Summary
טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.
Abstract
זיהוי ליגנדים ספציפיים קולטני תאים משמעותיים מבחינה טיפולית הוא חיוני עבור יישומים רבים, כולל עיצוב ופיתוח של טיפולים חדשים. קולטן G-חלבון-X2 (MRGPRX2) הקשור ל-Mas הוא קולטן חשוב המווסת את הפעלת תאי התורן, ולכן מכוון את התגובה החיסונית הכללית. ליגנדים רבים עבור MRGPRX2 זוהו וכוללים פפטידים אנדוגניים כמו PAMPs, defensins, LL-37 ורסיסי חלבון אחרים (כלומר, אלבומין מושפל). זיהוי נוסף של ליגנדים ספציפיים MRGPRX2 דורש הקרנה של מספר רב של פפטידים (כלומר, ספריית פפטיד); עם זאת, תאי פיסט קשה ויקרים לתחזוקה במבחנה, ולכן, לא חסכוני להשתמש עבור הקרנת מספר גדול של מולקולות. המאמר הנוכחי מדגים שיטה לעיצוב, פיתוח ומסך של ספריה של מולקולות פפטיד קטנות באמצעות MRGPRX2 המבטאות תאי HEK. קו תא זה הוא קל יחסית וזול לתחזוקה וניתן להשתמש בו לניתוח תפוקה גבוהה במבחנה. צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Fura-2 לסימון שטף סידן תאי בעת ההפעלה שימש לניטור ההפעלה. היחס בין עוצמת הפלואורסצנטיות של Fura-2 ב 510 ננומטר נגד אורכי גל עירור של 340 ו 380 ננומטר שימש לחישוב ריכוז סידן. ספריית הפפטיד המשמשת לאימות מערכת זו התבססה על סוד ה- N-terminal 12 (PAMP-12) האנדוגני, הידוע כאגוגה של MRGPRX2 עם ספציפיות גבוהה וזיקה. פפטידים הבאים נוצרו באמצעות truncation חומצת אמינו וטכניקות סריקת אלנין להחיל PAMP-12. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וזולה אך חסון להקרנת ספרייה גדולה של תרכובות לזיהוי תחומים מחייבים ופרמטרים חשובים אחרים הממלאים תפקיד חשוב בהפעלת קולטן.
Introduction
תאי פיסט הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון וממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים בעיקר על ידי כריכת אנטיגן לאימונוגלובולין E (IgE) - קומפלקס קולטני FcεRI, או על ידי קולטן G-חלבון הקשור ל- G-X2 (MRGPRX2)שהתגלהלאחרונה . הפעלת MRGPRX2 נקשרה למספר מחלות חיסוניות ודלקתיות, ולכן חשוב להבין את מנגנון המחייב של הקולטן לליגנדים2שלו . כדי לעשות זאת, ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות פותחה והוקרנה נגד קולטני MRGPRX2 שהתבטאו יתר על המידה בתאי HEK. במחקר, ספריית הפפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין וגזמת חומצות אמינו. סריקת אלנין כרוכה בהחלפת חומצות אמינו ספציפיות בשאריות אלנין. אלנין להיות קטן ונייטרלי, מפשיט את הפפטיד של המאפיינים הספציפיים שהוענקו על ידי שאריות מוחלף ברצף מדגיש את המשמעות של המאפיינים הפיזיוכימיים בהתאמה של חומצת האמינו באינטראקציות קולטן. להיפך, ב truncation חומצת אמינו, רצפי פפטיד מתוכננים כך שהוא חסר אחד או יותר שאריות חומצת אמינו מן מסוף N-terminal, C, או שניהם. קבוצה זו של פפטידים שימשה לזיהוי רצפי חומצות האמינו החיוניים לכריכת MRGPRX2.
ניסיון עם קווי תאי פיסט אנושיים (LAD-2) הראה כי תאים אלה קשים לתרבות ולשמור במבחנה: זמן הכפלה של שבועיים, תוספי מזון בינוניים יקרים, ותשומת לב ישירה הנדרשת במהלך passaging3. תכונות אלה הופכות את התאים ללא מתאימים להקרנה בקנה מידה גדול של ליגנדים פוטנציאליים. בזאת, תאי HEK מהודבקים בייצוב המבטאים קולטן MRGPRX2 (HEK-X2) שימשו להקרנת ספריית הפפטיד1. תאי HEK-293 נמצאים בשימוש נרחב ונחקרים עבור הביטוי ההטרולוגי של קולטני פני השטח בשל יעילות ההדבקה הגבוהה שלהם, קצב הכפלה מהיר יותר, והצורך בתוספי מזון בינוניים לא יקרים להיות מתורבתים במעבדה4. הפרוטוקול כדי להעביר את קו התא HEK-293 הוכח והוא מבוסס היטב5. תאי HEK-293 המביעים ביציבות קולטן MRGPRX2 (מעבר 13-19) הופעלו עם הפפטידים שנוצרו באמצעות N-truncation, C-truncation, N + C-truncation, וסריקת אלנין1. תאי HEK מסוג פראי (HEK-WT) (מעבר 16-21) שימשו כפקד. שחרור סידן תאי בעת ההפעלה היה במעקב כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת MRGPRX2.
הפעלת תאים על ידי MRGPRX2 מלווה בגיוס סידן ציטוטוסולי. שחרור סידן תאי מוסדר זה בתאי פיסט מוסדר על ידי הזנת סידן המופעלת על ידי החנות (SOCE), מתואם על ידי מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1); והוא מרכזי מפל התגובה החיסונית6,7. שיטות שונות שימשו כדי לזהות ריכוז סידן תאי, כולל מהדקי תיקון וצבעים פלואורסצנטיים8. מכל הטכניקות הזמינות, צבעי סידן פלואורומטריים בהטיה עם טכניקות זיהוי שונות נמצאים בשימוש נרחב9. שני סוגים של צבעים פלואורומטריים שצברו תחומי עניין הם כלומר, צבעי אורך גל יחידים כמו Fluo-4, וצבעים רציאליים באורך גל כפול כמו Indo -1 ו Fura-2. היתרון שצבעים רציוניים אורך גל כפולים מביאים על צבעי אורך גל יחיד הוא שהצבעים היחסיים נכונים לטעויות ניסיוניות כמו טעינת צבע, הלבנת תמונות ומיקוד10,11.
אצטטוקסימתיל אסתר (Fura-2 AM) הוא צבע מחלחל לירוק-פלואורסצנטי, אשר עירורו עובר לאורך גל נמוך יותר עם כריכת סידן. באופן ניסיוני, Fura-2 מתרגש ב 340 ו 380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב 510 ננומטר. לאחר כריכת הסידן, עוצמת הפלואורסצנט ב-340 ננומטר עולה בעוד זו של 380 ננומטר פוחתת, כפי שמוצג באיור 1. הנתונים מיוצגים כיחס של עוצמת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של עוצמה לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) כלומר, F340/F380. יחס F340/F380 הוא פרופורציונלי לסידן תאי, אשר הערך של אשר ניתן לחשב על ידי משוואת Grynkiewicz12. מכיוון שאות הפלואורסצנטיות מתקבל מערעור הצבע בשני אורכי גל (340 ננומטר ו-380 ננומטר), היחס בין אותות הפלואורסצנטיות מתקן גורמים ניסיוניים כמו טעינת צבע, דליפת צבע, ליחתום תמונות וצפיפות תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב ופיתוח של ספריית פפטיד
- כדי לזהות את הליגנדים של קולטן MRGPRX2 של תא התורן בהתבסס על ליגנד ידוע כלומר, PAMP-1213, בצע את השלבים הבאים.
- צור ספריית פפטיד N-קטוע על ידי חיתוך שאריות חומצת האמינו N-terminal של ליגנד, ברצף, על ידי סינתזת פפטידים שלב מוצק (SPPS).
- צור ספריית פפטיד C-קיצר על ידי חיתוך שאריות חומצת אמינו C-מסוף של ליגנד ידוע, ברציפות, על ידי SPPS.
- בהתבסס על התוצאות של 1.1.1 ו- 1.1.2, צור ספריית פפטידים חתוכה N+C באמצעות SPPS על-ידי חיתוך השאריות הרצויות ממסוף N ו- C, בהתאמה.
- השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים13.
- שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.
- לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה.
- כדי לחקור את המשמעות של חומצות אמינו ספציפיות בתוך מולקולת ה- PAMP-12 של האב, בצע את השלבים הבאים.
- צור ספריית פפטיד סריקת אלנין על ידי החלפת שאריות חומצת האמינו המתאימות במולקולת הפפטיד באלנין, אחת בכל פעם באמצעות SPPS. שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.
- לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה.
הערה: ודא כי פפטידים מסונתזים הם של טוהר גבוה. אפיינו את הפפטידים באמצעות ספקטרוסקופיית מסה ו-HPLC.
2. בתרבית תאי במבחנה
- תאי HEK-X2 ו- HEK-WT של תרבות על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.
- הכן את המדיום של תרבות על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה עם סרום בקר עוברי 10%(FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL של פניצילין ו 100 מיקרוגרם /mL של סטרפטומיצין.
- מעבר התאים בתרבית הרקמות (TC) טיפל T-75 תרבית בקבוקונים ולגדול באינקובטור ב 37 °C המכיל 5% CO2, עד שהם 75-80% confluent.
- פעם 75% confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין במשך 2 - 3 דקות. דגירה באינקובטור 37 °C (5%), 5% CO2 כדי לנתק את התאים.
- לאחר שהתאים מנותקים, לאסוף את התאים טריפסין. מוסיפים 6-9 מ"ל של מדיום טרי.
- צנטריפוגות התאים ב 1620 x גרם במשך 3-5 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי. לדלל את התאים לפי הריכוז הרצוי.
הערה: תאי HEK הם תאים הגדלים במהירות ולכן למטב את תוספי התא בינוני. תאי HEK הם תאים חסידים; להעביר אותם בבקבוקי תרבות שטופלו TC כדי לתמוך בהידבקות.
- הכינו צלחת 96 באר לניסוי.
- הוסף 200 μL של השעיית התא בכל באר, עם ריכוז של 200,000 תאים / מ"ל, לזרוע 40,000 תאים / טוב.
- לגדל את התאים עבור 24 שעות ב 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור.
הערה: מטב את צפיפות התא לבאר בהתבסס על גודל הצלחת וסוג המתח של התא. ערוך את הניסוי במשולשים בצלחת 96 שחורה שטופלו ב- TC עם תחתית שקופה שטוחה.
3. פיה-2 AM סידן
- הכן צבע על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.
- השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי.
- הכן את מאגר החיץ (HTB) של HEPES-Tyrode המכיל 25 מ"מ חיץ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז, אלבומין סרום בקר מ"ג / מ"ל (BSA) ו- 1.8 מ"מ CaCl2 במים מעוקרים אוטומטיים.
- הוסף 50 μL של DMSO ב 50 מיקרוגרם פורה-2 בבוקר בון כדי להכין פתרון מלאי 1 mM של צבע Fura-2 AM. הוסף 1 μL של 1 mM Fura-2 AM צבע לכל mL של מדיום טרי כדי להכין את מדיום טעינת צבע בעל ריכוז צבע 1μM.
- מוציאים את צלחת 96 היטב מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום טעינת צבע טרי. הוסף 200 μL של צבע טעינה בינוני בכל באר. לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור.
- לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום. לשטוף את התאים עם מאגר HTB. הוסף 100 μL של מאגר HTB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות.
הערה: מטב את ריכוז הצבע במדיום הטעינה של הצבע. דליפת צבע והלבנת תמונות הם חששות אפשריים הקשורים לצבע. הוסף CaCl2 טרי למאגר HTB כדי למנוע משקעים.
4. הפעלת תאים וקריאה פלואורסצנטית
הערה: קורא לוחות פלואורסצנטיות עם מערכת צנרת אוטומטית מאפשר העברה אוטומטית של תרכובות ממקור מורכב לצלחת הבדיקה מבלי להוציא את הצלחת מקורא הלוחות.
- בזמן שהתאים דוגרים, הגדר את קורא הלוחות.
- הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (7 °F).
- בהגדרות , בחר Flex.
- הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקראה התחתונה.
- באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל ל-2. הגדר את העירור ל- 340 ננומטר ו- 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר.
- השאר את הרגישות לברירת המחדל.
- בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר זמן ריצה ל- 94 s כדי לקבל 25 קריאות.
- לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.
- לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה.
- בהעברה מורכבת, הגדר העברות ל- 1 ונפח התחלתי ל- 100 μL. הגדר את גובה הפיפטה ל- 100 μL, אמצעי אחסון ל- 50 μL ונקודת זמן ל- 36 s, כדי להוסיף את המתחם בקריאה העשירית.
- לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב.
- השאר את Triturate ללא שימוש.
- בחר את העצות בפריסת עצות Pipette.
- עבור עמודות מורכבות ועמודות קצה, ודא שהתרכובות שיש להעביר נמצאות בעמודה 1 של הלוח המורכב. הגדר את עמודת העצות לעמודה 1 ולעמודה מורכבת ל- 1.
- השאר את הכיול האוטומטי כ- ON.
- לחץ על אישור.
- כאשר הטמפרטורה הגיעה ל 37 °C (50 °F), לטעון את הצלחות לתוך קורא הלוחות.
- לחץ על תא הקריאה כדי להכניס את צלחת ה- Assay לקורא לוחותהפלואורסצנטיות .
- לחץ על המקור כדי לשים את הלוח המורכב. הכן את הלוח המורכב על ידי הוספת 200 μL של פפטידים בהתאמה, היונומיצין ואתילן גליקול-ביס (β-אמינואתיל אתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)-טריטון X-100 פתרונות.
- לחץ על ארון התקשורת כדי למקם את תיבת העצים. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ.
- לאחר טעינת הלוחות, סקור את הגדרות התוכנה והקש קרא.
5. ניתוח נתונים
- לקבוע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ ' -
כאשר, Kd הוא קבוע הניתוק של Fura-2 AM, R הוא יחס הפליטה לאחר עירור ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר (F340 /F380) עבור פפטידים בהתאמה, Rmax הוא יחס פלואורסצנטיות מקסימלי שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 30 μM ionomycin, Rmin הוא פלואורסצנטיות מינימלית שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 100 mM EGTA / 2.5% טריטון X-100, ו- F380דקות ו- F380מקסימום הם עוצמת הפלואורסצנטיות המוחלטת של Fura-2 AM במצב ללא סידן וכבול, בהתאמה.
הערה: המכונה מחלקת את הנוזל בכוח מסוים. אין להגדיר את גובה חלוקת הפפטיד קרוב מדי לתחתית הצלחת; זה עלול לנתק את התאים. השתמש בטיפים פיפטה שחורים כדי למנוע פלואורסצנטיות אוטומטית. קרא את הפלואורסצנטיות המרבית ואת הפלואורסצנטיות המינימלית לכל צלחת עבור כל ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טבלה 1 מכילה את רצפי הפפטיד הנוצרים באמצעות טריון חומצות אמינו סופניות וסריקה אלנין. כפי שמוצג בטבלה 1, רצף פפטיד RKKWNKWALSR חסר פנילאלנין N-מסוף (F) ביחס להורה שלה PAMP-12 ולכן הוא פפטיד מייצג בספרייה N-קאט. באופן דומה, ב- FRKKWNKWALS, סרין מסוף C PAMP-12 הוסר, המייצג ספריית פפטיד חתוכה C המופקת מ- PAMP-12. בספריית הפפטידים N+C-חתוכה, חומצת אמינו הן ממסוף N והן ממסוף C מוסרות. השזגה של 4 חומצות אמינו ממסוף N ושאריות אחד ממסוף C של PAMP-12 גורמת ל-WNKWALS. ספריית פפטיד המופקת מסריקת אלנין כוללת חומצת אמינו אחת שהוחלפה באלנין, כמו ב- ARKKWNKWALSR, שם מוחלף פנילאלנין N-terminal באלנין. צבע Fura-2 AM שימש כדי לחקור את פוטנציאל ההפעלה של פפטידים נגד MRGPRX2 תאים HEK transfected1. הנתונים נרשמו על קורא לוחות פלואורסצנטיות. אם ליגנד הפפטיד הפעיל את התא, הפלואורסצנטיות שנשאבה ב-340 ננומטר (F340) עולה, בעוד שאותו אורך גל של 380 ננומטר (F380)(איור 1a). עם זאת, עבור פקד פפטיד או HEK-WT ריק (או לצורך העניין שאינו מפעיל פפטיד או HEK-WT), העלייה והירידה היחסית יהיו נמוכות בהתאמה, כפי שמוצג באיור 2a. ריכוז הסידן, לעומת זאת, מיוצג על ידי יחס F340/F380 כפי שמוצג באיור 1b, 2b. ניתן להחליף את היחס F340/F380 במשוואת Grynkiewicz כדי לקבל את ריכוז הסידן באמצעות כיול מיקום(איור 3). הפפטידים המפורטים בטבלה 1 התאפיינו בספקטרוסקופיית מסה (איור 4a) וב- HPLC (איור 4b) ונמצאו בעלי טוהר גבוה.
| טכניקת פפטיד | פפטיד נציג |
| פפטיד הורים | Ac-FRKKWNKWALSR-Amide |
| N-Truncation | Ac-RKKWNKWALSR-Amide |
| C-truncation | Ac-FRKKWNKWALS-Amide |
| N+C-טריון | Ac-WNKWALS-Amide |
| סריקת אלנין | AC-ARKKWNKWALSR-Amide |
טבלה 1: רצפי פפטיד מייצגים שנוצרו לאחר N, C ו- N + C - truncation, וסריקה אלנין. N-מסוף של הפפטידים שונו אצטיל בעוד C-מסוף הכיל קבוצת אמיד.
איור 1: נתונים מייצגים עבור פפטיד מפעיל. (א)אותות הפלואורסצנטיות להפעלת פפטיד. נתונים מיוצגים תואמים ל- PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). פפטיד נוסף לאחר יצירת בסיס עבור 10 מחזורי קריאה (36 s), כפי שמוצג על ידי החץ. (ב)היחס בין פליטת הפלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) (F340/F380). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתונים מייצגים עבור הריק. (א)אותות הפלואורסצנטיות עבור הריק. HTB נוסף לאחר יצירת תוכנית בסיסית עבור 10 מחזורי קריאה (36 s), כפי שמוצג על-ידי החץ. (ב)היחס בין פליטת הפלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) (F340/F380). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נתונים מייצגים לתקנים לכיול צבע. (א)היונומיצין נוסף בקריאה10, כפי שמוצג על ידי החץ, כדי לקבל פלואורסצנטיות מקסימלית במצב כבול Ca+2. EGTA-Triton X-100 נוסף לאחר 20 קריאות, כפי שמוצג על ידי החץ, כדי לקבל אות מינימום. (ב)היחס בין פליטת הפלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) (F340/F380). ערכים אלה נמצאים עוד יותר במשוואת Grynkiewicz כדי לקבל את ריכוז הסידן התאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפיון פפטיד מייצג כדי לאשר את הרצף והטוהר. (א)המסה התיאורטית של רצף הפפטיד הייצוגי WNKWAL הייתה 857.90 Da, אשר הוצגה על ידי יחס m / z בספקטרוסקופיית מסה. (ב)טוהר הפפטיד של 99% כפי שאושר על ידי HPLC. פפטיד זה שייך לספריית הפפטידים של N+C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איתות סידן הוא מרכזי לפירוק תאי התורן והיה בשימוש נרחב במחקר של אינטראקציות קולטן-ליגנד, זיהוי ליגנד, וגילוי סמים14. MRGPRX2 הוא קולטן תא תורן שהתגלה לאחרונה ונמצא ממלא תפקיד מפתח במחלות דלקתיות רבות כמו גירוד, אסטמה, אטופיק דרמטיטיס, בין היתר2. יתר על כן, מספר תרופות שאושרו הוכחו לעורר תגובה דלקתית באמצעות קולטן MRGPRX215. לכן, חובה ללמוד את האינטראקציה עם קולטן ליגנד, לזהות ליגנדים חדשים ולהבין את מנגנון ההפעלה. מחקר זה מראה את השימוש בטכניקות פפטיד נפוצות בעיצוב ספריית פפטיד (טבלה 1) ובחקר הפעלת תאי התורן מבוססי MRGPRX2. גיוס הסידן הבסיסי הועסק כאינדיקטור להפעלת תאי התורן.
Fura-2 הוא צבע רגיש לסידן המשמש למדידת ריכוז סידן תאי. וריאנט אסתר אצטוקסימתיל (Fura-2 AM) מגביר את החדירות של קרום התא מניב שיטה קלה לכימות שחרורי הסידן הציטופלסמי. הצבע שימש לעתים קרובות עם טכניקות אפיון שונות כמו cytometer זרימה, מיקרוסקופיה, ו fluorimeters9,16,17. למרות שנעשה שימוש נרחב, ישנם אתגרים הקשורים לצבע, אשר יש לטפל לפני אלה ניתן להעסיק ביעילות. כריכת סידן תאי מסתמכת על דה-אסטרציה של הצבע, אשר תלוי במידה רבה בתנאי טעינת הצבע, מערכת התאים וסוגי תרביות התאים. הסרת אסטרציה חלקית גורמת לאותות פלואורסצנטיות לקויים. יתר על כן, דה-אסטרציה חלקית גורמת גם לוקליזציה של צבע לתוך אברוני התא וכתוצאה מכך נתונים לא מדויקים. דליפת צבע דה-אסטרה מהתא היא בעיה נוספת העומדת בפני Fura-210,11.
מלבד טעינת הצבע, השימוש בטכניקת הזיהוי ממלא גם תפקיד חשוב. חוסר היכולת של זרימה cytometers לפעול עם לייזרים UV עושה אותם שלילי עבור הצבע9. באופן דומה, טכניקות הדמיה פלואורסצנטית דורשות הכשרה מתקדמת בפעולת מיקרוסקופ. האופי החולף של שחרור סידן עם הפעלת ליגנד דורש תגובה מהירה בשינוי אורכי הגל ובכך מהירות תריס מהירה יותר של המיקרוסקופ. בנוסף, השימוש בתאי הדמיה מיוחדים של תאים, שימוש בכיסויים ומיקוד תמונה מתמיד הופכים אותו לטכניקה מסורבלת להקרנה בקנה מידה גדול16.
זמן רב הושקע באופטימיזציה של השיטה. פלואורומטר מבוסס Cuvette, שבו תאים לאחר התנתקות מבקבוק התרבות, היו דגירה עם מדיום טעון צבע בחושך ולאחר מכן נשטפו ו respended במאגר HTB למחקר. תאים שהושעו במאגר HTB נלקחו בקובט ונקראו באמצעות פלואורומטר מבוסס פוטומולטיפלייר. מערכות האיתור יכלו להכיל רק מעט (2-4) cuvettes בכל פעם ולכן לא היה מתאים להקרנה בקנה מידה גדול של פפטידים. יתר על כן, תאי HEK להיות תאים דבקים, קריאת השעיית התא הראה וריאציות גדולות בתוך חזרות בודדות בתוך ניסוי. כתוצאה מכך, נעשה שימוש בטכניקת הדמיה פלואורסצנטית, אשר שוב הוכיח להיות מייגע ואיטי. הדרישה למיקרוסקופ מתקדם עם יכולת שינוי אורך גל מהירה, תאי תאים ספציפיים למיקרוסקופ וכישורי הדמיה מצוינים עיכלו את המחקר. בנוסף, סימולציית פפטיד במקום הייתה זמן נרחב והובלה לאובדן נתונים חשובים. טכניקת עיבוד תאים לא יעילה הביאה להנפקות תאים במהלך קריאות שהקשו על המיקוד ונתנו תוצאות לא עקביות.
מערכת קורא לוחות פלואורסצנטית עם מערכת צינורות אוטומטית שיכולה לחלק תרכובות במהלך ניסויים שימשה למחקר. העובדה כי דגימות רבות נקראות ברצף מהיר בצלחת 96 היטב היא יתרון נוסף של טכניקה זו. התוצאות הראו כי הקריאות היו עקביות יותר כאשר תאים היו מחוברים בהשוואה להשעיה. ספירת תאים של 40,000 תאים / גם בצלחת 96 מטופל TC גדל במשך יום נתן את התוצאות הטובות ביותר. זמן דגירה של צבע של 30 - 40 דקות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס היה אופטימלי. עם זאת, כאשר ניסויים נעשו עם חזרות ניסיוניות, וריאציות בבארות המתאימות של עמודות שונות נצפו. כדי להתגבר על כך, נעשה שימוש חיובי (PAMP-12) ושליטה שלילית (ריק) עבור כל עמודה של הלוח. זה נתן נתונים עקביים יותר לשחזור. השיטה המתוארת כאן היא שיטה קלה ורב-תכליתית, אשר ניתן להשתמש בה ביעילות להקרנה מבוססת סידן בקנה מידה גדול. עם זאת, ישנם מספר גורמים הקובעים את איכות הנתונים ולכן יש למטב את השיטה עבור מערכת מכשירים סלולריים נתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
SR ו- LDU רוצים להכיר אלברטה Innovates פרויקט מחקר אסטרטגי, NRC, ו NSERC-דיסקברי מענק עבור פרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
