Summary
MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。
Abstract
治療上重要な細胞受容体に特異的なリガンドを同定することは、新しい治療薬の設計と開発を含む多くの用途にとって極めて重要である。マス関連Gタンパク質受容体X2(MRGPRX2)は、肥満細胞の活性化を調節する重要な受容体であり、したがって、一般的な免疫応答を導く。MRGPRX2に対する多数のリガンドが同定されており、PMP、ディフェンシン、LL-37および他のタンパク質断片(すなわち、分解されたアルブミン)のような内因性ペプチドが含まれる。MRGPRX2特異的リガンドのさらなる同定には、多数のペプチド(すなわち、ペプチドライブラリー)のスクリーニングが必要である。しかし、肥満細胞は インビトロ で維持するのが難しく高価であり、したがって、多数の分子をスクリーニングするために使用することは経済的ではない。本論文は、MRGPRX2を用いてHEK細胞を発現する小ペプチド分子のライブラリーを設計、開発、およびスクリーニングする方法を示す。この細胞株は維持するために比較的容易で安価であり 、in vitro ハイスループット分析に使用することができる。活性化時に細胞内カルシウムフラックスをマークするカルシウム感受性フラ2蛍光色素を使用して、活性化を監視した。340nmおよび380nmの励起波長に対する510nmにおけるフラ-2の蛍光強度の比を用いてカルシウム濃度を算出した。このシステムを検証するために使用されるペプチドライブラリーは、内因性のproadrenomedullin N末端12(PAMP-12)分泌基化に基づいており、MRGPRX2を高い特異性および親和性で結合することが知られている。その後のペプチドは、PAMP-12に適用されるアミノ酸切り捨ておよびアラニンスキャン技術を介して生成された。ここで説明する方法は、結合ドメインおよび受容体活性化において重要な役割を果たす他の重要なパラメータを同定するために、化合物の大規模なライブラリをスクリーニングするための簡単で安価でありながら堅牢である。
Introduction
マスト細胞は免疫系の不可欠な部分であり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方で重要な役割を果たしています。マスト細胞は、主に免疫グロブリンE(IgE)-FcεRI受容体複合体への抗原の結合によって、または最近発見されたマス関連Gタンパク受容体-X2(MRGPRX2)1によって活性化される。MRGPRX2活性化はいくつかの免疫疾患および炎症性疾患に関連しており、したがって、受容体のリガンド2への結合機構を理解することが重要である。そのために、HEK細胞で過剰発現したMRGPRX2受容体に対して、小ペプチド分子のライブラリーが開発され、スクリーニングされた。研究では、ペプチドライブラリーは、アラニンスキャンとアミノ酸切り捨ての単純で汎用性の高い技術を使用して構築されました。アラニンスキャンは、アラニン残基に特定のアミノ酸を置き換えることを含みます.アラニンは小さく中性であり、置換された残基によって与えられた特定の特性のペプチドを取り除き、受容体相互作用におけるアミノ酸のそれぞれの生理化学的性質の重要性を連続的に強調する。逆に、アミノ酸切り捨てでは、ペプチド配列は、N末端、C末端、またはその両方から1つ以上のアミノ酸残基を欠くように設計されている。この一組のペプチドは、MRGPRX2結合に重要なアミノ酸配列を同定するために使用された。
ヒト肥満細胞株(LAD-2)の経験は、これらの細胞が培養およびインビトロを維持することが困難であることを示している:2週間の倍増時間、高価な培地サプリメント、および過ごす間に必要な直接的な注意3。これらの属性は、潜在的なリガンドの大規模スクリーニングに適さない細胞を作る。本明細書において、MRGPRX2受容体(HEK-X2)を発現する安定的にトランスフェクトされたHEK細胞を、ペプチドライブラリー1をスクリーニングするために使用した。HEK-293細胞は、その高いトランスフェクション効率、より速い倍率、および実験室4で培養される非高価な培地サプリメントの必要性による表面受容体の異種発現のために広く使用され、研究されている。HEK-293細胞株をトランスフェクトするプロトコルが実証されており、5.MRGPRX2受容体を安定的に発現するHEK-293細胞(継代13-19)は、N-切り捨て、C-切り捨て、N+C切り捨て、およびアラニン走査1を介して生成されたペプチドで活性化された。野生型HEK細胞(HEK-WT)(継代16-21)をコントロールとして用いた。活性化時に細胞内カルシウム放出をモニターし、MRGPRX2に基づく活性化を研究した。
MRGPRX2による細胞活性化は、続いて細胞分解性カルシウム動員を行う。肥満細胞におけるこの調節された細胞内カルシウム放出は、貯蔵操作カルシウムエントリー(SOCE)によって調節され、間質相互作用分子1(STIM1)によって調整される。免疫応答カスケード6、7の中心である。パッチクランプや蛍光色素8を含む、細胞内カルシウム濃度の検出には様々な方法が用いられている。利用可能なすべての技術のうち、各種検出技術による共役における蛍光カルシウム色素が広く用いられている9.関心を集めた2種類の蛍光色素は、Fluo-4のような単一波長色素と、Indo -1やFura-2のような二重波長比比色素です。二重波長比比色素が単一波長色素を超える利点は、比比色素が染料のロード、写真の漂白、および焦点10、11のような実験的エラーに対して正しいということです。
フラ2アセトキシメチルエステル(Fura-2 AM)は、カルシウム結合時に励起が低波長にシフトする細胞浸透、緑色蛍光色素です。実験的に、Fura-2は340および380 nmで励起され、放出は510 nmで記録される。カルシウム結合の際、 図1に示すように340nmの蛍光強度は380nmの蛍光強度が低下する一方で減少する。データは、380nm(F380)での励起後の強度に対して340nm(F340)での励起後の蛍光強度の比、すなわちF340/F380として表される。F340/F380比は細胞内カルシウムに比例し、その値はGrynkiewicz式12によって計算することができる。蛍光信号は、色素の励起から得られるので(340nmと380nm)、蛍光信号の比は、染料負荷、染料漏れ、光漂白、および細胞密度などの実験的要因を補正します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ペプチドライブラリーの設計・開発
- 既知のリガンドすなわちPAMP-1213に基づいてマスト細胞MRGPRX2受容体のリガンドを同定するために、以下の手順に従う。
- リガンドのN末端アミノ酸残基を切り捨てることによりN切り捨てペプチドライブラリーを生成し、続いて、固相ペプチド合成(SPPS)によって生成する。
- 既知のリガンドのC末端アミノ酸残基をSPPSによって連続して切り捨てることにより、C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
- 1.1.1と1.1.2の結果に基づいて、それぞれNとC末端から所望の残基を切り捨てることによってSPPSを用いてN+C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
- 固相ペプチド合成を用いてペプチド13を合成する。
- N端子をアセチル(Ac)グループに、C端子をアミドグループに変更します。
- 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた純度と質量分析光度計を用いた質量に対して、ペプチドを特徴付けます。
- 親PAMP-12分子内の特定のアミノ酸の重要性を調べるために、以下の手順に従ってください。
- ペプチド分子のそれぞれのアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、一度に1つずつSPPSを用いて、アラニンスキャンペプチドライブラリーを生成します。N端子をアセチル(Ac)グループに、C端子をアミドグループに変更します。
- 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた純度と質量分析光度計を用いた質量に対して、ペプチドを特徴付けます。
注:合成ペプチドが高純度であることを確認してください。質量分析法とHPLCを用いてペプチドを特徴付けます。
2.インビトロ 細胞培養
- 培養HEK-X2およびHEK-WT細胞は、以下の手順に従う。
- 高グルコースDMEMを10%胎児ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μG/mLで補って培地を調製します。
- 組織培養(TC)で細胞を通過させ、T-75培養フラスコを処理し、5%CO2を含む37°Cで培養器で増殖し、75〜80%のコンフルエントになるまで培養した。
- 75%コンフルエントになったら、細胞を洗浄し、2〜3分間トリプシンを2〜3 mL加えます。37°Cでインキュベートし、5%CO2インキュベーターを使用して細胞を剥離する。
- 細胞が切り離されたら、トリプシンの細胞を収集します。6~9mLの新鮮な培地を加えます。
- 細胞を1620 x g で3〜5分間遠心分離する。
- 遠心分離後、上清を捨ててペレットを回収する。新鮮な培養培地中の細胞を再懸濁する。所望の濃度に従って細胞を希釈する。
注:HEK細胞は、急速に成長している細胞であり、したがって、細胞培地サプリメントを最適化します。HEK細胞は接着細胞である。接着をサポートするためにTC処理培養フラスコでそれらを通過する。
- 実験用に96ウェルアッセイプレートを準備します。
- 各ウェルに200μLの細胞懸濁液を加え、濃度200,000個の細胞/mLを加え、40,000個の細胞/ウェルをシードします。
- 37°C、5%CO2インキュベーターで24時間細胞を増殖させます。
注: プレートサイズとセルひずみタイプに基づいて、ウェルごとのセル密度を最適化します。黒いTC処理96ウェルプレートに三重で、透明な底が平らな実験を行います。
3. フラ-2 AMカルシウムアッセイ
- 以下の手順に従って染料を準備します。
- 実験には、Fura-2 AM色素を使用してください。
- 25 mM HEPES バッファー、120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mg/mL グルコース、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を含む HEPES-Tyrode のバッファー (HTB) バッファーを準備し、オートクレーブ滅菌水に 1.8 mM CaCl 2 を追加し、新たに 1.8 mM CaCl2 を追加します。
- 50 μg Fura-2 AM バイアルに DMSO 50 μL を加え、Fura-2 AM 色素の 1 mM ストック溶液を準備します。1 μM色素濃度の色素ローディング媒体を調製するために、フレッシュ培地のmLあたり1 mM Fura-2 AM色素を1μL添加します。
- インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、培地を捨てます。新鮮な染料ローディング媒体で媒体を交換してください。各ウェルに200μLの染料ローディング媒体を加えます。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターで30〜40分間インキュベートします。
- 40分のインキュベーションの後、培地を取り除く。HTBバッファーで細胞を洗います。蛍光読み取り用に100μLのHTBバッファを追加します。蛍光の読書のためのプレートを取ります。
注:染料負荷媒体中の染料の濃度を最適化します。染料漏れや光漂白は、染料に関連する可能性のある懸念事項です。沈殿を避けるために、HTB バッファーに新鮮な CaCl2 を追加します。
4. 細胞の活性化と蛍光読み取り
注:自動ピペットシステムを備えた蛍光プレートリーダーは、プレートリーダーからプレートを取り出すことなく、化合物源からアッセイプレートへの化合物の自動転送を可能にします。
- 細胞がインキュベートされている間に 、プレートリーダーを設定します。
- 温度を37°Cに設定します。
- [ 設定 ]で [ Flex] を選択します。
- 読み取りモードを蛍光と底読みに設定します。
- 波長で、波長の数を 2 に設定します。励起を 340 nm および 380 nm に設定します。放出を 510 nm に設定します。
- [感度] は[既定] のままにします。
- [ タイミング] で 、[間隔] を 3.9 秒に設定します。25 読み取りを取得するには 、ランタイム を 94 s に設定します。
- 次にアッ セイプレートタイプを選択します。
- 次に、 読み取るウェルを選択します。
- [複合転送] で、[転送]を 1 に設定し、初期ボリュームを100 μL に設定します。
- 次に、 複合ソース プレートタイプを選択します。
- [トリチュレート] は[使用しない] のままにします。
- ピペットのヒントレイアウトでヒントを選択します。
- [複合列] および [チップ列]では、転送する化合物が複合プレートの列 1 に含まれるようにします。[先端列]を1 に設定し、[複合列]を 1 に設定します。
- [自動校正]は[オン]のままにします。
- [OK] をクリックします。
- 温度が37°Cに達したら、 プレートをプレートリーダーにロードします。
- 読書室を押して、蛍光プレートリーダーにアッセイプレートを入れます。
- ソースを押してコンパウンドプレートを置きます。各ペプチド、イオノマイシンおよびエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'テトラ酢酸(EGTA)-トリトンX-100溶液の200 μLを添加して、化合物プレートを調製します。
- チップラックを押して、チップボックスを置きます。黒い先端を使用して、自己蛍光を避けてください。
- プレートがロードされたら、ソフトウェアの設定を確認し 、読み取りを押します。
5. データ分析
- グリンキエヴィチ方程式により蛍光比からカルシウム濃度を決定する -
ここで、Kd は、Fura-2 AM の解離定数であり、 Rは、各ペプチドに対して340nmおよび380nm(F340/F380)で励起した後の発光比であり、Rmax は30μMの50μLの30μMイオノマイシンを添加して観察される最大蛍光比であり、R分 は100mMMEGTA/2%10の50μLを添加することによって観察される最低蛍光である F380min およびF380max は、それぞれカルシウムフリー及び結合状態におけるフラ-2 AMの絶対蛍光強度である。
注:機械は、いくつかの力で液体を分配します。ペプチドの分配高さをプレートの底部に近づけすぎないようにしてください。セルを切り離す場合があります。黒いピペットチップを使用して、自家蛍光を避けてください。各実験の各プレートの最大蛍光と最小蛍光を読みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
表1は、末端アミノ酸切り捨ておよびアラニン走査を介して生成されるペプチド配列を含む。表1に示すように、ペプチド配列RKKWNKWALSRはその親PAMP-12に対してN末端フェニルアラニン(F)を欠いているため、N切り捨てライブラリーにおける代表的なペプチドである。同様に、FRKKWNKWALSでは、PAMP-12C末端セリンが除去されており、PAMP-12に由来するC切り捨てられたペプチドライブラリーを表す。N+C切り捨てられたペプチドライブラリーでは、NとC末端の両方からアミノ酸が除去される。N末端からの4アミノ酸の切り捨てとPAMP-12のC末端からの1残基の切り捨てはWNKWALSで生じる。アラニンスキャンに由来するペプチドライブラリーは、1つのアミノ酸をアラニンに置換し、ARKKWNKWALSRと同様に、N末端フェニルアラニンがアラニンに置き換えられる。フラ-2 AM色素は、MRGPRX2トランスフェクトHEK細胞1に対するペプチドの活性化電位を研究するために使用された。データは蛍光プレートリーダーに記録された。ペプチドリガンドが細胞を活性化した場合、340nm(F340)でポンピングされた蛍光は増加し、380nm波長(F380)でも同様に減少する(図1a)。しかし、ブランク(または非活性化ペプチドまたはHEK-WT対照)については、図2aに示すように、相対的な増加と減少はそれぞれ低いであろう。しかし、カルシウム濃度は、図1b、2bに示すようにF340/F380比で表される。比率F340/F380は、その場合の較正でカルシウム濃度を得るために、Grynkiewicz方程式でさらに置換することができます(図3)。表1に記載されたペプチドは、質量分析法(図4a)およびHPLC(図4b)を特徴とし、高純度であることが判明した。
| ペプチド技術 | 代表ペプチド |
| 親ペプチド | Ac-FRKKWNKWALSR-アミド |
| N-トランセレーション | アク-RKKWNKWALSR-アミド |
| C-トランセレーション | Ac-FRKKWNKWALS-アミド |
| N+C 切り捨て | Ac-WNKWALS-アミド |
| アラニンスキャン | アクアークドーンワルサー-アミド |
表1:N、CおよびN+C- 切り捨て、およびアラニンスキャン後に 生成される代表的なペプチド配列。ペプチドのN末端はアセチル修飾され、C末端にはアミド基が含まれていた。
図1:活性化ペプチドの代表的なデータ( a) 活性化ペプチドの蛍光シグナル。表されるデータは、PAMP-12 (FRKKWNKWALSR) に対応します。ペプチドは、矢印で示されるように、10回の読み取りサイクル(36s)に対するベースラインを生成した後に添加した。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ブランクの代表的データ( ) ブランクの蛍光シグナル。HTBは、矢印で示すように、10回の読み取りサイクル(36s)のベースラインを生成した後に追加された。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 染料校正の規格の代表的なデータ(a)ヨノマイシンは、矢印で示されるように、10番目の測定値で添加され、Ca+2結合状態で最大蛍光を得た。EGTAトリトンX-100は、最小の信号を得るために、矢印で示されるように、20の測定値の後に追加されました。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。これらの値は、細胞内カルシウム濃度を得るためにGrynkiewicz方程式にさらに入れられます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的ペプチドの特徴付けにより、配列および純度を確認する。(a)代表ペプチド配列WNKWALの理論質量は857.90Daであり、これは質量分析におけるm/z比で示された。(b) HPLCで確認したペプチドの純度99%。このペプチドは、N+C切り捨てられたペプチドライブラリーに属する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
カルシウムシグナル伝達は、マスト細胞脱顆粒の中心であり、受容体リガンド相互作用、リガンド同定、および創薬14の研究において広く用いられている。MRGPRX2は、かゆみ、喘息、アトピー性皮膚炎などの多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしていることが最近発見されたマスト細胞受容体である2。さらに、いくつかの承認された薬物は、MRGPRX2受容体15を介して炎症反応を引き出すことを示している。したがって、リガンドと受容体の相互作用を研究し、新しいリガンドを同定し、活性化メカニズムを理解することが不可欠です。本研究では、ペプチドライブラリーの設計(表1)およびMRGPRX2ベースのマスト細胞活性化の研究における一般的なペプチド技術の使用を示す。基礎となるカルシウム動員は、肥満細胞活性化の指標として用いた。
フラ2は、細胞内カルシウム濃度を測定するために使用されるカルシウム感受性色素です。アセトキシメチルエステル変異体(Fura-2 AM)は細胞膜の透過性を高め、細胞質カルシウム放出を定量する容易な方法を得る。この色素は、フローサイトメーター、顕微鏡、蛍光計9、16、17などの様々な特性評価技術で頻繁に使用されてきました。広く使用されていますが、色素に関連する課題があり、これらを効率的に採用する前に対処する必要があります。細胞内カルシウム結合は、色素の脱エステル化に依存しており、これは色素の負荷条件、細胞系、および細胞培養タイプに大きく依存します。部分的なエステル化は、不十分な蛍光シグナルをもたらす。さらに、不完全な脱エステル化は、細胞小器官への色素の局在化も生じ、不正確なデータをもたらす。細胞からの脱エステル染料の漏出は、Fura-210,11に直面する別の問題である。
染料の負荷とは別に、検出技術の使用も重要な役割を果たす。フローサイトメーターがUVレーザーで動作できないことは、色素9のためにそれらを好ましくない。同様に、蛍光イメージング技術は、顕微鏡操作における高度なトレーニングを必要とします。リガンド活性化時のカルシウム放出の一過性の性質は、波長の変化に迅速な応答を必要とし、したがって顕微鏡のシャッター速度を速くする必要があります。また、特殊な細胞イメージングチャンバを用い、カバーリップや定常画像集光を用いることは、大規模スクリーニング16にとって煩雑な技術となる。
メソッドの最適化にかなりの時間が投資されました。キュベットベースのフルオロメーターは、培養フラスコから脱着した後の細胞を、暗所で色素装入り培地でインキュベートし、次いで、試験のためにHTBバッファーに洗浄および再懸濁させた。HTBバッファーに懸濁した細胞をキュベットで採取し、光増倍数ベースのフルオロメーターを用いて読み取った。検出システムは一度に少数(2-4)キュベットしか保持できなかったため、ペプチドの大規模スクリーニングには適していなかった。また、HEK細胞は接着細胞であり、細胞懸濁読は実験の中で個々の繰り返しの中で大きな変動を示した。その結果、蛍光イメージング技術が使用され、これは再び退屈で遅いことが判明した。高速波長変化能力、顕微鏡特異的な細胞室、および優れたイメージング技術を備えた高度な顕微鏡の要件は、研究を妨げた。また、 その中でのペプチド シミュレーションは時間が広範囲に及び、重要なデータの損失をもたらしました。非効率的な細胞処理技術は、読み取り中に細胞浮揚をもたらし、焦点を合わせるのが困難になり、一貫性のない結果を与えました。
実験中に化合物を分配できる自動ピペットシステムを備えた蛍光プレートリーダーシステムを使用した。多くのサンプルが96ウェルプレートで立て続けに読み取られるという事実は、この技術の付加的な利点である。結果は、細胞が懸濁物と比較して結合されたときに測定値がより一貫していることを示した。TC処理96ウェルプレートで1日に成長した40,000個の細胞/ウェルの細胞数は、最良の結果を与えました。37°Cインキュベーターで30〜40分間の色素インキュベート時間が最適であった。しかし、実験を繰り返して実験を行った場合、異なるカラムの対応する井戸の変動が観察された。これを克服するために、プレートの各列に対して正(PAMP-12)と負のコントロール(ブランク)を使用した。これにより、より一貫性があり、再現性の高いデータが得られます。ここで説明する方法は、簡明かつ汎用性の高い方法であり、大規模なカルシウムベースのスクリーニングに効率的に採用することができる。しかし、データの品質を決定するいくつかの要因があるため、メソッドは特定のセルインストルメントシステムに最適化する必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
SRとLDUは、アルバータ州のイノベーションズ戦略研究プロジェクト、NRC、NSERCディスカバリーの助成金を認め、このプロジェクトに対して認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
