत्पन्न करें।
    2. एसपीपीएस द्वारा उत्तराधिकार में ज्ञात लिगांड के सी-टर्मिनल अमीनो एसिड अवशेषों को काटकर सी-कटेटेड पेप्टाइड लाइब्रेरी उत्पन्न करें।
    3. 1.1.1 और 1.1.2 के परिणामों के आधार पर, क्रमशः एन और सी-टर्मिनल से वांछित अवशेषों को काटकर एसपीपीएस का उपयोग करके एन + सी-कटेड पेप्टाइड लाइब्रेरी उत्पन्न करें।
    4. पेप्टाइड्स13को संश्लेषित करने के लिए ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग करें।
    5. एन-टर्मिनल को एसिटिल (एसी) समूह और सी-टर्मिनल को एमाइड ग्रुप में संशोधित करें।
    6. उच्च दबाव वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके द्रव्यमान के लिए इसकी शुद्धता के लिए पेप्टाइड की विशेषता है।
  2. माता-पिता पीएएमपी-12 अणु के भीतर विशिष्ट अमीनो एसिड के महत्व का अध्ययन करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. पेप्टाइड अणु में संबंधित अमीनो एसिड अवशेषों को एलनिन के साथ बदलकर एक एलनिन स्कैनिंग पेप्टाइड लाइब्रेरी उत्पन्न करें, एक समय में एसपीपीएस का उपयोग करके। एन-टर्मिनल को एसिटिल (एसी) समूह और सी-टर्मिनल को एमाइड ग्रुप में संशोधित करें।
    2. उच्च दबाव वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके द्रव्यमान के लिए इसकी शुद्धता के लिए पेप्टाइड की विशेषता है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि संश्लेषित पेप्टाइड्स उच्च शुद्धता के हैं। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी और एचपीएलसी का उपयोग कर पेप्टाइड्स की विशेषता है।

2. इन विट्रो सेल कल्चर

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके संस्कृति HEK-X2 और HEK-WT कोशिकाओं ।
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यू/एमएल ऑफ पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 माइक्रोग्राम/एमएल के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम के पूरक द्वारा संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    2. ऊतक संस्कृति (टीसी) में कोशिकाओं को पारित करने से टी-75 संस्कृति फ्लास्क का इलाज किया जाता है और 5% सीओ2युक्त 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में बढ़ता है, जब तक कि वे 75-80% कॉन्फ्लूंट न हो जाएं।
    3. एक बार 75% ढुलमुल होने के बाद, कोशिकाओं को धोएं और 2 - 3 मिनट के लिए ट्राइपसिन के 2-3 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर।
    4. एक बार कोशिकाओं को अलग कर दिया है, ट्रिप्पसिन में कोशिकाओं को इकट्ठा। ताजा माध्यम के 6-9 एमएल जोड़ें।
    5. 3-5 मिनट के लिए 1620 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
    6. अपकेंद्रित्र के बाद, पैलेट को इकट्ठा करने के लिए सुपरनेट को त्याग दें। कोशिकाओं को नए सिरे से संस्कृति माध्यम में पुनर्व्यापित करें। वांछित एकाग्रता के अनुसार कोशिकाओं को पतला करें।
      नोट: HEK कोशिकाओं तेजी से बढ़ती कोशिकाओं रहे हैं और इसलिए सेल मध्यम की खुराक का अनुकूलन. HEK कोशिकाएं अनुयायी कोशिकाएं हैं; आसंजन का समर्थन करने के लिए टीसी-इलाज संस्कृति फ्लास्क में उन्हें पारित करना।
  2. प्रयोग के लिए एक 96 अच्छी तरह से परख प्लेट तैयार करें।
    1. प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के २०० μL जोड़ें, २००,००० कोशिकाओं की एकाग्रता के साथ/
    2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में24 घंटे के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
      नोट: प्लेट आकार और सेल तनाव प्रकार के आधार पर प्रति अच्छी तरह सेल घनत्व को अनुकूलित करें। फ्लैट पारदर्शी नीचे के साथ एक काले टीसी-इलाज 96 अच्छी तरह से प्लेट में ट्रिपलिट्स में प्रयोग का संचालन करें।

3. फुरका-2 AM कैल्शियम परख

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके डाई तैयार करें।
    1. प्रयोग के लिए फुरा-2 AM डाई का प्रयोग करें।
    2. हेपीस-टायरोड के बफर (एचटीबी) बफर को तैयार करें जिसमें 25 एमएम हेपेस बफर, 120 एमएमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और हौसले से 1.8 एमएम सीएसीएल2 को ऑटोक्लेव स्टरलाइज्ड पानी में जोड़ा गया ।
    3. 50 माइक्रोन फुरा में डीएमएसओ के 50 माइक्रोन जोड़ें- 2 AM शीशी फरेरा-2 AM डाई का 1 एमएम स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए। 1 μM डाई एकाग्रता वाले डाई लोडिंग माध्यम को तैयार करने के लिए ताजा माध्यम के 1 एमएम फ्यूरा-2 एएम डाई प्रति एमएल का 1 माइक्रोन जोड़ें।
    4. इनक्यूबेटर से 96 वेल प्लेट निकालकर मीडियम को त्याग दें। माध्यम को एक ताजा डाई लोडिंग माध्यम से बदलें। प्रत्येक कुएं में डाई लोडिंग माध्यम के 200 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30-40 मिनट के लिए इनक्यूबेटकरें।
    5. 40 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दें। कोशिकाओं को एचटीबी बफर से धोएं। फ्लोरेसेंस रीडिंग के लिए एचटीबी बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें। फ्लोरेसेंस पढ़ने के लिए थाली लें।
      नोट: डाई लोडिंग माध्यम में डाई की एकाग्रता का अनुकूलन करें। डाई रिसाव और फोटोब्लैचिंग डाई से जुड़ी संभावित चिंताएं हैं। वर्षा से बचने के लिए एचटीबी बफर में सीएसीएल2 ताजा जोड़ें।

4. सेल एक्टिवेशन और फ्लोरोसेंट रीडिंग

नोट: एक स्वचालित पाइपिंग सिस्टम के साथ फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर प्लेट रीडर से प्लेट को बाहर निकालने के बिना एक यौगिक स्रोत से परख प्लेट में यौगिकों के स्वचालित हस्तांतरण की अनुमति देता है।

  1. जबकि कोशिकाओं को इनक्यूबेटेड किया जा रहा है, प्लेट रीडरसेट करें ।
    1. तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. सेटिंग्समें , फ्लेक्सका चयन करें ।
    3. फ्लोरेसेंस और बॉटम रीडकरने के लिए रीड मोड सेट करें।
    4. वेवलेंथ में, वेवलेंथ की संख्या 2 तक सेट करें। 340 एनएम और 380 एनएम करने के लिए उत्तेजन सेट करें। उत्सर्जन को 510 एनएम तक सेट करें।
    5. डिफ़ॉल्टके लिए संवेदनशीलता छोड़ दें ।
    6. समयमें, अंतराल को 3.9 एस तक सेट करें। 25 पढ़ता पाने के लिए ९४ एस के लिए रन टाइम सेट करें ।
    7. इसके बाद, परख प्लेट प्रकारका चयन करें ।
    8. इसके बाद, पढ़ने के लिए कुओं काचयन करें ।
    9. कंपाउंड ट्रांसफरमें, 1 और प्रारंभिक वॉल्यूम को 100 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। 10 वीं रीडिंग में यौगिक जोड़ने के लिए पिपेट हाइट को 100 माइक्रोन, वॉल्यूम को 50 माइक्रोन और टाइम पॉइंट को 36 एस तक सेट करें।
    10. इसके बाद, यौगिक स्रोत प्लेट प्रकार का चयन करें।
    11. इस्तेमाल नहींकरने के लिए ट्राइटुरेट छोड़ दें ।
    12. पिपेट टिप्स लेआउटमें टिप्स चुनें ।
    13. यौगिक और टिप कॉलमके लिए, यह सुनिश्चित करें कि स्थानांतरित किए जाने वाले यौगिक यौगिक प्लेट के कॉलम 1 में हैं। टिप कॉलम को 1 और कंपाउंड कॉलम को 1 सेट करें।
    14. ऑटोकैलिब्रेट को ऑन केरूप में छोड़ दें ।
    15. ठीक क्लिककरें ।
  2. जब तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है, तो प्लेट रीडर में प्लेटों को लोड करें।
    1. फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर में परख प्लेट लगाने के लिए रीडिंग चैंबर दबाएं
    2. यौगिक प्लेट लगाने के लिए स्रोत दबाएं। संबंधित पेप्टाइड्स, आयनोमाइसिन और एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-अमीनोएथिल ईथर) के 200 माइक्रोन जोड़कर यौगिक प्लेट तैयार करें- एन, एन, एन,एन,-टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए) - ट्रिटन एक्स-100 समाधान।
    3. टिप बॉक्स डाल करने के लिए टिप रैक दबाएं। टिप ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए काले टिप का इस्तेमाल करें।
    4. एक बार प्लेटें लोड हो जाने के बाद, सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स की समीक्षा करें और पढ़ें प्रेस करें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. ग्रिनकीविज़ समीकरण द्वारा फ्लोरेसेंस अनुपात से कैल्शियम एकाग्रता निर्धारित करें -
    Equation 1
    कहां, कश्मीरडी फुरा-2 AM का विघटन स्थिर है, आर संबंधित पेप्टाइड्स के लिए 340 एनएम और 380 एनएम (F340/F380) पर उत्तेजना के बाद उत्सर्जन अनुपात है, आरमैक्स अधिकतम फ्लोरेसेंस अनुपात है जो 30 माइक्रोन आयनोमाइसिन के 50 माइक्रोन के अलावा मनाया जाता है, आरमिन न्यूनतम फ्लोरेसेंस है जो 100 एमएम ईजीटीए/2.5% ट्राइटन एक्स-100 के 50 माइक्रोल के अतिरिक्त द्वारा मनाया जाता है। और F380मिनट और F380अधिकतम क्रमशः कैल्शियम मुक्त और बाध्य राज्य में फ्यूरा-2 AM की पूर्ण फ्लोरेसेंस तीव्रता हैं।
    नोट: मशीन कुछ बल के साथ तरल वितरित करती है। पेप्टाइड वितरण ऊंचाई भी थाली के नीचे के करीब सेट न करें; यह कोशिकाओं को अलग कर सकता है। ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए ब्लैक पिपेट टिप्स का इस्तेमाल करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रत्येक प्लेट के लिए अधिकतम फ्लोरेसेंस और न्यूनतम फ्लोरेसेंस पढ़ें।

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Representative Results

तालिका 1 में टर्मिनल अमीनो एसिड ट्रंकेशन और एलेनिन स्कैनिंग के माध्यम से उत्पन्न पेप्टाइड दृश्य शामिल हैं। जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है, पेप्टाइड अनुक्रम आरकेकेडब्ल्यूएनकेवलएसआर में अपने मूल पीएएमपी-12 के संबंध में एन-टर्मिनल फेनिलैनाइन (एफ) का अभाव है और इसलिए एन-कटेटेड लाइब्रेरी में एक प्रतिनिधि पेप्टाइड है। इसी तरह, FRKKWNKWALS में, पीएएमपी-12 सी-टर्मिनल सेरीन को हटा दिया गया है, जो पीएएमपी-12 से प्राप्त सी-कट् ट पेप्टाइड लाइब्रेरी का प्रतिनिधित्व करता है। एन + सी-कटी हुई पेप्टाइड लाइब्रेरी में एन और सी-टर्मिनल दोनों से अमीनो एसिड को हटा दिया जाता है । एन-टर्मिनल से 4 अमीनो एसिड का ट्रंकेशन और पीएएमपी-12 के सी-टर्मिनल से 1 अवशेष ों के परिणामस्वरूप WNKWALS में । एलनिन स्कैनिंग से प्राप्त पेप्टाइड लाइब्रेरी में एक अमीनो एसिड है, जो एलनिन के साथ है, जैसा कि ARKKWNKWALSR के साथ है, जहां एन-टर्मिनल फेनिलैनिन को एलेनिन के साथ प्रतिस्थापित किया गया है। फ्यूरा-2 AM डाई का उपयोग एमआरजीपीआरएक्स2 ट्रांस संक्रमित एचईके कोशिकाओं1के खिलाफ पेप्टाइड्स की सक्रियता क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया गया था। यह डाटा फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर दर्ज किया गया था । यदि पेप्टाइड लिगामेंट ने सेल को सक्रिय किया, तो 340 एनएम (एफ 340) पर पंप फ्लोरेसेंस बढ़ जाता है, जबकि 380 एनएम तरंगदैर्ध्य (F380)(चित्रा 1a)के लिए समान कम हो जाता है। एक खाली (या उस बात के लिए गैर सक्रिय पेप्टाइड या HEK-WT नियंत्रण) के लिए, सापेक्ष वृद्धि और कमी क्रमशः कम होगा, जैसा कि चित्र 2एमें दिखाया गया है । हालांकि, कैल्शियम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व F340/F380 अनुपात द्वारा किया जाता है जैसा कि चित्रा 1b,2bमें दिखाया गया है। अनुपात F340/F380 आगे Grynkiewicz समीकरण में प्रतिस्थापित किया जा सकता है के लिए सीटू अंशांकन(चित्रा 3)में उपयोग कैल्शियम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । तालिका 1 में सूचीबद्ध पेप्टाइड्स को मास स्पेक्ट्रोस्कोपी(चित्रा 4ए)और एचपीएलसी(चित्रा 4बी)की विशेषता थी और यह उच्च शुद्धता का पाया गया था।

पेप्टाइड तकनीक प्रतिनिधि पेप्टाइड
माता-पिता पेप्टाइड एसी-एफआरकेकेडब्ल्यूएनकेवल्सआर-अमीडे
एन-ट्रंकेशन एसी-आरकेकेडब्ल्यूएनकेवल्सआर-अमीडे
सी-ट्रंकेशन एसी-एफआरकेकेडब्ल्यूएनकेवल्स-अमाइड
एन+सी-ट्रंकेशन एसी-WNKWALS-Amide
एलेनिन स्कैनिंग एसी-अर्क्क्वांकवल्सआर-अमीडे

तालिका 1: एन, सी और एन + सी - ट्रंकेशन, और एलेनिन स्कैनिंग के बाद उत्पन्न प्रतिनिधि पेप्टाइड दृश्य। पेप्टाइड्स के एन-टर्मिनल को एसिटाइल संशोधित किया गया था जबकि सी-टर्मिनल में एक एमिड ग्रुप था।

Figure 1
चित्र 1:सक्रिय पेप्टाइड के लिए प्रतिनिधि डेटा। (क)फ्लोरेसेंस एक सक्रिय पेप्टाइड के लिए संकेत देता है। प्रतिनिधित्व डेटा पीएएमपी-12 (FRKKWNKWALSR) से मेल खाती है। पेप्टाइड को 10 रीडिंग चक्र (36 एस) के लिए बेसलाइन पैदा करने के बाद जोड़ा गया था, जैसा कि तीर द्वारा दिखाया गया है। (ख)340 एनएम (एफ340) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात 380 एनएम (एफ380) (एफ340/एफ380) (एफ 340/एफ380) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:रिक्त के लिए प्रतिनिधि डेटा। (क)ब्लैंक के लिए फ्लोरेसेंस सिग्नल करता है । तीर द्वारा दिखाए गए 10 रीडिंग चक्र (36 एस) के लिए एक आधार रेखा उत्पन्न करने के बाद एचटीबी को जोड़ा गया था। (ख)340 एनएम (एफ340) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात 380 एनएम (एफ380) (एफ340/एफ380) (एफ 340/एफ380) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:डाई अंशांकन के लिए मानकों के लिए प्रतिनिधि डेटा। (क)आयनोमाइसिन को 10वीं रीडिंग में जोड़ा गया था, जैसा कि तीर द्वारा दिखाया गया है, सीए+2 बाध्य राज्य में अधिकतम फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए। ईजीटीए-ट्राइटन एक्स-100 को 20 रीडिंग के बाद जोड़ा गया था, जैसा कि तीर द्वारा दिखाया गया है, न्यूनतम संकेत प्राप्त करने के लिए। (ख)340 एनएम (एफ340) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात 380 एनएम (एफ380) (एफ340/एफ380) (एफ 340/एफ380) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का अनुपात। इन मूल्यों को आगे इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए Grynkiewicz समीकरण में डाल रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:अनुक्रम और शुद्धता की पुष्टि करने के लिए एक प्रतिनिधि पेप्टाइड का लक्षण वर्णन। }प्रतिनिधि पेप्टाइड सीक्वेंस डब्ल्यूएनकेएनवाल का सैद्धांतिक द्रव्यमान 85790 डीए था, जिसे एम/जेड अनुपात ने मास स्पेक्ट्रोस्कोपी में दिखाया था। (ख)एचपीएलसी द्वारा पुष्टि की गई पेप्टाइड की शुद्धता 99% है। यह पेप्टाइड एन + सी-कटिंग पेप्टाइड लाइब्रेरी से संबंधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कैल्शियम सिग्नलिंग मास्ट सेल डेग्रेशन के लिए केंद्रीय है और रिसेप्टर-लिगांड इंटरैक्शन, लिगांड पहचान और दवा खोज14के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। MRGPRX2 हाल ही में खोजे गए मस्तूल सेल रिसेप्टर है जो खुजली, अस्थमा और एटोपिक डर्मेटाइटिस जैसे कई भड़काऊ रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता पाया गया है, दूसरों के बीच2। इसके अलावा, कई अनुमोदित दवाओं को MRGPRX2 रिसेप्टर15के माध्यम से एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना दिखाया गया है । इसलिए लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन का अध्ययन करना, नए लिगामेंट्स की पहचान करना और एक्टिवेशन मैकेनिज्म को समझना जरूरी है । इस अध्ययन में पेप्टाइड लाइब्रेरी(टेबल 1)डिजाइन करने और एमआरजीपीआरएक्स2 आधारित मास्ट सेल एक्टिवेशन का अध्ययन करने में सामान्य पेप्टाइड तकनीकों के उपयोग को दिखाया गया है। अंतर्निहित कैल्शियम जुटाने को मस्त सेल सक्रियण के संकेतक के रूप में नियोजित किया गया था।

फ्यूरा-2 एक कैल्शियम सेंसिटिव डाई है जो इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल की जाती है। एसीटॉक्सीमिथाइल एस्टर संस्करण (फ्यूरा-2 एएम) कोशिका झिल्ली की पारगम्यता को बढ़ाता है जो साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम विज्ञप्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान तरीका पैदा करता है। डाई का उपयोग अक्सर विभिन्न लक्षण वर्णन तकनीकों जैसे फ्लोसाइटोमीटर, माइक्रोस्कोपी और फ्लोरीमीटर9,16, 17के साथ कियाजाताहै। हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, वहां डाई के साथ जुड़े चुनौतियों का सामना कर रहे हैं, जो इन कुशलता से नियोजित किया जा सकता है इससे पहले कि संबोधित करने की जरूरत है । इंट्रासेलुलर कैल्शियम बाइंडिंग डाई के डी-एस्टेरिफिकेशन पर निर्भर करता है, जो काफी हद तक डाई लोडिंग स्थितियों, सेल सिस्टम और सेल कल्चर प्रकारों पर निर्भर करता है। आंशिक डी-एस्टेरिफिकेशन के परिणामस्वरूप अपर्याप्त फ्लोरेसेंस संकेत होते हैं। इसके अलावा, अपूर्ण डी-एस्टेरिफिकेशन के परिणामस्वरूप सेल ऑर्गेनेल्स में डाई का स्थानीयकरण भी होता है जिसके परिणामस्वरूप गलत डेटा होता है। सेल से डी-एस्टरिफाइड डाई का रिसाव एक अन्य मुद्दा है जो फुरा-210, 11के साथसामनाकरना पड़ा है।

डाई लोडिंग के अलावा डिटेक्शन तकनीक का इस्तेमाल भी अहम भूमिका निभाता है। यूवी लेजर के साथ संचालित करने के लिए प्रवाह साइटोमीटर की असमर्थता उन्हें डाई9के लिए प्रतिकूल बनाती है। इसी तरह फ्लोरोसेंट इमेजिंग तकनीकों के लिए माइक्रोस्कोप ऑपरेशन में एडवांस ट्रेनिंग की जरूरत होती है। लिगांड एक्टिवेशन पर कैल्शियम रिलीज की क्षणिक प्रकृति को तरंगदैर्ध्य में परिवर्तन में तेजी से प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है और इस प्रकार माइक्रोस्कोप की तेज शटर गति होती है। इसके अलावा, विशेष सेल इमेजिंग कक्षों का उपयोग, कवरस्लिप का उपयोग और निरंतर छवि फोकसिंग इसे बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग16के लिए एक बोझिल तकनीक बनाती है।

विधि अनुकूलन में काफी समय निवेश किया गया था। कुवेट आधारित फ्लोरोमीटर, जिसमें संस्कृति फ्लास्क से अलग होने के बाद कोशिकाओं को अंधेरे में डाई-लोडेड माध्यम के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था और फिर अध्ययन के लिए एचटीबी बफर में धोया गया और फिर से निलंबित कर दिया गया । एचटीबी बफर में निलंबित कोशिकाओं को एक क्यूवेट में लिया गया था और एक फोटोमल्टीप्लायर आधारित फ्लोरोमीटर का उपयोग करके पढ़ा गया था। डिटेक्शन सिस्टम केवल एक समय में कुछ (2-4) क्यूवेट पकड़ सकता है और इस प्रकार पेप्टाइड्स की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं था। इसके अलावा, HEK कोशिकाओं अनुयायी कोशिकाओं जा रहा है, सेल निलंबन पढ़ने के एक प्रयोग के भीतर व्यक्तिगत दोहराता के भीतर महान बदलाव दिखाया । नतीजतन फ्लोरोसेंट इमेजिंग तकनीक का इस्तेमाल किया गया, जो फिर से थकाऊ और धीमा साबित हुआ। तेजी से तरंगदैर्ध्य बदलती क्षमता, माइक्रोस्कोप-विशिष्ट सेल कक्षों, और उत्कृष्ट इमेजिंग कौशल के साथ एक उन्नत माइक्रोस्कोप की आवश्यकता ने अध्ययन में बाधा डाली। इसके अतिरिक्त, सीटू पेप्टाइड सिमुलेशन में समय व्यापक था और इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण डेटा का नुकसान हुआ। अक्षम सेल प्रोसेसिंग तकनीक के परिणामस्वरूप रीडिंग के दौरान सेल प्लवनशीलता हुई जिससे ध्यान केंद्रित करना मुश्किल हो गया और असंगत परिणाम दिए गए।

एक स्वचालित पिपटिंग सिस्टम के साथ एक फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर सिस्टम जो प्रयोगों के दौरान यौगिकों को वितरित कर सकता है, अध्ययन के लिए उपयोग किया गया था। तथ्य यह है कि कई नमूनों को 96 अच्छी तरह से प्लेट में त्वरित उत्तराधिकार में पढ़ा जाता है, इस तकनीक का एक अतिरिक्त लाभ है। परिणामों से पता चला है कि रीडिंग अधिक सुसंगत थे जब कोशिकाओं को निलंबन की तुलना में संलग्न किया गया । ४०,००० कोशिकाओं की कोशिकाओं की गिनती/अच्छी तरह से एक टीसी में इलाज ९६ अच्छी तरह से एक दिन के लिए उगाया थाली सबसे अच्छा परिणाम दिया । 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर 30-40 मिनट का डाई इनक्यूबेशन समय इष्टतम था। हालांकि, जब प्रयोग प्रयोगात्मक दोहराता के साथ किया गया था, विभिन्न स्तंभों के संबंधित कुओं में भिन्नता देखी गई। इसे दूर करने के लिए, प्लेट के प्रत्येक कॉलम के लिए एक सकारात्मक (पीएएमपी-12) और एक नकारात्मक नियंत्रण (खाली) का उपयोग किया गया था। इसने अधिक सुसंगत और पुन: उत्पन्न डेटा दिया। यहां वर्णित विधि एक आसान और बहुमुखी विधि है, जिसे बड़े पैमाने पर कैल्शियम आधारित स्क्रीनिंग के लिए कुशलतापूर्वक नियोजित किया जा सकता है। हालांकि, ऐसे कई कारक हैं जो डेटा की गुणवत्ता निर्धारित करते हैं और इस प्रकार विधि को दिए गए सेल-इंस्ट्रूमेंट सिस्टम के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

एसआर और एलडीयू इस परियोजना के लिए अलबर्टा इनोवेट्स स्ट्रैटेजिक रिसर्च प्रोजेक्ट, एनआरसी और एनएसईआरसी-डिस्कवरी ग्रांट को स्वीकार करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal - acetyl group
C terminal - amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 177 मस्तूल कोशिकाओं MRGPRX2 Fura-2 कैल्शियम परख HEK कोशिकाओं प्लेट रीडर
इंजीनियर एचईके कोशिकाओं का उपयोग करके एमआरजीपीआरएक्स 2 को सक्रिय करने वाले पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग
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Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

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