Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Screening peptider, der aktiverer MRGPRX2 ved hjælp af manipulerede HEK-celler

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62448

Summary

Teknikker til generering af et bibliotek af korte peptider, der kan aktivere mastceller via MRGPRX2-receptoren, beskrives. Tilknyttede teknikker er nemme, billige, og kan udvides til andre celle receptorer.

Abstract

Identifikation ligands specifikke for terapeutisk signifikante celle receptorer er afgørende for mange anvendelser, herunder design og udvikling af nye terapeutiske midler. Mas relaterede G-protein receptor-X2 (MRGPRX2) er en vigtig receptor, der regulerer mast celle aktivering og dermed leder den generelle immunrespons. Talrige ligands for MRGPRX2 er blevet identificeret og omfatter endogene peptider som PAMPs, defensiner, LL-37 og andre proteinfragmenter (dvs. nedbrudte albumin). Yderligere identifikation af MRGPRX2 specifikke ligands kræver screening af et stort antal peptider (dvs. peptid bibliotek); mastceller er imidlertid vanskelige og dyre at vedligeholde in vitro og derfor ikke økonomisk at bruge til screening af et stort antal molekyler. Nærværende papir demonstrerer en metode til at designe, udvikle og screene et bibliotek af små peptidmolekyler ved hjælp af MRGPRX2, der udtrykker HEK-celler. Denne cellelinje er relativt nem og billig at vedligeholde og kan bruges til in vitro high-throughput analyse. En calcium følsomme Fura-2 fluorescerende farvestof til at markere intracellulære calcium flux ved aktivering blev brugt til at overvåge aktiveringen. Forholdet mellem fluorescensintensiteten i Fura-2 ved 510 nm mod excitationsbølgelængder på 340 og 380 nm blev anvendt til at beregne calciumkoncentrationen. Peptid biblioteket bruges til at kontrollere dette system var baseret på den endogene proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, som er kendt for at binde MRGPRX2 med høj specificitet og affinitet. Efterfølgende peptider blev genereret gennem aminosyre afkortning og alanin scanning teknikker anvendes til PAMP-12. Den metode, der er beskrevet her, er enkel og billig, men robust til screening af et stort bibliotek af forbindelser til at identificere bindende domæner og andre vigtige parametre, der spiller en vigtig rolle i receptoraktivering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mastceller er en integreret del af immunsystemet og spiller en afgørende rolle i både medfødte og adaptive immunresponser. Mastceller aktiveres primært enten ved binding af et antigen til immunoglobulin E (IgE) - FcεRI receptorkomplekset eller ved den nyligt opdagede masrelaterede G-protein receptor-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2 aktivering har været forbundet med flere immun-og inflammatoriske sygdomme, og dermed er det vigtigt at forstå den bindende mekanisme af receptoren til sine ligands2. For at gøre dette blev et bibliotek med små peptidmolekyler udviklet og screenet mod MRGPRX2-receptorer, der var overekspresserede i HEK-celler. I undersøgelsen blev peptid biblioteket bygget ved hjælp af de enkle og alsidige teknikker alanin scanning og aminosyre afkortning. Alanin scanning indebærer udskiftning af specifikke aminosyrer med en alanin rest. Alanin er lille og neutral, strimler peptid af de specifikke egenskaber, som de erstattede rester og fortløbende fremhæver betydningen af de respektive fysiokemiske egenskaber af aminosyren i receptor interaktioner. Tværtimod, i aminosyre afkortning, peptid sekvenser er designet sådan, at det mangler en eller flere aminosyre rester fra N-terminal, C terminal, eller begge dele. Dette sæt peptider blev brugt til at identificere aminosyre sekvenser afgørende for MRGPRX2 bindende.

Erfaring med menneskelige mastceller linjer (LAD-2) har vist, at disse celler er vanskelige at kultur og vedligeholde in vitro: en fordobling tid på to uger, dyre medium kosttilskud, og direkte opmærksomhed kræves under passaging3. Disse egenskaber gør cellerne uegnede til storstilet screening af potentielle ligander. Heri blev stabelt transfected HEK-celler, der udtrykker MRGPRX2-receptor (HEK-X2), brugt til at screene peptidbiblioteket1. HEK-293 celler er meget udbredt og undersøgt for heterologe udtryk for overflade receptorer på grund af deres høje transfection effektivitet, hurtigere fordobling sats, og behovet for ikke-dyre mellemstore kosttilskud, der skal dyrkes i laboratoriet4. Protokollen til transfect HEK-293 cellelinje er blevet demonstreret og er veletableret5. HEK-293 celler, der stabilt udtrykte MRGPRX2-receptor (passage 13-19), blev aktiveret med peptider genereret gennem N-afkortning, C-afkortning, N + C-afkortning og alaninscanning1. Wild type HEK celler (HEK-WT) (passage 16-21) blev brugt som kontrol. Intracellulær calciumfrigivelse ved aktivering blev overvåget for at studere den MRGPRX2-baserede aktivering.

Celleaktivering af MRGPRX2 efterfølges af en cytosolær calciummobilisering. Denne regulerede intracellulære calciumfrigivelse i mastceller reguleres af den lagerdrevne calciumindføring (SOCE), koordineret af stromal interaktionsmolekylet 1 (STIM1); og er central for immunrespons kaskade6,7. Forskellige metoder er blevet anvendt til at påvise intracellulær calciumkoncentration, herunder patch-klemmer og fluorescerende farvestoffer8. Af alle de tilgængelige teknikker anvendes fluorometriske calciumfarvestoffer i bøjning med forskellige detektionsteknikker i vid udstrækning9. To typer af fluorometriske farvestoffer, der har fået interesser er nemlig, enkelt bølgelængde farvestoffer som Fluo-4, og dobbelt bølgelængde ratiometriske farvestoffer som Indo -1 og Fura-2. Fordelen ved, at dobbelt bølgelængde ratiometriske farvestoffer bringe over enkelt bølgelængde farvestoffer er, at forholdetmetriske farvestoffer korrekt for eksperimentelle fejl som farvestof lastning, foto blegning, og med fokus10,11.

Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) er en celle gennemsyrende, grøn-fluorescerende farvestof, hvis excitation skifter til en lavere bølgelængde ved calcium-bindende. Eksperimentelt er Fura-2 begejstret ved 340 og 380 nm, mens emissionen registreres ved 510 nm. Ved calciumbinding øges fluorescerende intensitet ved 340 nm, mens den på 380 nm falder, som vist i figur 1. Data er repræsenteret som et forhold mellem fluorescensintensitet efter excitation ved 340 nm (F340) og intensiteten efter excitation ved 380 nm (F380), dvs. F340/F380. F340/F380-forholdet er proportionalt med intracellulært calcium, hvis værdi kan beregnes ved Grynkiewicz-ligningen12. Da fluorescenssignalet opnås ved udskillelse af farvestoffet ved to bølgelængder (340 nm og 380 nm), korrigerer forholdet mellem fluorescenssignalerne for eksperimentelle faktorer som farvebelastning, farvelækage, fotobleaching og celletæthed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Design og udvikling af peptid bibliotek

  1. For at identificere liganderne i mastcellen MRGPRX2 receptor baseret på en kendt ligand, dvs. PAMP-1213, skal du følge nedenstående trin.
    1. Generer N-afkortet peptid bibliotek ved at afkorte N-terminal aminosyre rester af ligand, i træk, ved fast fase peptid syntese (SPPS).
    2. Generer C-afkortet peptid bibliotek ved afkortning af C-terminal aminosyre rester af den kendte ligand, i træk, af SPPS.
    3. Baseret på resultaterne af 1.1.1 og 1.1.2 genereres et N+C-afkortet peptidbibliotek ved hjælp af SPPS ved at afkorte de ønskede rester fra henholdsvis N- og C-terminalen.
    4. Brug solid-fase peptid syntese til at syntetisere peptider13.
    5. Rediger N-terminalen til acetyl (Ac) og C-terminalen til amide-gruppen.
    6. Karakterisere peptid for sin renhed ved hjælp af højtryksvæskekromatografi (HPLC) og til massen ved hjælp af et massespektrofotometer.
  2. For at studere betydningen af specifikke aminosyrer i moderselskabet PAMP-12 molekyle, følg nedenstående trin.
    1. Generer en alanin scanning peptid bibliotek ved at erstatte de respektive aminosyre rester i peptid molekyle med alanin, en ad gangen ved hjælp af SPPS. Rediger N-terminalen til acetyl (Ac) og C-terminalen til amide-gruppen.
    2. Karakterisere peptid for sin renhed ved hjælp af højtryksvæskekromatografi (HPLC) og til massen ved hjælp af et massespektrofotometer.
      BEMÆRK: Sørg for, at de syntetiserede peptider er af høj renhed. Karakterisere peptider ved hjælp af massespektroskopi og HPLC.

2. In vitro cellekultur

  1. Kultur HEK-X2 og HEK-WT celler ved at følge nedenstående trin.
    1. Tilbered kulturmedium ved at supplere høj glukose DMEM med 10% fosterkvægsserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.
    2. Passage cellerne i vævskultur (TC) behandlet T-75 kultur kolber og vokse i en inkubator ved 37 °C, der indeholder 5% CO2, indtil de er 75-80% sammenflydende.
    3. Når 75% sammenløb, vaske cellerne og tilsæt 2-3 mL trypsin i 2 - 3 min. Inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator for at løsne cellerne.
    4. Når cellerne har løsnet sig, indsamle cellerne i trypsin. Tilsæt 6-9 mL frisk medium.
    5. Centrifugere cellerne ved 1620 x g i 3-5 min.
    6. Efter centrifugering skal supernatanten kasseres for at opsamle pelleten. Resuspend cellerne i en frisk kultur medium. Fortynd cellerne i henhold til den ønskede koncentration.
      BEMÆRK: HEK-celler er hurtigt voksende celler og optimerer dermed cellemediet kosttilskud. HEK-celler er klæbende celler; passage dem i TC-behandlede kulturflasker for at understøtte vedhæftning.
  2. Forbered en 96 godt assay plade til eksperimentet.
    1. Der tilsættes 200 μL af celleaffjedringen i hver brønd med en koncentration på 200.000 celler/mL til frø af 40.000 celler/brønd.
    2. Cellerne dyrkes i 24 timer i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
      BEMÆRK: Optimer celletætheden pr. brønd baseret på pladestørrelsen og cellestammetypen. Udfør eksperimentet i triplikater i en sort TC-behandlet 96 brøndplade med flad gennemsigtig bund.

3. Fura-2 AM calcium assay

  1. Forbered farvestof ved at følge nedenstående trin.
    1. Brug Fura-2 AM farvestof til eksperimentet.
    2. Forbered HEPES-Tyrodes bufferbuffer (HTB), der indeholder 25 mM HEPES buffer, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL glukose, 1 mg/mL kvæg serum albumin (BSA) og frisk tilsat 1,8 mM CaCl2 i autoklave steriliseret vand.
    3. Der tilsættes 50 μL DMSO i 50 μg Fura-2 AM hætteglas for at forberede 1 mM lageropløsning af Fura-2 AM farvestof. Der tilsættes 1 μL på 1 mM Fura-2 AM farvestof pr. mL frisk medium til fremstilling af farvestofbelastningsmediet med en koncentration på 1 μM farvestof.
    4. Fjern 96 brøndpladen fra inkubatoren og kassér mediet. Udskift mediet med et friskt farvestofbelastningsmedium. Der tilsættes 200 μL farvestofbelastningsmedium i hver brønd. Inkuberes cellerne i 30-40 min i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    5. Efter 40 minutters inkubation fjernes mediet. Vask cellerne med HTB-bufferen. Der tilsættes 100 μL HTB-buffer til fluorescensaflæsning. Tag pladen til fluorescensaflæsning.
      BEMÆRK: Optimer koncentrationen af farvestof i farvestofbelastningsmediet. Dye lækage og photobleaching er mulige bekymringer forbundet med farvestoffet. Tilsæt CaCl2 frisk i HTB buffer for at undgå nedbør.

4. Celleaktivering og fluorescerende læsning

BEMÆRK: Fluorescenspladelæser med et automatiseret pipettersystem giver mulighed for automatisk overførsel af forbindelser fra en sammensat kilde til analysepladen uden at tage pladen ud af pladelæseren.

  1. Mens cellerne inkuberes, skal du indstille pladelæseren.
    1. Indstil temperaturen til 37 °C.
    2. Vælg Flexi Indstillinger.
    3. Indstil læsetilstand til fluorescens og læsning nederst.
    4. I Wavelengths, indstille antallet af Wavelengths til 2. Indstil excitationen til 340 nm og 380 nm. Indstil emissionen til 510 nm.
    5. Lad følsomheden være standard.
    6. Angiv intervallet til 3,9 s i Tidsindstilling. Indstil køretid til 94 s for at få 25 læser.
    7. Vælg derefter analysepladetypen.
    8. Vælg derefter de brønde, der skal læses.
    9. I Compound Transferskal du indstille Overførsler til 1 og Indledende volumen til 100 μL. Indstil pipettehøjden til 100 μL, Volumen til 50 μL og Tidpunkt til 36 s for at tilføje forbindelsen ved 10. læsning.
    10. Vælg derefter pladetypen Sammensat kilde.
    11. Lad Triturate ikke bruges.
    12. Vælg tipene i PipetteTiplayout .
    13. For sammensatte og spids kolonner, sikre, at de forbindelser, der skal overføres, er i kolonne 1 af den sammensatte plade. Indstil tipkolonnen til 1 og sammensat kolonne til 1.
    14. Lad autokalibrere være tændt.
    15. Klik på OK.
  2. Når temperaturen er nået op på 37 °C, skal pladerne ind i pladelæseren.
    1. Tryk på læsekammeret for at sætte assay plade i fluorescens Plade Reader.
    2. Tryk på kilden for at sætte compoundpladen. Tilbered den sammensatte plade ved at tilsætte 200 μL af de respektive peptider, ionomycin og ethylenglycol-bis(β-aminoethylethher)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)-Triton X-100 løsninger.
    3. Tryk på tipstativet for at sætte tipboksen. Brug en sort spids for at undgå spids autofluorescence.
    4. Når pladerne er indlæst, skal du gennemse indstillingerne for softwaren og trykke på Læs.

5. Dataanalyse

  1. Bestem calciumkoncentrationen fra fluorescensforholdet ved Grynkiewicz-ligningen -
    Equation 1
    hvor Kd er dissociationskonstanten i Fura-2 AM, R er emissionsforholdet efter excitation ved 340 nm og 380 nm (F340/F380) for respektive peptider, Rmax er det maksimale fluorescensforhold observeret ved tilsætning af 50 μL på 30 μM ionomycin, Rmin er den mindste fluorescens observeret ved tilsætning af 50 μL på 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100 og F380min og F380max er den absolutte fluorescensintensitet af Fura-2 AM i calciumfri og bundet tilstand.
    BEMÆRK: Maskinen dispenserer væsken med en vis kraft. Sæt ikke peptiddispenseringshøjden for tæt på bunden af pladen. det kan løsne cellerne. Brug sorte pipettespidser for at undgå autofluorescence. Læs den maksimale fluorescens og den mindste fluorescens for hver plade for hvert eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tabel 1 indeholder peptidsekvenserne, der genereres gennem terminal aminosyreafkortning og alaninscanning. Som vist i tabel 1mangler peptidsekvensen RKKWNKWALSR N-terminal phenylalanin (F) med hensyn til moderselskabet PAMP-12 og er derfor et repræsentativt peptid i N-afkortet bibliotek. Tilsvarende er PAMP-12 C-terminal serin i FRKKWNKWALS blevet fjernet, hvilket repræsenterer et C-afkortet peptidbibliotek, der stammer fra PAMP-12. I N+C-afkortet peptidbibliotek fjernes aminosyre fra både N og C-terminal. Afkortning af 4 aminosyre fra N-terminal og 1 rest fra C-terminal af PAMP-12 resulterer i WNKWALS. Peptid bibliotek stammer fra alanin scanning har en aminosyre erstattet med alanin, som med ARKKWNKWALSR, hvor N-terminal phenylalanin erstattes med alanin. Fura-2 AM farvestof blev brugt til at studere aktiveringspotentialet af peptider mod MRGPRX2 transfected HEK celler1. Dataene blev registreret på en fluorescenspladelæser. Hvis peptid ligand aktiveret cellen, fluorescens pumpes ved 340 nm (F340) stiger, mens det samme falder for 380 nm bølgelængde (F380) (Figur 1a). For en tom (eller for den sags skyld ikke-aktiverende peptid eller HEK-WT-kontrol) ville den relative stigning og reduktion dog være henholdsvis lav, som vist i figur 2a. Calciumkoncentrationen repræsenteres dog af F340/F380-forholdet som vist i figur 1b,2b. Forholdet F340/F380 kan yderligere erstattes i Grynkiewicz-ligningen for at få calciumkoncentrationen ved hjælp af in situ-kalibreringer (Figur 3). De peptider, der er anført i tabel 1, var karakteriseret ved massespektroskopi (figur 4a) og HPLC (figur 4b) og viste sig at være af høj renhed.

Peptid teknik Repræsentant Peptid
Forældre peptid Ac-FRKKWNKWALSR-Amide
N-afkortning Ac-RKKWNKWALSR-Amide
C-afkortning Ac-FRKKWNKWALS-Amide
N+C-afkortning Ac-WNKWALS-Amide
Alanine Scanning Ac-ARKKWNKWALSR-Amide

Tabel 1: Repræsentative peptidsekvenser genereret efter N, C og N+C - afkortning og alaninscanning. Peptidernes N-terminal blev acetyl modificeret, mens C-Terminal indeholdt en amidegruppe.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative data for et aktiverende peptid. (a) Fluorescenssignalerne for et aktiverende peptid. Repræsenterede data svarer til PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptid blev tilføjet efter at have genereret en baseline for 10 læsecyklusser (36 s), som vist af pilen. (b) Forholdet mellem fluorescensemissionen efter excitation ved 340 nm (F340) og fluorescensemissionen efter excitation ved 380 nm (F380) (F340/F380). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative data for det tomme. (a) Fluorescenssignalerne for blanken. HTB blev tilføjet efter at have genereret en baseline for 10 læsecyklusser (36 s), som vist af pilen. (b) Forholdet mellem fluorescensemissionen efter excitation ved 340 nm (F340) og fluorescensemissionen efter excitation ved 380 nm (F380) (F340/F380). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative data for standarderne for kalibrering af farvestoffer. (a) Ionomycin blev tilføjet ved 10th aflæsninger, som vist ved pilen, for at få maksimal fluorescens i Ca+2 bundet tilstand. EGTA-Triton X-100 blev tilføjet efter 20 aflæsninger, som vist af pilen, for at få et minimum signal. (b) Forholdet mellem fluorescensemissionen efter excitation ved 340 nm (F340) og fluorescensemissionen efter excitation ved 380 nm (F380) (F340/F380). Disse værdier er yderligere sat i Grynkiewicz ligning for at få den intracellulære calcium koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering af et repræsentativt peptid for at bekræfte sekvensen og renheden. (a) Den teoretiske masse af den repræsentative peptidsekvens WNKWAL var 857,90 Da, hvilket fremgår af m/z-forholdet i massespektroskopi. (b) Peptids renhed på 99 % som bekræftet af HPLC. Denne peptid tilhører N + C-afkortet peptid bibliotek. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Calcium signalering er central for mast celle degranulation og har været meget udbredt i studiet af receptor-ligand interaktioner, ligand identifikation, og drug discovery14. MRGPRX2 er en nyligt opdaget mast celle receptor, der har vist sig at spille en central rolle i mange inflammatoriske sygdomme som kløe, astma, og atopisk dermatitis, blandt andre2. Desuden har flere godkendte lægemidler vist sig at fremkalde et inflammatorisk respons gennem MRGPRX2-receptoren15. Det er derfor bydende nødvendigt at studere ligand-receptor interaktion, identificere nye ligands, og forstå aktiveringsmekanismen. Denne undersøgelse viser brugen af almindelige peptid teknikker i udformningen af en peptid bibliotek (tabel 1) og i at studere MRGPRX2 baseret mast celle aktivering. Den underliggende calciummobilisering blev anvendt som indikator for mastcelleaktivering.

Fura-2 er et calciumfølsomt farvestof, der anvendes til at måle intracellulær calciumkoncentration. Acetoxymethyl ester variant (Fura-2 AM) øger permeabiliteten af cellemembranen giver en nem metode til kvantificering af cytoplasmaiske calcium udgivelser. Farvestoffet har ofte været brugt med forskellige karakterisering teknikker som flow cytometer, mikroskopi, og fluorimeters9,16,17. Selvom det er meget udbredt, er der udfordringer forbundet med farvestoffet, som skal løses, før disse kan anvendes effektivt. Intracellulær calciumbinding er afhængig af afkalkning af farvestoffet, som i høj grad afhænger af farvebelastningsbetingelserne, cellesystemet og cellekulturtyperne. Delvis af-esterificering resulterer i utilstrækkelige fluorescenssignaler. Desuden resulterer ufuldstændig af-esterificering også i lokalisering af farvestof i celleorganellerne, hvilket resulterer i unøjagtige data. Lækage af de-esterified farvestof fra cellen er et andet problem konfronteret med Fura-210,11.

Bortset fra farvepålæsningen spiller brugen af detektionsteknikken også en vigtig rolle. Den manglende evne til flowcytometre til at fungere med UV-lasere gør dem ugunstige for farvestoffet9. Tilsvarende kræver fluorescerende billeddannelsesteknikker avanceret træning i mikroskopdrift. Den forbigående karakter af calcium frigivelse på ligand aktivering kræver en hurtig reaktion i ændringen i bølgelængder og dermed en hurtigere lukkertid af mikroskopet. Hertil kommer, at brugen af specialiserede cellebilleddannelse kamre, brug af coverslips og konstant billedfokusering gør det til en besværlig teknik til storstilet screening16.

Der blev investeret betydelig tid i metodeoptimeringen. Cuvettebaseret fluorometer, hvori celler efter løsrivelse fra kulturkolben blev inkuberet med det farvestofindlæste medium i mørket og derefter blev vasket og suspenderet igen i HTB-bufferen til undersøgelsen. Celler suspenderet i HTB buffer blev taget i en cuvette og blev læst ved hjælp af en fotomultiplier baseret fluorometer. Detektionssystemerne kunne kun rumme få (2-4) cuvettes ad gangen og var derfor ikke egnet til storstilet screening af peptider. Endvidere viste HEK-celler, der klæber celler, celleaffjedringsaflæsningen store variationer inden for individuelle gentagelser i et eksperiment. Derfor blev fluorescerende billeddannelsesteknik brugt, hvilket igen viste sig at være kedeligt og langsomt. Kravet om et avanceret mikroskop med hurtig bølgelængde skiftende kapacitet, mikroskop-specifikke cellekamre, og fremragende billeddannelse færdigheder hindret undersøgelsen. Derudover var in situ peptidsimulering tids omfattende og resulterede i tab af vigtige data. Ineffektiv cellebehandling teknik resulterede i celle flotationer under aflæsninger, som gjorde det vanskeligt at fokusere og gav inkonsekvente resultater.

En fluorescens pladelæser system med en automatiseret pipetter system, der kan dispensere forbindelser under eksperimenter blev brugt til undersøgelsen. Det faktum, at mange prøver læses hurtigt efter hinanden i en 96 brønd plade er en ekstra fordel ved denne teknik. Resultaterne viste, at aflæsningerne var mere konsekvente, når cellerne blev fastgjort i forhold til suspension. Celletal på 40.000 celler / brønd i en TC-behandlet 96 brøndplade dyrket for en dag gav de bedste resultater. En inkubationstid for farvestof på 30-40 min ved 37 °C inkubator var optimal. Men når eksperimenter blev udført med eksperimentelle gentagelser, blev variationer i de tilsvarende brønde af forskellige kolonner observeret. For at overvinde dette blev der anvendt en positiv (PAMP-12) og en negativ kontrol (Tom) for hver kolonne på pladen. Dette gav mere konsekvente og reproducerbare data. Den metode, der er beskrevet her, er en nem og alsidig metode, som effektivt kan anvendes til storskala calciumbaseret screening. Der er dog flere faktorer, der bestemmer kvaliteten af data, og dermed skal metoden optimeres til et givet celleinstrumentsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

SR og LDU vil gerne anerkende Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC og NSERC-Discovery tilskud til dette projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal - acetyl group
C terminal - amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519, (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9, (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355, (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10, (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11, (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105, (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10, (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13, (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8, (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269, (3), 212-220 (2018).
Screening peptider, der aktiverer MRGPRX2 ved hjælp af manipulerede HEK-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).More

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter